劉 燕， 王陳妮， 蘭 崴， 唐 巍△

(1.安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校中醫(yī)康復(fù)教研室，安徽 安慶 246052；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 合肥 230012)

腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要病理生理機(jī)制，大腦缺血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起大腦生物電功能調(diào)控異常，造成不可逆的神經(jīng)損傷，在恢復(fù)血供的同時(shí)還會(huì)引起更嚴(yán)重的腦組織損傷[1]。中醫(yī)針刺療法對(duì)缺血性腦卒中一直有良好的效果，得到國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可[2，3]。中醫(yī)認(rèn)為，該病治療當(dāng)以通督調(diào)神為原則，督脈循行于脊里，上絡(luò)于腦，與腦和脊髓關(guān)系密切。針刺治療時(shí)以督脈穴位為主，通督脈以調(diào)元神，輔以心包經(jīng)穴位，調(diào)整氣血運(yùn)行進(jìn)而達(dá)到調(diào)腦神的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，通督調(diào)神針刺可明顯促進(jìn)中風(fēng)患者的神經(jīng)功能恢復(fù)[4]，不過(guò)相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究較少，病理機(jī)制尚不明朗。既往文獻(xiàn)顯示，神經(jīng)損傷修復(fù)和再生與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)有關(guān)[5，6]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，從VEGF、NGF、MBP蛋白表達(dá)觀察通督調(diào)神針刺對(duì)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。本研究通過(guò)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)AHUCM-rats-2020006)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(240±15)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)前均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫22～24 ℃，濕度55%～65%，自然光照，普通飼料投喂，自由進(jìn)食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

一次性使用無(wú)菌針灸針(0.25 mm×40 mm)，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；丁苯酞氯化鈉注射液(規(guī)格100 mL:25 mg)，購(gòu)自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司。VEGF抗體試劑盒(Hzbscience，貨號(hào)HZ-VEGF-Ra)，購(gòu)自上海澤葉生物科技有限公司；NGF抗體試劑盒(百奧萊博，貨號(hào)ARB11095)，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司； MBP抗體試劑盒(TargetMol，貨號(hào)TP1092)，購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司；DYCP31DN聚丙烯酰胺凝膠電泳儀，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 模型制備

大鼠腦缺血再灌注損傷模型參考改良Koizumi線栓法，通過(guò)尼龍線阻斷大腦中動(dòng)脈，即可造成大鼠局灶性腦缺血[7]。具體制備方法：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，等待5～10 min觀察到大鼠腹式呼吸表明麻醉成功。將大鼠四肢綁在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，仰臥位，頸部備皮，碘伏消毒，切開(kāi)頸正中皮膚，鈍性分離頸部肌肉組織，暴露頸部血管，游離左側(cè)頸總動(dòng)脈，穿入尼龍線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉主動(dòng)脈，插入自制線栓至頸內(nèi)動(dòng)脈，插線深度約2 cm，遇到阻力即可。將缺血時(shí)間控制在2 h，抽出尼龍線線栓完成再灌注，將再灌注時(shí)間控制在24 h。假手術(shù)組除不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈外，麻醉、切開(kāi)皮膚等步驟同上。模型組、藥物組、針刺組均按此方法制備腦缺血再灌注大鼠模型。

1.4 分組及干預(yù)方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只大鼠分為假手術(shù)組、模型組、藥物組、針刺組4組各10只。假手術(shù)組與模型組不給予任何治療措施，正常喂養(yǎng)。藥物組再灌注24 h后，腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液10 mg/(kg·d)，每日1次，7 d為1個(gè)療程。針刺組再灌注24 h后，給予通督調(diào)神針刺，每日1次，7 d為1個(gè)療程。具體針刺部位與方法參照大鼠穴位圖譜[8]，針刺“風(fēng)池”“足三里”“曲池穴”“合谷穴”“三陰交”(見(jiàn)表1)。

表1 大鼠通督調(diào)神針刺穴位定位及針刺方法

1.5 神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(neurological severity scores，NSS)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)功能正常=0分，提起大鼠尾巴時(shí)左前肢屈曲(輕度缺損)=1分，大鼠行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度缺損)=2分，大鼠行走時(shí)向左側(cè)傾斜(重度缺損)=3分，大鼠不能自發(fā)行走、意識(shí)減退甚至喪失=4分，與缺血有關(guān)的死亡=5分[9]。模型制備后立即評(píng)分(治療前的評(píng)分)，1～3分表示腦缺血再灌注模型制備成功。各組大鼠在治療或喂養(yǎng)7 d后再次評(píng)分。

1.6 取材方法

NSS評(píng)分完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。每組取5只大鼠打開(kāi)胸腔暴露心臟，4%多聚乙醛灌注，斷頭摘取大腦缺血組織制作石蠟切片，用于常規(guī)病理HE染色與免疫組化SP染色。每組取另外5只大鼠麻醉后直接斷頭取腦，大腦缺血組織勻漿用于Western blot檢測(cè)。

1.7 免疫組化法檢測(cè)VEGF、NGF、MBP蛋白表達(dá)

石蠟切片經(jīng)500 mL抗原修復(fù)工作液處理后，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，晾干后滴加10%非免疫羊血清，孵育30 min。免疫組化SP染色：以磷酸鹽緩沖液作為陰性對(duì)照，切片加入VEGF、NGF、MBP一抗(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。再加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液50 μL，染色5 min，切片置于顯微鏡下觀察。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞被染成棕黃色為陽(yáng)性，計(jì)算每張切片的平均陽(yáng)性細(xì)胞百分比[10]。

1.8 Western blot法檢測(cè)VEGF、NGF、MBP蛋白表達(dá)

取大鼠腦缺血組織200 μg，加入適量蛋白裂解液勻漿離心后取上清，加入適量磷酸鹽緩沖液調(diào)整所有大鼠組織樣本為相同濃度。加入VEGF、NGF、MBP一抗工作液(1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜。再加入二抗工作液，37 ℃孵育30 min，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫色、曝光顯影。以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件測(cè)量目的蛋白相對(duì)灰度值。目的蛋白相對(duì)灰度值=目的蛋白/β-actin的灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后NSS評(píng)分比較

模型組、藥物組、針刺組大鼠治療前NSS評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。藥物組、針刺組大鼠治療后NSS評(píng)分均明顯低于治療前(P<0.05)。藥物組大鼠治療后NSS評(píng)分明顯低于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠治療后NSS評(píng)分明顯低于模型組和藥物組(P<0.05)(見(jiàn)圖1)。

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05；與治療前比較：△P<0.05圖1 各組大鼠治療前后神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(Neurological Severity Scores，NSS)

2.2 各組大鼠腦缺血組織HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠腦缺血組織細(xì)胞層次整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核被染成紫藍(lán)色，細(xì)胞核形態(tài)完整，細(xì)胞質(zhì)被染成紅色，胞漿豐富，染色均勻(圖2A)。模型組大鼠腦缺血組織細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞腫脹，可見(jiàn)大量壞死細(xì)胞，細(xì)胞核固縮，核仁模糊，細(xì)胞質(zhì)水腫，胞漿減少(圖2B)。藥物組大鼠腦缺血組織中正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞染色形態(tài)與模型組類(lèi)似，與模型組比較，壞死細(xì)胞數(shù)目較少，部分細(xì)胞完整(圖2C)。針刺組大鼠腦缺血組織中正常形態(tài)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞染色形態(tài)與模型組類(lèi)似，與模型組比較，壞死細(xì)胞數(shù)目較少，出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞與膠原纖維增生(圖2D)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組圖2 各組大鼠腦缺血組織HE染色比較(×100)

2.3 各組大鼠腦缺血組織VEGF表達(dá)比較

根據(jù)免疫組化染色測(cè)定VEGF表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以及Western blot法測(cè)定VEGF表達(dá)的相對(duì)灰度值，結(jié)果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的VEGF表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中VEGF表達(dá)高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中的VEGF表達(dá)高于模型組和藥物組(P<0.05)(見(jiàn)圖3、4)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖3 各組大鼠腦缺血組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫組化SP染色比較(×400)

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖4 各組大鼠腦缺血組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)Western blot條帶比較

2.4 各組大鼠腦缺血組織NGF表達(dá)比較

根據(jù)免疫組化染色測(cè)定NGF表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以及Western blot法測(cè)定NGF表達(dá)的相對(duì)灰度值，結(jié)果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的NGF表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中的NGF表達(dá)高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中的NGF表達(dá)高于模型組和藥物組(P<0.05)(見(jiàn)圖5、6)。

2.5 各組大鼠腦缺血組織MBP表達(dá)比較

根據(jù)免疫組化染色測(cè)定MBP的陽(yáng)性細(xì)胞百分比以及Western blot法測(cè)定MBP表達(dá)的相對(duì)灰度值，結(jié)果顯示，模型組大鼠腦缺血組織中的MBP表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05)，藥物組大鼠腦缺血組織中的MBP表達(dá)高于模型組(P<0.05)，針刺組大鼠腦缺血組織中MBP表達(dá)高于模型組和藥物組(P<0.05)(見(jiàn)圖7、8)。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藥物組；D.針刺組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖7 各組大鼠腦缺血組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)的免疫組化SP染色比較(×400)

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：▲P<0.05；與藥物組比較：#P<0.05圖8 各組大鼠腦缺血組織髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)Western blot條帶比較

3 討論

腦缺血疾病屬于中風(fēng)范疇，中醫(yī)認(rèn)為大腦功能與五臟關(guān)系密切，心主神明，腦為髓海。中風(fēng)的病機(jī)經(jīng)絡(luò)辨證為督脈氣衰、陽(yáng)氣不振，督脈痹阻則氣血滯留，血液運(yùn)行不暢[11]。督脈為陽(yáng)脈之海，總督諸陽(yáng)，因此通督脈以調(diào)元神可達(dá)陰平陽(yáng)秘、形神協(xié)調(diào)之功，輔以心包經(jīng)穴位，進(jìn)一步疏通經(jīng)絡(luò)、醒腦開(kāi)竅。本實(shí)驗(yàn)選擇的通督調(diào)神針刺包含風(fēng)池、足三里、曲池、合谷、三陰交5處穴位，風(fēng)池主中風(fēng)偏枯、少陽(yáng)頭痛，乃風(fēng)邪蓄積之所；曲池調(diào)和氣血、疏經(jīng)通絡(luò)，主治半身不遂；合谷屬陽(yáng)主表，宣通氣血；合谷升而能散；曲池走而不守；足三里調(diào)理肝脾，補(bǔ)益氣血；三陰交健脾和胃、調(diào)補(bǔ)肝腎、疏經(jīng)通絡(luò)。有研究報(bào)道，通督調(diào)神針刺治療能有效改善患者腦組織低灌注區(qū)的腦血流量，疏經(jīng)通絡(luò)，調(diào)和氣血[12，13]。上述經(jīng)絡(luò)理論與腦缺血疾病的病理生理基礎(chǔ)相互聯(lián)系，可為針刺治療提供理論基礎(chǔ)。

腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的重要原因，其生物學(xué)機(jī)制可能與神經(jīng)干細(xì)胞自由基增加、脂質(zhì)過(guò)氧化、興奮性氨基酸毒性等有關(guān)[14，15]。腦缺血發(fā)生后，大腦血氧供給不足，神經(jīng)細(xì)胞代謝的廢物堆積，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、氧自由基等，直接損傷神經(jīng)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠實(shí)施通督調(diào)神針刺，結(jié)果顯示針刺組大鼠治療后NSS評(píng)分較治療前明顯降低，且低于模型組和藥物組，說(shuō)明通督調(diào)神針刺能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，減輕腦缺血再灌注損傷。與谷詩(shī)濃等[16]報(bào)道的通督調(diào)神針?lè)筛纳颇X缺血再灌注損傷大鼠腦梗死范圍，減少腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)功能的研究結(jié)果一致。另外，藥物組大鼠給予丁苯酞氯化鈉注射液為陽(yáng)性對(duì)照。國(guó)外研究顯示，丁苯酞可治療缺血性腦卒中，改善患者中樞神經(jīng)功能損傷，具有較強(qiáng)的抗腦血栓作用，還能減輕腦水腫，改善缺血腦區(qū)的微循環(huán)，調(diào)節(jié)腦血流量、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，促進(jìn)患者神經(jīng)功能損害的恢復(fù)[17，18]。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，丁苯酞氯化鈉注射液能明顯縮小大鼠的腦缺血病灶，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19]。目前認(rèn)為丁苯酞的藥理機(jī)制為靶向抑制環(huán)氧化酶，降低花生四烯酸水平，減少前列腺素的合成，減輕腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷，提高血管內(nèi)皮功能，維持血腦屏障的穩(wěn)態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組VEGF與NGF表達(dá)較假手術(shù)組升高，且治療后藥物組與針刺組VEGF與NGF表達(dá)升高更顯著。分析其原因可能VEGF是血管生成的重要誘導(dǎo)因子，VEGF的表達(dá)與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)，受到一氧化氮等因子調(diào)控。既往研究報(bào)道，腦缺血缺氧會(huì)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，VEGF增加促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)[20，21]，與本研究結(jié)果中模型組VEGF表達(dá)升高一致。治療后藥物組與針刺組VEGF升高更顯著，可能是因?yàn)閂EGF屬于血管生成誘導(dǎo)因子，在藥物或者針刺的治療下，VEGF升高能夠發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)作用。NGF為促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、修復(fù)的重要因子。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組NGF表達(dá)上調(diào)，可能與發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞損傷時(shí)，NGF表達(dá)可負(fù)反饋性上升有關(guān)，NGF通過(guò)抑制毒性氨基酸、氧自由基釋放，減少細(xì)胞凋亡，從而阻止腦缺血再灌注損傷，減輕繼發(fā)的病理?yè)p害[22]。治療后藥物組、針刺組的NGF表達(dá)均明顯增加，提高了神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)的速度，促進(jìn)了神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝。Chang等[23]研究探討針刺對(duì)神經(jīng)再生的作用，也發(fā)現(xiàn)針刺能夠上調(diào)NGF等多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子水平，促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生作用，增加腦血流量，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，減輕谷氨酸興奮毒性，維持血腦屏障完整性，抑制細(xì)胞凋亡。MBP是神經(jīng)少突細(xì)胞和施萬(wàn)細(xì)胞分泌的髓鞘蛋白質(zhì)，主要功能為保護(hù)髓鞘，維持髓鞘功能穩(wěn)定，在正常神經(jīng)細(xì)胞中MBP表達(dá)較高，而當(dāng)發(fā)生腦損傷后MBP表達(dá)下降[24]，這可以解釋本研究中模型組大鼠MBP表達(dá)降低，模型組MBP水平變化與VEGF、NGF的變化不一致，可能與VEGF、NGF是促進(jìn)血管或神經(jīng)生成的誘導(dǎo)因子，而MBP屬于髓鞘蛋白質(zhì)，其本身是神經(jīng)細(xì)胞軸突結(jié)構(gòu)之一有關(guān)。經(jīng)過(guò)治療，藥物組、針刺組的MBP表達(dá)相比模型組有一定提高，但仍低于假手術(shù)組，說(shuō)明通督調(diào)神針刺能夠上調(diào)MBP表達(dá)，促進(jìn)腦缺血區(qū)的神經(jīng)髓鞘組織再生。Meta分析也發(fā)現(xiàn)，督脈針刺可以通過(guò)調(diào)控MBP的表達(dá)誘導(dǎo)神經(jīng)再生，從而起到治療缺血性腦病的作用[25]。

綜上所述，通督調(diào)神針刺能夠明顯改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能，具體機(jī)制可能與針刺上調(diào)VEGF、NGF、MBP表達(dá)進(jìn)而營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)神經(jīng)髓鞘組織再生有關(guān)。