鄭樹壕, 司玉曉, 閆 祺, 郭慧芳, 董雙林,*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095;2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 南京 210014)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，具有很強(qiáng)的遷飛擴(kuò)散能力，但長期以來局限于在美國、墨西哥、巴西等中美洲地區(qū)發(fā)生和危害(Pashleyetal., 1985; Pashley and Martin, 1987; Andrews, 1988; Cruzetal., 1999)。直到2016年，草地貪夜蛾在非洲被發(fā)現(xiàn)，并很快蔓延到歐洲和亞洲(Goergenetal., 2016; Feldmannetal., 2019)；在我國，2018年12月首次在云南發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾，次年即擴(kuò)散到許多其他省份(吳秋琳等, 2019)。草地貪夜蛾屬多食性害蟲，主要為害禾本科的玉米和水稻，2017年在非洲玉米主產(chǎn)地造成53%的損失(Dayetal., 2017)，2019年云南靖江市由于草地貪夜蛾入侵造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)2 900萬元(張瓊等, 2020)。根據(jù)寄主喜好性，草地貪夜蛾分為玉米型和水稻型(Pashleyetal., 1985; Pashley and Martin, 1987)，兩者在形態(tài)上高度相似，通常以細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase I, COI)和磷酸甘油醛異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase, Tpi)基因序列來區(qū)分(Meagher and Gallo-Meagher, 2003; Nagoshi, 2010)。我國發(fā)生的草地貪夜蛾為玉米型，但摻雜少量水稻型的基因型(陳冬平等, 2020; 王亞如等, 2020)，尚未有在田間大面積危害水稻的報(bào)道。對草地貪夜蛾發(fā)生區(qū)域和發(fā)生量的嚴(yán)密監(jiān)測意義重大。

性信息素用于害蟲監(jiān)測和測報(bào)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效方便等優(yōu)點(diǎn)，并已在草地貪夜蛾得到應(yīng)用，但突出問題是誘芯的種特異性不高。生產(chǎn)上常用的二元或三元組分誘芯常常誘捕到相當(dāng)比例的勞氏粘蟲Leucanialoreyi(Meagheretal., 2019; 沈嘉彬等, 2019)，給準(zhǔn)確計(jì)數(shù)草地貪夜蛾蟲量進(jìn)而測報(bào)其種群動態(tài)帶來困難。有關(guān)草地貪夜蛾性信息素的組成，迄今已從雌蛾性信息素腺體中鑒定到13種組分，但不同地理種群間有所差異(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Batista-Pereiraetal., 2006; 江南紀(jì)和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)。在這些組分中，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac被普遍證實(shí)有田間雄蛾引誘活性(Tumlinsonetal., 1986)，Z11-16∶Ac在美國賓夕法尼亞州地理種群中具有活性(Fleischeretal., 2005)，生產(chǎn)上應(yīng)用的誘芯主要由這些組分配制而成。值得注意的是，勞氏粘蟲等幾種粘蟲外形和草地貪夜蛾相近，且性信息素組分高度重合，除共享Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac這2種主要行為活性組分外，12∶Ac等4種組分也在兩種雌蛾腺體中并存(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Hoetal., 2002; 江南紀(jì)和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)。自然條件下，推測兩種害蟲依靠各自特有組分來達(dá)到性信息素通訊系統(tǒng)間的隔離。

氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)在昆蟲性信息素等氣味分子的識別和感受中起重要作用。OBP是一類水溶性小分子蛋白，高濃度存在于昆蟲嗅覺感器的感器液腔中，負(fù)責(zé)識別并運(yùn)輸氣味分子穿越感器液腔到嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體(odorant receptor, OR)部位，此處氣味分子被釋放后單獨(dú)或以氣味分子-OBP復(fù)合體的形式激活OR(Leal, 2013)。在鱗翅目昆蟲中，OBP分為普通氣味結(jié)合蛋白(general odorant binding protein, GOBP)、信息素結(jié)合蛋白(pheromone binding protein, PBP)和觸角結(jié)合蛋白(antennal binding protein, ABP)(Vogtetal., 1991, 1999)。其中，PBP在性信息素敏感的感器中表達(dá)，負(fù)責(zé)對性信息素分子的結(jié)合和運(yùn)輸，具有很高的配體親和力和特異性(Vogt and Riddiford, 1981)，與性信息素通訊系統(tǒng)的高度靈敏性和種特異性相一致。研究PBP對草地貪夜蛾及同域近緣種勞氏粘蟲性信息素組分的結(jié)合能力，將有助于了解兩種昆蟲在性信息素通訊系統(tǒng)水平上的隔離機(jī)制，也可為種特異性誘芯的開發(fā)提供依據(jù)。草地貪夜蛾具有4個PBP基因，其中3個在觸角中表達(dá)，暗示其在性信息素感受中起作用(劉蘇等, 2020)。本研究針對這3個觸角中表達(dá)的PBP基因，通過體外重組表達(dá)并純化后，測定了PBP蛋白對草地貪夜蛾及勞氏粘蟲性信息素及腺體組分的親和力，以期為明確兩種昆蟲性信息素通訊間的隔離機(jī)制及開發(fā)種特異性的性信息素誘芯提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)與組織收取

草地貪夜蛾幼蟲于2019年7月采集自江蘇東臺玉米田(32°45′N, 120°23′E)，在室內(nèi)利用甜菜夜蛾Spodopteraexigua人工飼料(黃春霞等, 2002)進(jìn)行繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為27±1℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。成蟲飼喂10%蜂蜜水。收取3日齡雄蟲觸角50對，重復(fù)3次，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和cDNA第1鏈的合成

使用Trizol Reagent (Invitrogen, 美國)提取總RNA。 RNA的質(zhì)量和濃度由NanoDrop2000(Thermo Scientific, 美國)檢測，OD260/OD280比值均為1.8～2.0。根據(jù)試劑盒說明書，使用HiScript?III RT SuperMix (諾唯贊, 南京)從1 μg總RNA中合成cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PBP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI上草地貪夜蛾P(guān)BP1, PBP2和PBP3的cDNA序列(GenBank登錄號分別為MN541407, MN541408和MN541409)，去除信號肽編碼序列后設(shè)計(jì)上下游引物，用于PBP基因的克?。蝗コ盘栯男蛄泻?，設(shè)計(jì)包含BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的同源重組引物(表1)，用于基因的原核表達(dá)。引物由南京金斯瑞公司合成。

表1 引物信息

以成蟲觸角cDNA為模板，采用高保真性DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix(諾唯贊，南京)按照說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL): 2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性15 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸40 s, 35個循環(huán); 72℃總延伸5 min。使用1.2%凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并使用Axyprep DNA凝膠回收試劑盒(康寧生命科學(xué)，蘇州)進(jìn)行膠回收。PCR產(chǎn)物回收后連接到pEASY-Blunt3載體(全式金，北京)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliTrans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金，北京)中，提取質(zhì)粒DNA并測序驗(yàn)證。將含有目的基因片段的重組質(zhì)粒DNA和pET-30a(+)質(zhì)粒(Novagen，德國)DNA分別進(jìn)行雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)(Fermentas，加拿大)，然后將目的片段連接到pET-30a(+)載體，再轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。用含卡那霉素的LB平板進(jìn)行篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。

1.4 PBP的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

PBP的誘導(dǎo)表達(dá)與純化參考已報(bào)道的方法(Zhangetal., 2021)。將1.3節(jié)經(jīng)測序驗(yàn)證后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，接種于LB 培養(yǎng)基后培養(yǎng)至 OD600= 0.6～0.8 后加入 IPTG(終濃度為1 mmol/L)進(jìn)行PBP誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)后菌液經(jīng)超聲波破碎并用SDS-PAGE檢測。將含有包涵體蛋白的溶液通過Ni-NTA瓊脂糖磁珠(Ni磁珠)(金斯瑞，南京)進(jìn)行純化，得到帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。為防止His標(biāo)簽對熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，使用腸激酶(金斯瑞，南京)在22℃條件下反應(yīng)10～14 h切除His標(biāo)簽。

1.5 熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

共測試14種氣味物質(zhì)，均為草地貪夜蛾或勞氏粘蟲性信息素腺體浸提液組分，其中E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac,Z10-14∶Ac,Z11-14∶Ac,Z9-14∶Ald和Z11-16∶Ald為草地貪夜蛾特有組分，Z7-14∶Ac為勞氏粘蟲特有組分，其他為共有組分(Sekul and Sparks, 1967; Tumlinsonetal., 1986; Descoinsetal., 1988; Hoetal., 2002; 江南紀(jì)和王琛柱, 2019; Jiangetal., 2021)(表2)。這14種氣味物質(zhì)中，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac已證實(shí)對兩種害蟲具有田間雄蛾引誘活性(Tumlinsonetal., 1986)，因此是性信息素組分；其他組分在田間誘捕試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的雄蛾引誘活性，本文中稱為“腺體組分”，但不排除其中的某些組分可能在近距離內(nèi)促進(jìn)兩性間交配而起到性信息素的作用。本研究所使用的14種氣味物質(zhì)中，Z11-14∶Ac和16∶Ac購自沈陽北欣貿(mào)易有限公司，另外12種氣味物質(zhì)均購自常州寧錄生物科技有限公司。熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定方法同實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道(Liuetal., 2012; 魏丹等, 2013)。首先檢測PBP 蛋白對熒光探針1-NPN的結(jié)合能力。將PBP重組蛋白溶液加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中，總體系為250 μL，使蛋白的終濃度為2 μmol/L，按2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18和20 μmol/L的終濃度梯度加入1-NPN(濃度為0.5 mmol/L)，每次反應(yīng)2 min，在337 nm激發(fā)，記錄熒光強(qiáng)度，計(jì)算蛋白與1-NPN的結(jié)合常數(shù)Ki, 然后利用競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定氣味物質(zhì)和PBP重組蛋白的結(jié)合能力。在競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)中, PBP重組蛋白和1-NPN的濃度均為2 μmol/L，反應(yīng)時間為2 min，在337 nm激發(fā)，記錄熒光值(初始熒光值)，然后被測氣味物質(zhì)(濃度0.05 mmol/L)按0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.6, 2.0, 2.4, 2.8, 3.2, 3.6和4.0 μmol/L的終濃度梯度加入到PBP重組蛋白與熒光探針的混合溶液中，反應(yīng)2 min后記錄熒光值。實(shí)驗(yàn)在25℃條件下進(jìn)行。利用公式Ki=IC50/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計(jì)算各氣味物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，其中[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度，K1-NPN為1-NPN與PBP的結(jié)合常數(shù)。利用GraphPad Prism 6.0軟件分析PBP與1-NPN的結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

為敘述方便，本文將PBP和氣味物質(zhì)間結(jié)合能力按Ki<1.00 μmol/L, 1.004.00 μmol/L分別定義為強(qiáng)、中、無明顯結(jié)合能力。

2 結(jié)果

2.1 草地貪夜蛾3個SfruPBPs的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)10 h后，收集菌液離心得到菌體后進(jìn)行超聲波破碎，破碎液離心后經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，在上清中很少。對帶有His標(biāo)簽的目的蛋白進(jìn)行純化，大小為21 kD左右。為防止His標(biāo)簽對實(shí)驗(yàn)造成的影響，對融合蛋白進(jìn)行腸激酶酶切，去除His標(biāo)簽。去除標(biāo)簽后3個SfruPBPs大小均在16 kD左右，與預(yù)測的3個SfruPBPs的分子量一致(圖1)。

圖1 草地貪夜蛾3個SfruPBPs重組蛋白的表達(dá)與純化

2.2 草地貪夜蛾3個SfruPBPs與不同氣味物質(zhì)的結(jié)合能力

結(jié)果表明，3個SfruPBPs溶液的熒光值隨1-NPN濃度的增加而增加并趨于飽和；SfruPBP1, SfruPBP2和SfruPBP3與1-NPN的結(jié)合常數(shù)(K1-NPN)分別為4.61±1.0, 9.05±1.1和3.72±0.7 μmol/L(圖2)。因此，1-NPN可以作為探針用于后續(xù)的競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

圖2 3個SfruPBPs重組蛋白與1-NPN的結(jié)合曲線

利用熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定了3個SfruPBPs對14種氣味物質(zhì)的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)3個SfruPBPs對氣味物質(zhì)的結(jié)合譜明顯不同。SfruPBP1僅對草地貪夜蛾性信息素主組分Z9-14∶Ac結(jié)合并具有強(qiáng)結(jié)合能力(Ki=0.80 μmol/L)；SfruPBP3則僅對腺體組分Z9-12∶Ac具有中等結(jié)合能力(Ki=1.36 μmol/L)；而SfruPBP2對包括性信息素次要組分Z7-12∶Ac在內(nèi)的7種組分具有結(jié)合能力，其中對Z7-12∶Ac, 12∶Ac,E7-12∶Ac和Z10-14∶Ac具有強(qiáng)結(jié)合能力(Ki<1.00 μmol/L)，對Z9-14∶Ac,Z9-12∶Ac和11-12∶Ac有中等結(jié)合能力(1.00 μmol/L

3 討論

本研究測定了草地貪夜蛾3個SfruPBPs對草地貪夜蛾及勞氏粘蟲性信息素或性信息素腺體組分共14種氣味物質(zhì)的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾3個SfruPBPs均可結(jié)合本種的性信息素或腺體組分，但不同PBP的配體譜明顯不同；此外，3個SfruPBPs對勞氏粘蟲腺體特有組分Z7-14∶Ac均無明顯結(jié)合能力(圖3; 表2)。研究結(jié)果為進(jìn)一步明確草地貪夜蛾對性信息素的感受機(jī)制，以及草地貪夜蛾與勞氏粘蟲性信息素通訊系統(tǒng)間的隔離機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)。

圖3 3個SfruPBPs重組蛋白與14種氣味物質(zhì)的競爭結(jié)合曲線

表2 草地貪夜蛾3個SfruPBPs重組蛋白對本種及勞氏粘蟲性信息素和其他腺體組分的親和力

就腺體內(nèi)含量及田間雄蛾引誘活性而言，Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac分別是草地貪夜蛾性信息素的主組分和次要組分，常以不同比例構(gòu)成二元誘芯用于田間害蟲測報(bào)和誘捕(Tumlinsonetal., 1986; Unbehendetal., 2014; Jiangetal., 2021)。在被測14種氣味中， SfruPBP1對性信息素主組分Z9-14∶Ac特異性強(qiáng)結(jié)合(Ki=0.80 μmol/L)(表2)；SfruPBP2則對性信息素次要組分Z7-12∶Ac強(qiáng)結(jié)合，并對主組分具中等結(jié)合能力；SfruPBP3對2種性信息素組分均無明顯結(jié)合能力(圖3;表2)。在個別草地貪夜蛾地理種群中，Z11-16∶Ac也被證明具有一定的田間誘捕活性(Fleischeretal., 2005)，但本研究發(fā)現(xiàn)3個SfruPBPs對該組分均沒有明顯的結(jié)合能力，這與在大部分研究中該組分不具田間行為活性的結(jié)論(Tumlinsonetal., 1986; Unbehendetal., 2014)是一致的。結(jié)合劉蘇等(2020)對草地貪夜蛾3個PBPs的組織表達(dá)分析結(jié)果，我們推測SfruPBP1和SfruPBP2在雄蟲識別性信息素中起主要作用，SfruPBP3起輔助作用。

草地貪夜蛾與斜紋夜蛾Spodopteralitura和甜菜夜蛾為同屬近緣種，其中后兩者均為我國重要農(nóng)業(yè)害蟲，比較3種昆蟲PBP同源基因的表達(dá)模式及對性信息素組分的選擇性差異，可以為PBP基因的進(jìn)化及功能分化研究提供線索。在入侵種草地貪夜蛾中，3個PBPs對性信息素主組分Z9-14∶Ac的結(jié)合能力順次減弱(SfruPBP1>SfruPBP2>SfruPBP3)(圖3;表2)，與斜紋夜蛾和甜菜夜蛾3個PBPs對各自主組分Z9,E11-14∶Ac或Z9,E12∶Ac結(jié)合能力的結(jié)果(Liuetal., 2012, 2013)類似。但不同的是，草地貪夜蛾SfruPBP1特異性結(jié)合主組分Z9-14∶Ac，對不同組分具明顯的選擇性，而斜紋夜蛾和甜菜夜蛾的3個PBPs雖然對性信息素組分的結(jié)合能力順次減弱，但相同PBP在不同組分間沒有明顯的選擇性(Liuetal., 2012, 2013)，這種差異的原因需要進(jìn)一步探索。比較發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾3個PBPs在雌雄蟲觸角中的表達(dá)模式與斜紋夜蛾和甜菜夜蛾也存在不同。根據(jù)劉蘇等(2020)結(jié)果，草地貪夜蛾P(guān)BP1和PBP2均為雄蟲觸角高表達(dá)(雄/雌分別約為2.8和3.7)，且在雄蛾觸角中PBP2的表達(dá)量高于PBP1(PBP2/PBP1=1.3)。而在斜紋夜蛾和甜菜夜蛾中，僅PBP1為雄蟲觸角高表達(dá)(雄/雌分別為6.0和2.7)，且PBP1的表達(dá)量顯著高于PBP2(PBP1/PBP2分別為3.0和11.0)(Liuetal., 2012, 2013)。表達(dá)模式的不同可能與其PBP的配體選擇性的差異相關(guān)。

在使用草地貪夜蛾性信息素二元(Z9-14∶Ac和Z7-12∶Ac)或三元(Z9-14∶Ac,Z7-12∶Ac和Z11-16∶Ac)不同比例的誘芯進(jìn)行田間雄蛾誘捕時，常常能同時誘捕到相當(dāng)比例的勞氏粘蟲(Meagheretal., 2019; 沈嘉彬等, 2019)，但自然情況下兩種害蟲并不會交叉吸引，說明某些種特異性的性信息素次要組分在起作用。結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道(Hoetal., 2002; 江南紀(jì)和王琛柱, 2019)，在雌蛾性信息素腺體組分中，除6種共有組分外，草地貪夜蛾還特有7種組分(E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac,Z10-14∶Ac,Z11-14∶Ac,Z9-14∶Ald和Z11-16∶Ald)，而勞氏粘蟲特有2種組分(Z7-14∶Ac和Z7-16∶Ac)。本研究對這些特有組分(Z7-16∶Ac除外)的測定結(jié)果表明，草地貪夜蛾SfruPBP對本種特有組分E7-12∶Ac,Z9-12∶Ac, 11-12∶Ac和Z10-14∶Ac有不同程度的結(jié)合能力，而對勞氏粘蟲特有組分Z7-14∶Ac無明顯結(jié)合能力(表2)，說明這些組分均可能在兩種害蟲性信息素通訊隔離中起作用。此外，Ho等(2002)報(bào)道，勞氏粘蟲雄蛾對其2個特有組分Z7-14∶Ac和Z7-16∶Ac均有明顯的觸角電位反應(yīng)，也說明這2種組分可能在種間隔離中發(fā)揮作用。進(jìn)一步分析勞氏粘蟲PBP對兩種害蟲共有及特有組分的結(jié)合能力，將有助于更全面認(rèn)識兩種害蟲性信息素通訊間的隔離機(jī)制，并為開發(fā)兩種害蟲的特異性田間誘芯提供指導(dǎo)。