王光宇, 張萌萌, 陳 立

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院, 河北保定 071002)

白星花金龜Protaetiabrevitarsis屬鞘翅目(Coleoptera)金龜科(Scarabaeidae)花金龜亞科(Cetoniinae)(Lewis, 1879)，國外主要分布于蒙古、韓國、朝鮮、日本、俄羅斯等國家，在我國主要分布于華北、東北、黃淮海及新疆等地區(qū)(劉廣瑞等, 1997)。白星花金龜一年1代，以幼蟲在土壤內(nèi)越冬，成蟲次年6-7月出土，對(duì)糧食、蔬菜、水果等眾多經(jīng)濟(jì)作物危害嚴(yán)重，尤其喜食葡萄、蘋果、柑橘、玉米等作物的果實(shí)且常為群集為害(陳日曌等, 2006; 龔建等, 2017)。在新疆，該蟲導(dǎo)致的葡萄被害率在20%～40%之間，有時(shí)甚至達(dá)到60%，嚴(yán)重威脅到我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)(郭文超等, 2004; 李濤, 2018)。

白星花金龜?shù)姆乐未胧┲饕?種：一是農(nóng)業(yè)防治，如深耕漫灌；二是化學(xué)防治，在有機(jī)肥或土壤中撒施農(nóng)藥以防治白星花金龜?shù)挠紫x、蛹；三是基于白星花金龜成蟲的假死性，采用人工震落并捕捉的機(jī)械防治方式(周智穎, 2020)。白星花金龜成蟲常為害成熟果實(shí)，為保證產(chǎn)品的安全性，不宜采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，轉(zhuǎn)而采用糖醋液誘集捕殺的方法(李仲秀等, 1995; 郝雙紅等, 2005)，但效果并不理想。因此，有必要開發(fā)環(huán)境友好、成本低廉的科學(xué)防治技術(shù)。

麗金龜科(Rutelidae)和花金龜科(Cetoniiae)金龜甲成蟲常取食植物地上部分以獲得補(bǔ)充營養(yǎng)，并在植物上進(jìn)行求偶活動(dòng)，其取食和交配等行為必然會(huì)受到植物揮發(fā)物的影響。健康植物主要釋放組成型綠葉揮發(fā)物，但當(dāng)受到昆蟲取食為害時(shí)，會(huì)釋放大量蟲害誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物揮發(fā)物(Hararietal., 1994; Loughrinetal., 1996)。金龜甲也能通過嗅覺感受植物揮發(fā)物及其成分變化(熱孜宛古麗·阿卜杜克熱木等, 2018)，并產(chǎn)生行為反應(yīng)。健康歐洲山毛櫸釋放的綠葉揮發(fā)物能吸引花園金龜Phylloperthahorticola，雄蟲還能利用取食誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物來定位雌性配偶(Ruther, 2004)；日本麗金龜Popillajaponica取食為害誘導(dǎo)海棠葉產(chǎn)生大量萜烯類成分，能引誘日本麗金龜聚集(Loughrinetal., 1995)；被日本麗金龜和綠花金龜Cotinisnitida取食后的葡萄果實(shí)揮發(fā)物中醇類與酯類顯著增加，可引誘更多的綠花金龜聚集取食(Hammonsetal., 2009)。

本研究旨在利用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-electroantennogram detection, GC-EAD)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)鑒定蘋果、葡萄和玉米3種寄主果實(shí)在健康和受害兩種狀態(tài)下對(duì)白星花金龜雌成蟲觸角有電生理活性的揮發(fā)物成分及其含量，為開發(fā)用于防控白星花金龜?shù)闹参镌凑T劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

白星花金龜成蟲采集于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站內(nèi)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用蘋果喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度28℃，相對(duì)濕度60%。實(shí)驗(yàn)前區(qū)分雌、雄成蟲，選擇60日齡左右的健康雌蟲用于受害果實(shí)處理及電生理實(shí)驗(yàn)。

1.2 寄主果實(shí)揮發(fā)物的采集

新鮮紅富士蘋果和巨峰葡萄從市場購買，幼嫩甜玉米穗采摘于北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)玉米田。新鮮蘋果、葡萄和玉米視為健康狀態(tài)，20頭白星花金龜成蟲(雌蟲∶雄蟲=1∶1)取食24 h后的蘋果、葡萄和玉米視為受害狀態(tài)。將約400 g健康或受害果實(shí)放入PE保鮮袋[35 cm×45 cm，佳能(中國)有限公司]中。大氣采樣儀(QC-1S，北京市勞保所)的出氣口用四氟乙烯軟管與活性炭棒(20 g, 10～20目)相連接，空氣經(jīng)碳棒過濾后通入保鮮袋的一端，保鮮袋的開口處用棉繩扎緊。在保鮮袋的另一端插入一根裝有Porapark Q吸附劑(200 mg, 80/100目，Sigma-Aldrich)的吸附管(內(nèi)徑5 mm)，用食品級(jí)硅膠軟管連接吸附管和大氣采樣儀進(jìn)氣口。大氣采樣儀流速為500 mL/min，采樣時(shí)間為2.5 h。將頂空收集完畢的吸附管用1 mL濃度為5 ng/μL的苯甲酸甲酯溶液(溶劑為色譜純二氯甲烷)洗脫獲得0.5 mL樣品，保存至-20℃冰箱中。每個(gè)采樣處理重復(fù)7次。所獲得的樣品直接用于GC-FID定量分析，然后將來自同一處理的樣品合并、濃縮后進(jìn)行GC-EAD和GC-MS分析。

1.3 定量分析

使用氣相色譜(GC-2010 Plus, Shimadzu)對(duì)所獲樣品進(jìn)行定量分析，氣相色譜安裝有DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent Technologies)。采用無分流進(jìn)樣模式，進(jìn)樣量為2 μL，進(jìn)樣口溫度為230℃，檢測器溫度為250℃，載氣為氮?dú)?，流速? mL/min。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，保持2 min；以5℃/min的速率升至120℃；以15℃/min升至240℃，保持4 min，整個(gè)過程持續(xù)30 min。利用GC-Solution軟件對(duì)各成分的相對(duì)峰面積進(jìn)行積分，計(jì)算出相對(duì)含量，根據(jù)內(nèi)標(biāo)(苯甲酸甲酯)的濃度對(duì)各成分進(jìn)行定量，用非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)比同種果實(shí)活性成分不同狀態(tài)下的含量差異， 7個(gè)重復(fù)。

1.4 GC-EAD分析

GC-EAD分析方法參照Chen等(2019)，將氣相色譜與觸角電位儀(Kirchzarten, Syntech)聯(lián)用。觸角電位儀由IDAC-2數(shù)據(jù)采集控制器、CS-55氣流刺激控制裝置和微動(dòng)操縱器組成。氣相色譜儀(GC-2010 Plus, Shimadzu)的毛細(xì)管柱型號(hào)與定量分析時(shí)相同，毛細(xì)管柱的末端連接Y型分流管(Agilent Technologies)，Y型分流管的兩個(gè)分支分別連接內(nèi)徑0.25和0.32 mm的毛細(xì)管柱，細(xì)毛細(xì)管連接FID檢測器，粗毛細(xì)管經(jīng)過加熱套連接到吹向觸角連接的持續(xù)氣流管。兩根毛細(xì)管柱的長度比為2∶3，分流比約為1∶2。載氣為氮?dú)?，流速? mL/min。同時(shí)在Y型分流管前端增加一路補(bǔ)充氣體，流速為20 mL/min。進(jìn)樣模式、進(jìn)樣量、進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度與升溫程序均與定量分析時(shí)一致。用微型手術(shù)刀將雌成蟲觸角切下，基部連接到參比電極，鰓瓣分開后將其中一個(gè)連接到記錄電極。凈化和加濕后的持續(xù)氣流以400 mL/min的速率吹向觸角。用GC-EAD軟件記錄觸角的電生理信號(hào)和氣相色譜的FID信號(hào)，每個(gè)樣品重復(fù)記錄8～10次。

1.5 化合物的鑒定

色譜柱與定量分析時(shí)相同，無分流模式，進(jìn)樣量為1 μL，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度為230℃，離子源溫度為230℃，電離方式為EI，電離能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為 40～500 amu。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，保持5 min；以5℃/min的速率升至240℃，保持5 min，整個(gè)過程持續(xù)50 min。GC-MS分析結(jié)果經(jīng)與NIST14譜庫對(duì)比及標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，確定化合物的具體成分。

1.6 觸角電生理活性成分的主成分分析及聚類分析

為描述果實(shí)種類及受害狀態(tài)對(duì)揮發(fā)物的影響，對(duì)3種果實(shí)、兩種不同受害狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應(yīng)的成分進(jìn)行主成分分析(principle component analysis, PCA)。每個(gè)處理7個(gè)重復(fù)，用Origin 2019b對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并利用相關(guān)性矩陣計(jì)算數(shù)據(jù)之間的特征向量。聚類分析(cluster analysis, CA)選擇前2個(gè)主成分的歐式距離使用瓦爾德法對(duì)6個(gè)處理的揮發(fā)物進(jìn)行分組，構(gòu)建聚類譜系圖，分析軟件為SPSS 23.0。根據(jù)主成分分析結(jié)果及聚類譜系圖繪制二維因子載荷圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0對(duì)不同狀態(tài)下果實(shí)揮發(fā)物中EAD活性成分含量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=7)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異分析克魯斯卡爾-沃利斯成對(duì)比較檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)(P<0.05)。利用Origin 2018對(duì)不同狀態(tài)下的果實(shí)揮發(fā)物活性成分進(jìn)行主成分分析；根據(jù)主成分分析結(jié)果，用SPSS 23.0對(duì)不同狀態(tài)下的果實(shí)揮發(fā)物進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 白星花金龜雌成蟲對(duì)蘋果揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

蘋果果實(shí)揮發(fā)物中共有23種物質(zhì)能夠明顯引起白星花金龜雌成蟲的觸角電位反應(yīng)，其中健康蘋果中有18種，受害蘋果中有21種(圖1)。 兩種狀態(tài)下均能引起觸角電位反應(yīng)的物質(zhì)有13種，分別為丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、己酸甲酯、2-甲基丁醇、 己酸乙酯、 乙酸己酯、 6-甲基-5-庚烯-2-酮、己醇、壬醛、異戊酸己酯和α-法尼烯。健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應(yīng)的特有揮發(fā)物成分有2種，分別為乙酸丁酯和己酸丙酯；受害狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應(yīng)的特有揮發(fā)物成分有5種，分別為2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、3-甲基-3-丁烯-1-醇和辛酸乙酯。根據(jù)定量結(jié)果，有3種成分僅在濃度顯著高于另一狀態(tài)時(shí)才發(fā)生觸角電位反應(yīng)，如2-甲基丙醇、乙酸戊酯、丁酸丁酯(圖1; 表1)。

圖1 白星花金龜雌成蟲對(duì)蘋果揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

2.2 白星花金龜雌成蟲對(duì)葡萄揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

葡萄果實(shí)中共有23種揮發(fā)物能引起白星花金龜雌成蟲的觸角電位反應(yīng)，其中健康葡萄有18種物質(zhì)，受害葡萄有13種物質(zhì)(圖2)。健康與受害兩種條件下均能引起觸角電位反應(yīng)的物質(zhì)有8種，分別為丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己醇、2-己烯酸乙酯、順-3-己烯醇、壬醛和一種未鑒定物質(zhì)；健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應(yīng)的特有成分有7種，分別為2-丁烯酸乙酯、庚醛、3-己烯酸乙酯、順-2-己烯醇、丁酮肟、(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯和一種未鑒定物質(zhì)；受害狀態(tài)下有5種物質(zhì)為特有成分，包括乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、3-蒈烯、3-羥基-2-丁酮和一種未鑒定物質(zhì)(圖2; 表1)。

圖2 白星花金龜雌成蟲對(duì)葡萄揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

2.3 白星花金龜雌成蟲對(duì)玉米揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

玉米果實(shí)共有25種具有電生理活性的揮發(fā)物，其中健康玉米有9種，受害玉米23種(圖3)。兩種狀態(tài)下均能引起觸角電位反應(yīng)的物質(zhì)有7種，分別是1-戊烯-3-醇、順-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、順-2-己烯醇、香葉基丙酮和一種未鑒定物質(zhì)。健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應(yīng)的特有成分有2種，分別為α-叩卜任烯和1種未鑒定物質(zhì)。受害狀態(tài)下特有成分有16種，分別為3-己酮、3-甲基丁酸乙酯、己醛、β-蒎烯、4-庚酮、丙酸丁酯、3-蒈烯、2-庚酮、D-檸檬烯、2-戊基呋喃、戊醇、4-庚醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、芳樟醇和γ-己內(nèi)酯(圖3; 表1)。

圖3 白星花金龜雌成蟲對(duì)玉米揮發(fā)物的GC-EAD反應(yīng)

表1 3種果實(shí)兩種狀態(tài)下?lián)]發(fā)物中對(duì)白星花金龜雌成蟲有EAD活性的成分

2.4 觸角電生理活性成分的主成分分析(PCA)及聚類分析(CA)

根據(jù)58種成分的主成分分析結(jié)果， 4個(gè)主成分可解釋的方差百分比能達(dá)到72.8%。前兩個(gè)PCA成分能夠解釋總變異程度的48.5%，其中第一主成分對(duì)總揮發(fā)物的解釋程度為28.3%， 第二主成分為20.2%(圖4)。 根據(jù)主成分1和2的聚類分析結(jié)果，可將6個(gè)處理的揮發(fā)物大致分成5組(圖5)，分別為來自健康蘋果(G1)、 受害蘋果(G2)、 健康葡萄+受害葡萄(G3)、健康玉米(G4)和受害玉米(G5)。

續(xù)表1 Table 1 continued

圖4 不同狀態(tài)下3種果實(shí)揮發(fā)物主成分分析

圖5 基于不同狀態(tài)下3種果實(shí)揮發(fā)物主成分1和2的聚類分析譜系圖

根據(jù)各成分在主成分分析中所占權(quán)重，蘋果中的釋放量高于其他處理的有14種，將受害蘋果與健康蘋果很好地分離開(圖4)，包括11種酯(2-甲基丁酸甲酯、乙酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、己酸丙酯、異戊酸己酯和辛酸乙酯)、2種醇(2-甲基丁醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇)和1種萜烯(α-法尼烯)。受害后含量顯著下降的成分為7種酯和1種醇，包括2-甲基丁基乙酸酯、 2-甲基丁酸丙酯、 乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、異戊酸己酯和己醇，顯著上升的為1種酯和2種醇，包括己酸乙酯、2-甲基丙醇和2-甲基丁醇(表1)。

葡萄中釋放量高于其他處理的成分有15種，但未能將健康與受害葡萄分離(圖4)。包括9種酯(乙酸異丁酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、2-己烯酸乙酯和(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯)，2種醛(庚醛和壬醛)、1種酮(3-羥基-2-丁酮)、1種醇(2-甲基丙醇)、1種萜烯(3-蒈烯)和1種肟(丁酮肟)。受害后含量顯著上升的成分包括1種酯和3種醇，為2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙醇、己醇和順-3-己烯醇(表1)。

玉米中釋放量高于其他處理的成分有21種，較好地將健康與受害玉米分離(圖4)。包括10種醇(1-戊烯-3-醇、戊醇、4-庚醇、順-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、順-3-己烯醇、順-2-己烯醇、反-2-己烯醇和芳樟醇)、4種酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和香葉基丙酮)、3種酯(3-甲基丁酸乙酯、丙酸丁酯和γ-己內(nèi)酯)、2種萜烯(D-檸檬烯和α-叩卜任烯)、1種醛(己醛)和1種呋喃(2-戊基呋喃)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅順2-己烯醇含量在受害后顯著降低(表1)。

3 討論與結(jié)論

蘋果、葡萄和玉米等3種寄主果實(shí)受害前、后能夠引起白星花金龜雌成蟲觸角電位反應(yīng)的揮發(fā)物共有58種(表1)，部分活性物質(zhì)如己醛、壬醛、己醇、反-2-己烯醇、順-3-己烯醇、2-甲基丁醇、芳樟醇、2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、乙酸己酯和3-羥基-2-丁酮等，在前人的研究中已有報(bào)道(Chen and Li, 2011; 龔建, 2017; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)。有些活性物質(zhì)對(duì)其他金龜甲也具有電生理活性，如己醛、壬醛和芳樟醇等能夠引起高粱花金龜Pachnodainterrupta的觸角電位反應(yīng)(Bengtssonetal., 2009)；乙酸異戊酯和丁酸乙酯等能引起鰓金龜Holotrichiaserrata的電生理活性(Subaharanetal., 2013)；己醇和反-2-己烯醇能引起歐洲金龜Melolonthamelolontha的電生理反應(yīng)等(Andreasetal., 2005)。有些物質(zhì)還能引起白星花金龜和其他金龜?shù)男袨榉磻?yīng)，如壬醛、己醛、反-2-己烯醛、己醇、反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸丁酯和苯酚等對(duì)白星花金龜成蟲具有吸引作用(王清華和張金桐, 2008; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)；順-3-己烯醇、芳樟醇、α-法尼烯對(duì)日本麗金龜具明顯的吸引作用(Loughrinetal., 1995)；日本麗金龜P.japonica引誘劑(丙酸苯乙酯∶丁香酚∶香葉醇，3∶ 7∶3)對(duì)白星花金龜具也有引誘作用(Ladd and McGovern, 1980)；順-3-己烯醇、丁酸丁酯對(duì)高粱花金龜具有顯著吸引作用(Wolde-Hawariatetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。這些常見的能夠引起金龜觸角電位及行為反應(yīng)的活性物質(zhì)對(duì)開發(fā)白星花金龜引誘劑具有重要的參考價(jià)值。

金龜甲的取食會(huì)導(dǎo)致寄主揮發(fā)物的成分發(fā)生質(zhì)和量的改變，進(jìn)而影響金龜?shù)募闹鞫ㄎ?Stensmyretal., 2001)。主成分分析及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明3種果實(shí)之間揮發(fā)物差異較大，能夠顯著代表蘋果、葡萄和玉米果實(shí)的揮發(fā)性氣味分別有14, 15和21種，這些代表性成分可較好地區(qū)分健康、受害兩種狀態(tài)下的蘋果和玉米，但無法區(qū)分兩種狀態(tài)下的葡萄，這可能與白星花金龜區(qū)分寄主狀態(tài)時(shí)的難易程度有關(guān)，白星花金龜可能更難以區(qū)分健康和受害狀態(tài)下的葡萄。果實(shí)受害前、后釋放的揮發(fā)物中對(duì)白星花金龜雌成蟲有電生理活性的成分以酯類和醇類為主。除受害前、后的特有成分外，釋放量顯著減少的酯有7種(2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯和異戊酸己酯)；釋放量顯著增加的醇有3種(2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和順-3-己烯醇)，說明白星花金龜?shù)娜∈衬軌蛞种?種果實(shí)中部分酯的釋放，促進(jìn)部分醇的釋放。此外，白星花金龜能誘導(dǎo)果實(shí)釋放新的醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇、戊醇、4-庚醇、芳樟醇和反-2-己烯醇)、酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和3-羥基-2-丁酮)和萜烯(3-蒈烯、D-檸檬烯和β-蒎烯)。喜好聚集為害的昆蟲對(duì)蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物通常有較強(qiáng)的行為反應(yīng)。如3-甲基-3-丁烯-1-醇對(duì)落葉松八齒小蠹Ipssubelongatus有引誘作用(Zhangetal., 2007)；歐洲鰓金龜Melolonthamelolontha雌蟲取食誘導(dǎo)的己醇、反-2-己烯醇和順-3-己烯醇對(duì)雄蟲有顯著的吸引作用(Reineckeetal., 2005)；Y型嗅覺儀行為實(shí)驗(yàn)證明葡萄受害后的特有成分3-羥基-2-丁酮、玉米受害后產(chǎn)生的己醛對(duì)白星花金龜成蟲具有引誘作用(王瑞迪, 2019)；乙酸異戊酯對(duì)高粱花金龜P.interrupta具有引誘作用(Wolde-Hawariatetal., 2007)；玉米受害后產(chǎn)生的β-蒎烯對(duì)花金龜Pachnodamarginata具有引誘作用(Larssonetal., 2003)。因此，研究寄主植物受害前后釋放的揮發(fā)物的變化可能有助于解釋白星花金龜更趨向于受害果實(shí)的集群危害習(xí)性。

利用嗅覺電生理和室內(nèi)行為實(shí)驗(yàn)尋找活性物質(zhì)用于田間測試，是開發(fā)植物源誘劑的常用手段(Dickensetal., 1991; Zhangetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。那些對(duì)白星花金龜具有室內(nèi)行為活性的揮發(fā)物，可直接用于田間誘集試驗(yàn)，而那些有電生理活性但未測試室內(nèi)行為反應(yīng)的揮發(fā)物，可同時(shí)開展室內(nèi)行為測試與田間誘集效果篩選。