白鵬華, 王 冰, 張仙紅, 王桂榮

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193;2. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 天津300384; 3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 山西太谷 030801)

昆蟲靈敏的嗅覺系統(tǒng)用以識(shí)別環(huán)境中的氣味化合物(例如植物揮發(fā)物和昆蟲性信息素)，從而指導(dǎo)昆蟲定位寄主、取食、交配、產(chǎn)卵和逃避傷害等重要生命活動(dòng)(Zhang RBetal., 2017; Turlings and Erb, 2018; Guo and Wang, 2019; 王冰等, 2021; 游銀偉和張龍, 2021)。昆蟲識(shí)別氣味化合物是一個(gè)復(fù)雜的過程，氣味受體(odorant receptors, ORs)在昆蟲觸角外周嗅覺系統(tǒng)識(shí)別氣味分子的過程中起著關(guān)鍵作用。氣味分子激活ORs后，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，在嗅覺中樞觸角葉內(nèi)進(jìn)行編碼整合，進(jìn)一步傳遞到更高級(jí)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使昆蟲產(chǎn)生相應(yīng)的嗅覺行為反應(yīng)(Montagnéetal., 2015; Fleischeretal., 2018; 劉偉和王桂榮, 2020)。因此，昆蟲氣味受體功能的鑒定有助于揭示昆蟲觸角外周神經(jīng)系統(tǒng)的嗅覺識(shí)別機(jī)制(de Fouchieretal., 2017; Fleischeretal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019)。

昆蟲氣味受體從結(jié)構(gòu)上可分為2類：一類是在不同昆蟲間高度保守且廣泛表達(dá)的氣味受體共受體(odorant receptor co-receptor, Orco)；另一類是普通氣味受體(ORs)，這類受體在同一物種或不同物種間同源性很低且數(shù)量眾多，與Orco共同作用形成復(fù)合二聚體，共同感受外界的氣味分子。在鱗翅目中，氣味受體又根據(jù)功能劃分為性信息素受體(pheromone receptors, PRs)和普通氣味受體，前者主要識(shí)別鱗翅目性信息素組分，后者大多識(shí)別植物揮發(fā)物等(Breeretal., 2019)。

隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的昆蟲OR基因被鑒定出來，OR功能的研究方法也不斷深入與發(fā)展起來。常用的ORs功能研究涉及到體外和體內(nèi)兩種方法(Montagnéetal., 2015)，前者包括爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocytes)異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)(two-electrode voltage clamp, TEVC)、轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合單感器記錄技術(shù)(single sensillum recording, SSR)和細(xì)胞系異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合鈣離子成像技術(shù)(calcium imaging)；后者主要有RNA干擾技術(shù)(RNA interference, RNAi)和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated nuclease Cas9)基因編輯技術(shù)。深入了解各個(gè)研究方法的原理、實(shí)施的技術(shù)特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，有助于開展行之有效的受體功能鑒定。因此，研究者可以根據(jù)研究的目的和現(xiàn)有的技術(shù)條件而選擇不同的氣味受體研究方法(Linetal., 2015; Wang Betal., 2016, 2018; Houetal., 2020)。本文主要從基因鑒定、表達(dá)定位和生理功能等方面對(duì)昆蟲氣味受體的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述，歸納總結(jié)了2015年來昆蟲氣味受體研究的理論和技術(shù)發(fā)展，比較了不同研究方法的原理、特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)，為選擇合適的氣味受體功能研究方法提供參考。

1 氣味受體基因的鑒定

氣味受體基因的鑒定是開展氣味受體功能研究的第一步。1991年，第一個(gè)氣味受體基因在脊椎動(dòng)物褐家鼠Ratfmnorvegicus嗅覺上皮組織中發(fā)現(xiàn)(Buck and Axel, 1991)。但是由于不同物種中氣味受體基因的同源性較低，無法通過同源比對(duì)的方法獲得昆蟲氣味受體基因。直到 1999 年，利用黑腹果蠅Drosophilamelanogaster全基因組測(cè)序的方法首次鑒定到昆蟲第一個(gè)氣味受體基因(Clyneetal., 1999; Robertsonetal., 2003)。隨著組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，科學(xué)家們利用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析等技術(shù)手段快速、準(zhǔn)確地鑒定了多種昆蟲氣味受體基因 (Montagnéetal., 2015; Breeretal., 2019)。

1.1 基因組測(cè)序鑒定氣味受體基因

昆蟲嗅覺基因的鑒定得益于基因組測(cè)序技術(shù)的巨大進(jìn)步和生物信息學(xué)的逐漸普及?；蚪M測(cè)序技術(shù)已由第一代發(fā)展至第三代。第一代DNA測(cè)序技術(shù)(例如 Sanger 測(cè)序技術(shù))以鏈終止法或鏈降解法為原理，具有準(zhǔn)確率高、讀長(zhǎng)較長(zhǎng)等特點(diǎn)(Venteretal., 2001; 尹傳林等, 2017)，利用該方法測(cè)定了一系列模式生物的基因組序列，例如果蠅、線蟲等。但一代測(cè)序技術(shù)對(duì)于基因組較大的物種而言，其測(cè)序成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且通量低，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)?；蚪M測(cè)序。為降低測(cè)序成本，第二代測(cè)序技術(shù)(SOLi D 技術(shù)、Illumina Solexa技術(shù)和 454 技術(shù))應(yīng)運(yùn)而生。Solexa 技術(shù)和454技術(shù)是基于邊合成邊測(cè)序的原理，而 SOLi D 技術(shù)是基于邊連接邊測(cè)序和雙色法的原理。該技術(shù)克服了第一代測(cè)序技術(shù)的缺點(diǎn)，極大地降低了測(cè)序成本，提高了測(cè)序通量和測(cè)序速度，同時(shí)保持了高準(zhǔn)確性，目前已基本代替了第一代測(cè)序技術(shù)(Shendureetal., 2017)。但由于其依賴于PCR擴(kuò)增，易造成拷貝錯(cuò)誤、信息丟失等缺點(diǎn)，且讀長(zhǎng)較短(最多只有200多bp)，導(dǎo)致基因組組裝困難。在此基礎(chǔ)上，第三代測(cè)序技術(shù)(納米孔單分子測(cè)序技術(shù))橫空出世，其主要技術(shù)特點(diǎn)是DNA片段不需要擴(kuò)增，而是以單分子為單位進(jìn)行測(cè)序，顯著提高了讀長(zhǎng)，已用于多倍體基因組的測(cè)序和組裝。但三代測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)分析過程較為復(fù)雜，準(zhǔn)確率仍有待提高。

基因組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展大幅度降低了測(cè)序成本，越來越多的昆蟲基因組序列被公布。昆蟲基因組學(xué)重大專項(xiàng) “5000種昆蟲基因組測(cè)序計(jì)劃(i5k)” 提出在2020年前后完成5 000種節(jié)肢動(dòng)物基因組的測(cè)序和分析工作。在i5k全球性計(jì)劃基礎(chǔ)之上，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所聯(lián)合浙江大學(xué)、西南大學(xué)等單位在2018昆蟲基因組與綠色防控大會(huì)上共同推出了 “TOP1000昆蟲基因組計(jì)劃”。自2015-2019年通過基因組測(cè)序方法從27種昆蟲中共鑒定了2 543個(gè)OR基因，覆蓋了昆蟲8個(gè)目，主要集中在鱗翅目、雙翅目、半翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目和蜻蜓目(表1)。其中，煙草天蛾Mauducasexta和草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda等8種鱗翅目昆蟲中鑒定出569個(gè)OR基因，占OR基因總數(shù)的21.75%(表1; 圖1)(Kanostetal., 2016; Liu Hetal., 2019)；6種雙翅目昆蟲中鑒定出319個(gè)OR基因；5種半翅目昆蟲中鑒定出437個(gè)OR基因；3種鞘翅目昆蟲中鑒定出664個(gè)OR基因。

圖1 2015-2019年利用基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定昆蟲氣味受體基因的數(shù)量

表1 2015-2019年利用基因組測(cè)序鑒定的昆蟲氣味受體基因

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定氣味受體基因

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)具有成本低、測(cè)序效率高和時(shí)空表達(dá)等特點(diǎn)，可以分析昆蟲不同發(fā)育階段、不同組織和性別等樣品的差異表達(dá)基因。該技術(shù)可用于非模式昆蟲或基因組信息未知的昆蟲氣味受體基因鑒定。觸角是昆蟲嗅覺系統(tǒng)的重要組成部分，大量OR基因是根據(jù)觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定出來的，如大灰優(yōu)蚜蠅Eupeodescorollae、黏蟲Mythimnaseparata、桃小食心蟲Carposinasasakii、黑肩綠盲蝽Cyrtorhinuslividipennis、稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus(Wang Betal., 2017; Duetal., 2018a; Tianetal., 2018; Wang GYetal., 2018; Zhang XXetal., 2019)(表2)。

表2 2015-2019年利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定的昆蟲氣味受體基因

續(xù)表2 Table 2 continued

續(xù)表2 Table 2 continued

此外，OR基因在一些昆蟲的非嗅覺組織如喙、下顎須、足和生殖器甚至翅等中均有表達(dá)，這些基因在識(shí)別氣味化合物中也發(fā)揮著重要作用(Xiaetal., 2015; Maetal., 2016; Guoetal., 2018)。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015-2019年，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從89種昆蟲中共鑒定了5 111個(gè)OR基因(圖1; 表2)。其中鱗翅目昆蟲中鑒定的OR基因數(shù)量達(dá)1 898個(gè)，分布在36種昆蟲，主要為棉鈴蟲Helicoverpaarmigera及其近緣種、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、桃小食心蟲Carposinasasakii和蘋果蠹蛾Cydiapomonella等重要農(nóng)業(yè)害蟲；其他目昆蟲依次是鞘翅目(19種, 897個(gè)OR基因)、膜翅目(13種, 1 118個(gè)OR基因)、半翅目(9種, 406個(gè)OR基因)、雙翅目(7種, 306個(gè)OR基因)和直翅目(5種, 486個(gè)OR基因)(圖1; 表2)。OR基因數(shù)量在不同昆蟲種類間差異很大，如松褐天牛腫腿蜂Sclerodermussp.的觸角中僅有8個(gè)OR基因，而班氏跳小鋒Aenasiusbambawalei的觸角中多達(dá)226個(gè)OR基因(表2)。OR基因數(shù)目在不同物種間的顯著差異性，說明了昆蟲嗅覺識(shí)別能力的復(fù)雜性與不同基因的重要功能密切相關(guān)，這可能與其生存的生態(tài)環(huán)境和承受的自然選擇壓力不同有關(guān)(Leal, 2013; 何艷艷等, 2019)。

盡管轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于OR基因鑒定，但轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的精確度尚未達(dá)到基因組測(cè)序技術(shù)水平，很多低表達(dá)的基因和長(zhǎng)度較長(zhǎng)的基因很難鑒定出來。如基于基因組測(cè)序數(shù)據(jù)在棉鈴蟲H.armigera體內(nèi)鑒定出87個(gè)OR基因，而基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)僅挖掘出60個(gè)OR基因(Zhang Jetal., 2015; Liu Hetal., 2019)。因此，未來仍需要基因組與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，并利用多種生物信息學(xué)手段深入全面分析基因數(shù)據(jù)，尋找出更多的未知?dú)馕妒荏w基因。

2 氣味受體結(jié)構(gòu)特征

在昆蟲氣味受體基因鑒定的基礎(chǔ)之上，科學(xué)家們深入研究了昆蟲氣味受體蛋白結(jié)構(gòu)，闡明ORs結(jié)構(gòu)和生理功能之間的關(guān)系。Benton等(2006)首次揭示了昆蟲氣味受體的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其典型結(jié)構(gòu)是7次跨膜蛋白，N端位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)，C端位于胞膜外。在胞內(nèi)(intracellular, IC)和胞外(extracellular, EC)各形成3個(gè)Loop 環(huán)，其中胞外環(huán)1(extracellular loop 1, ECL1)通常由15～24個(gè)氨基酸組成，胞外環(huán)2(ECL2)由20～35個(gè)氨基酸組成，胞外環(huán)3(ECL3)最多由17個(gè)氨基酸組成；組成胞內(nèi)環(huán)1(intracellular loop 1, ICL1)的氨基酸數(shù)量一般少于20，胞內(nèi)環(huán)2(ICL2)由15～21個(gè)氨基酸組成，胞內(nèi)環(huán)3(ICL3)氨基酸序列由16～180個(gè)氨基酸組成(Tiwarietal., 2019)。ORs的Loop環(huán)、C端和N端氨基酸序列的長(zhǎng)度與其功能特異性是密切相關(guān)的(Palczewskietal., 2000)，其中具有較大胞外結(jié)構(gòu)的胞外環(huán)2可能是昆蟲識(shí)別外界氣味分子的結(jié)合位點(diǎn)(Jacquin-Joly and Merlin, 2004)。黑腹果蠅D.melanogasterOR43a通過保守的C末端與共受體OR83b結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，OR43a 和OR83b的ICL3 之間存在物理互作現(xiàn)象，成功確定了OR和Orco互作關(guān)系(Bentonetal., 2006)。隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，利用生物信息學(xué)工具能夠快速預(yù)測(cè)昆蟲氣味受體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。Liu YP等(2018)通過TMHMM 2.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)網(wǎng)站預(yù)測(cè)了小菜蛾P(guān).xylostella的性信息素受體PxylOR8, PxylOR41和 PxylOR45 具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，且具有細(xì)胞內(nèi)N末端和細(xì)胞外C末端的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；向候君等(2018)利用SOPMA軟件(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析出斑翅果蠅DrosophilasuzukiiOrco二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占比為50.21%，直鏈延伸占比為20.16%，β轉(zhuǎn)角占比為8.64%，無規(guī)則卷曲占比為20.99%。

在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，三維結(jié)構(gòu)的解析更有助于揭示氣味受體的結(jié)構(gòu)與其生理功能之間的關(guān)系。解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要研究方法有X射線晶體學(xué)技術(shù)、核磁共振技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)。由于X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)適用于水溶性蛋白結(jié)構(gòu)解析，因此多種昆蟲OBPs 的三維結(jié)構(gòu)大多是利用以上兩種方法完成的(張玉等, 2019; 杜亞麗等, 2020)。但這兩種技術(shù)不適用大分子蛋白結(jié)構(gòu)解析，因此無法實(shí)現(xiàn)膜蛋白ORs的三維結(jié)構(gòu)研究。冷凍電鏡技術(shù)(cryo-electron microscopy, Cryo-EM)的快速發(fā)展為揭示大分子蛋白生物結(jié)構(gòu)與功能互作機(jī)制提供了技術(shù)支撐。該技術(shù)與X射線晶體學(xué)技術(shù)和核磁共振技術(shù)相比，在樣品處理方面有著極大的優(yōu)勢(shì)，無需將大分子樣品制成晶體，只需在低溫下通過透射電子顯微鏡即可獲得生物大分子的近 “原子級(jí)” 的分辨率成像，經(jīng)過圖像處理和重構(gòu)計(jì)算，模擬出生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)已成功應(yīng)用于昆蟲氣味受體結(jié)構(gòu)研究，Butterwick等(2018)利用該技術(shù)首次揭示了分辨率為3.5?的寄生性榕小蜂ApocryptabakeriOrco晶體結(jié)構(gòu)，del Mármol等(2021)利用該技術(shù)解析了原始昆蟲石蛃Machilishrabei的MhraOR5晶體結(jié)構(gòu)。Butterwick等(2018)和del Mármol等(2021)發(fā)現(xiàn)昆蟲氣味受體的4個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成了選擇性離子通道，4個(gè)亞基松散地結(jié)合在通道的中心孔上，就像一朵花瓣。離子通道由1個(gè)胞外離子通道入口和4個(gè)胞內(nèi)離子通道出口組成，離子通道最窄處的S7b 上的疏水氨基酸V469和L473是調(diào)控離子通道選擇性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(Butterwicketal., 2018)。該離子通道在氣味配體刺激后出現(xiàn)胞外Ca2+內(nèi)流和陽離子非選擇性的離子電導(dǎo)，進(jìn)一步說明了氣味分子激發(fā)的氣味受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過開放的離子通道實(shí)現(xiàn)的(Satoetal., 2008)。Butterwick等(2018)發(fā)現(xiàn)寄生性榕小蜂A.bakeriOrco的其中一個(gè)亞基的第1-6部分跨膜結(jié)構(gòu)在胞外形成配體結(jié)合口袋(ligand-binding pocket)，也稱“受體口袋”。del Mármol等(2021)利用冷凍電鏡技術(shù)揭示了石蛃M.hrabei的MhraOR5與其配體丁香酚和驅(qū)蟲劑避蚊胺的結(jié)合機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)將受體口袋上的蛋氨酸Met209突變?yōu)楦〉氖杷被釙r(shí)(纈氨酸或丙氨酸)，擴(kuò)大了受體口袋，從而增加了受體對(duì)較大分子避蚊胺的親和力，而降低了對(duì)較小分子丁香酚的親和力。這可能是因?yàn)槎∠惴咏Y(jié)構(gòu)較小，無法很好契合較大的受體口袋。del Mármol等(2021)揭示了昆蟲氣味受體蛋白口袋的單個(gè)氨基酸的突變就足以改變其結(jié)合特性，進(jìn)而影響受體與化合物的相互作用，有助于揭示昆蟲氣味受體基因家族的分子演變，為進(jìn)一步闡明氣味識(shí)別機(jī)制提供了重要依據(jù)。

3 氣味受體的表達(dá)和定位

基因表達(dá)和蛋白定位等信息有助于推測(cè)氣味受體的特異性功能，為后續(xù)功能研究提供理論基礎(chǔ)。目前主要利用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR(semi-quantitative reverse transcription PCR, RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、原位雜交(insituhybridization)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)等生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)手段分析OR基因的時(shí)空表達(dá)和ORs定位。

熒光原位雜交用于分析氣味受體RNA水平的組織定位，Hou等(2020)利用此方法發(fā)現(xiàn)半紫毛頂蛾Eriocraniasemipurpurella的氣味受體EsemOR3, EsemOR4和EsemOR5主要定位在識(shí)別性信息素的耳形感器內(nèi)部，因此推測(cè)這些受體可能參與了性信息素識(shí)別過程。此外，不同熒光染料標(biāo)記多種蛋白可以用來分析ORs之間或ORs與其他嗅覺蛋白之間的互作關(guān)系。Forstner等(2009)使用地高辛和生物素對(duì)多音天蠶Antheraeapolyphemus的ApolOR1和PBP基因分別進(jìn)行熒光標(biāo)記，結(jié)果表明ApolOR1和3個(gè)PBP基因均能在一種毛形感器中共表達(dá)，說明了PBPs與淋巴液中性信息素特異性結(jié)合并將其運(yùn)送至ApolOR1，進(jìn)而引發(fā)嗅覺反應(yīng)。Yang K等(2017)通過雙色原位雜交實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)煙青蟲H.assulta觸角上C類型毛形感器內(nèi)不同的神經(jīng)元內(nèi)可以共表達(dá)性信息素受體基因HassOR14b和HassOR6或者HassOR14和HassOR16，揭示了不同功能的PRs在同一類型毛形感器內(nèi)組合表達(dá)的分子機(jī)制；Pregitzer等(2019)報(bào)道沙漠蝗Schistocercagregaria的33個(gè)OR基因能夠與性信息素識(shí)別相關(guān)的感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)基因SNMP1 共表達(dá)，初步推測(cè)這些OR基因可能參與了沙漠蝗的性信息素識(shí)別過程。

免疫組織化學(xué)用于分析氣味受體蛋白水平上的組織定位，可以更為直觀地觀察氣味受體蛋白的組織分布情況。Benton等(2006)利用免疫組織化學(xué)方法證明了黑腹果蠅D.melanogasterOrco(OR83b)與OR43a互作形成復(fù)合體并在神經(jīng)元樹突上準(zhǔn)確定位并維持其穩(wěn)定性。Auer等(2020)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除果蠅DrosophilasechelliaOR22a后，通過免疫組織化學(xué)方法證明了OR22a在突變體觸角部位不能成功表達(dá)和定位，為進(jìn)一步闡明OR22a嗅覺功能提供了有利證據(jù)。與熒光原位雜交相比，免疫組織化學(xué)需要制備氣味受體的特異性抗體，而膜蛋白抗體制備相對(duì)復(fù)雜，因此氣味受體定位研究仍以原位雜交方法為主。

半定量RT-PCR和qRT-PCR常用于研究OR基因在不同組織、發(fā)育階段和性別中的表達(dá)模式。半定量RT-PCR方法相對(duì)簡(jiǎn)捷，主要根據(jù)電泳條帶的明暗程度反映OR基因的表達(dá)量，但該方法無法量化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR將基因表達(dá)量數(shù)值化，準(zhǔn)確度高于半定量檢測(cè)方法。至今為止，通過半定量RT-PCR和qRT-PCR方法解析了多數(shù)昆蟲氣味受體的表達(dá)譜，為后續(xù)功能特異性研究提供理論依據(jù)。大部分OR基因在成蟲期的觸角中高表達(dá)，少數(shù)在幼蟲期表達(dá)，如棉鈴蟲H.armigera、中國(guó)梨咯木虱C.chinensis和梨小食心蟲G.molesta(Dietal., 2017; Xuetal., 2019; Chenetal., 2020)。研究顯示，鱗翅目昆蟲雄蟲通過觸角上靈敏的嗅覺系統(tǒng)識(shí)別同種雌蟲釋放的特異性信息素來尋找合適的配偶，因此參與性信息素識(shí)別的PRs一般特異性地表達(dá)于雄蟲觸角(Fleischeretal., 2018; Liu YPetal., 2018; Bastin-Hélineetal., 2019; Liu XLetal., 2019)。OR基因除了在觸角內(nèi)高表達(dá)或特異性表達(dá)外，也有少部分OR基因在喙、產(chǎn)卵器和足等其他組織中表達(dá)(Chooetal., 2018; Duetal., 2018a; Guoetal., 2018)。如煙青蟲H.assulta氣味受體基因HassOR31在產(chǎn)卵器中表達(dá)量顯著高于觸角和其他組織中的表達(dá)量，經(jīng)體外功能驗(yàn)證表明該氣味受體可以幫助雌蟲精確選擇寄主植物作為產(chǎn)卵地點(diǎn)(Li RTetal., 2020)。

綜上所述，OR基因表達(dá)特異性與其生理功能密切相關(guān)，分析OR基因在不同組織、不同性別、不同發(fā)育階段的表達(dá)特性以及ORs在昆蟲組織中的定位情況，將為功能基因篩選提供理論依據(jù)。

4 氣味受體的功能研究方法

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)于ORs功能研究的方法逐漸多樣化，主要分為體內(nèi)和體外研究方法。常用的體外功能研究方法為爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)(TEVC)，利用轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合單感器記錄技術(shù)，以及細(xì)胞系異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合鈣離子成像技術(shù)。體內(nèi)功能研究方法有RNA干擾(RNAi)技術(shù)和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。本文查閱了2015-2019年昆蟲氣味受體功能鑒定的文獻(xiàn)，統(tǒng)計(jì)了利用不同研究方法鑒定ORs功能的文章數(shù)量(圖2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：體外功能研究方法在5年內(nèi)ORs功能研究中占比75.76%，其中爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)占比43.94%，其次是轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合單感器記錄技術(shù)占比19.70%，再次是HEK293細(xì)胞系異源表達(dá)系統(tǒng)(占10.61%)，該數(shù)據(jù)說明了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)在ORs功能研究中具有普遍適用性；體內(nèi)表達(dá)方法以CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)(12.12%)和RNAi技術(shù)(12.12%)為主。不同研究方法的作用機(jī)理和方法特點(diǎn)各不相同，下面將從功能研究方法的使用特點(diǎn)、應(yīng)用范圍和影響因素進(jìn)行詳盡的闡述，為ORs功能研究方法的選擇提供一定的借鑒作用。

圖2 2015-2019年昆蟲氣味受體功能鑒定方法發(fā)文統(tǒng)計(jì)

4.1 氣味受體的體外功能研究方法

4.1.1爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)：第一個(gè)完成功能鑒定的昆蟲氣味受體是黑腹果蠅D.melanogasterDmelOR43a，通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)證實(shí)了DmelOR43a能夠識(shí)別果實(shí)中常見的氣味分子環(huán)己酮、環(huán)己醇、苯甲醛和苯甲醇(Wetzeletal., 2001)。該系統(tǒng)是將體外合成的OR和Orco的cRNA共同注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，體外培養(yǎng)3～5 d，將氣味配體灌流通過爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行刺激，利用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄刺激前后的電流差，從而確定氣味受體與配體之間的功能。隨著該技術(shù)不斷地完善和改進(jìn)，目前已成為昆蟲氣味受體功能研究中最常用的體外研究方法。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015-2019年利用該技術(shù)對(duì)ORs功能的研究占所有研究方法的43.94%，該技術(shù)在2019年ORs研究中占比高達(dá)61.90%，且主要應(yīng)用于鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究(圖2)。在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，雙委夜蛾A.dissimilis氣味受體AdisOR1對(duì)性信息素(順)-9-十四碳烯醇[(Z)-9-tetradecenol]和(順)-9-(反)-12-十四碳烯二烯醇[(Z)-9-(E)-12-tetradecadienol] 具有強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)(Liu XLetal., 2019)；二點(diǎn)委夜蛾A.lepigone性信息素受體OR3特異識(shí)別性信息素(順)-7-十二碳烯乙酸酯[(Z)-7-dodecenyl acetate] (Zhang YNetal., 2019)；蘋果蠹蛾C.pomonella氣味受體CpomOR2a和CpomOR5均能被其次要性信息素組分(反)-8-(反)-10-十二碳二烯醇乙酸酯 [(E,E)-8, 10-dodecadien-1-yl acetate] 所激活(Tianetal., 2021)。該系統(tǒng)也適用于鱗翅目昆蟲普通氣味受體的配體篩選，如Wu H等(2019)借助該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)煙青蟲H.assulta氣味受體HassOR23特異性識(shí)別植物揮發(fā)物(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]而躲避天敵；Wang等(2020)通過該系統(tǒng)證明了煙青蟲H.assulta氣味受體HassOR67能夠識(shí)別煙草Nicotianatabacum揮發(fā)物壬醛(nonanal)進(jìn)而引誘雌成蟲產(chǎn)卵；Guo等(2021)利用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)全面測(cè)定了棉鈴蟲H.armigera44個(gè)氣味受體對(duì)67種寄主植物揮發(fā)物的反應(yīng)，鑒定了28個(gè)氣味受體的配體，繪制了棉鈴蟲氣味受體家族編碼寄主植物揮發(fā)物的功能圖譜，揭示了棉鈴蟲氣味受體通過組合編碼的方式識(shí)別復(fù)雜的寄主揮發(fā)物。爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅廣泛應(yīng)用于鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究，在其他目昆蟲中也有報(bào)道(Zhang RBetal., 2017; Zhang RBetal., 2019; Liu YPetal., 2020; Zhangetal., 2021)。Li HM等(2020)利用該系統(tǒng)檢測(cè)了大灰優(yōu)蚜蠅E.corollae氣味受體EcorOR25能夠特異性識(shí)別14種芳香族化合物，如丁香酚(eugenol)和甲基丁香酚(methyl eugenol)等，表明EcorOR25可能是大灰優(yōu)蚜蠅識(shí)別芳香族化合物的主要受體；Liu YP等(2020)的研究揭示了柑橘大實(shí)蠅B.minax氣味受體BminOR24能夠識(shí)別常見植物揮發(fā)物芳樟醇(linalool)，說明BminOR24可能參與了寄主識(shí)別等生命過程；Zhang等(2021)利用雙電極電壓鉗技術(shù)對(duì)3種盲蝽象性信息素受體功能進(jìn)行研究，結(jié)果表明綠盲蝽A.lucorum性信息素受體AlucOR2/51、苜蓿盲蝽A.lineolatusAlinOR4/6 和中黑盲蝽AdelphocorissuturalisAsutOR6均能夠識(shí)別性信息素組分(反)-2-己烯基丁酸酯[(E)-2-hexenyl butyrate]，而對(duì)另一個(gè)組分丁酸己酯(hexyl butyrate)反應(yīng)較弱，闡明了不同種盲蝽象性信息素受體對(duì)性信息素識(shí)別的分子機(jī)制。

爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)之所以成為目前應(yīng)用最廣的體外功能研究方法，得益于其細(xì)胞個(gè)體大、易培養(yǎng)、操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且注射氣味受體cRNA后能在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)并實(shí)現(xiàn)功能記錄(Wang Betal., 2016)，適用于氣味配體的快速篩選(Guoetal., 2021)。

4.1.2轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合單感器記錄技術(shù):轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)是繼爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)之后的第二大類體外功能研究方法，在2015-2019年ORs功能研究中占比19.70%(圖2)。該系統(tǒng)主要有兩個(gè)突變體系統(tǒng)，即果蠅“empty neuron”空神經(jīng)元系統(tǒng)和 “OR67dGAL4knock-in” 突變系統(tǒng)。Dobritsa等(2003)建立了果蠅 “empty neuron” 空神經(jīng)元系統(tǒng)，該系統(tǒng)敲除果蠅錐形感器內(nèi)嗅覺受體神經(jīng)元ab3A上表達(dá)的氣味受體基因OR22a和OR22b，從而獲得果蠅空神經(jīng)元 “△halo” 突變體，利用GAL4/UAS系統(tǒng)以O(shè)R22a的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Gal4的表達(dá)，進(jìn)一步使UAS驅(qū)動(dòng)下游異源OR基因在 “△halo” 空神經(jīng)元中表達(dá)，再利用單感器記錄技術(shù)記錄錐形感器ab3A神經(jīng)元對(duì)氣味配體的反應(yīng)。de Fouchier等(2017)利用該系統(tǒng)成功解析了海灰翅夜蛾S.littoralis氣味受體 SlitOR35, SlitOR4, SlitOR14, SlitOR17和SlitOR31的功能。

果蠅錐形感器 “空神經(jīng)元” 系統(tǒng)可用于大多數(shù)昆蟲氣味受體的功能鑒定，但不適用于毛形感器中表達(dá)的法尼醇受體(DmelOR83c)和鱗翅目性信息素受體的功能鑒定(Syedetal., 2006; Montagnéetal., 2012; Ronderosetal., 2014; Wang Betal., 2016, 2018)。研究發(fā)現(xiàn)在缺失昆蟲感覺神經(jīng)元膜蛋白SNMP1 的突變果蠅品系中，表達(dá)性信息素受體 DmelOR67d 的神經(jīng)元無法識(shí)別果蠅性信息素(順)-十八碳烯醇醋酸鹽(cis-vaccenyl acetate, cVA)，但轉(zhuǎn)入SNMP1 基因后對(duì)cVA的反應(yīng)恢復(fù)正常，這說明 SNMP1 對(duì)果蠅感受性信息素是必不可少的(Bentonetal., 2007)。不僅如此，SNMP1 對(duì)于鱗翅目昆蟲毛形感器中表達(dá)的PRs感受性信息素配體也是必需的(Syedetal., 2010; Breeretal., 2019; Lemkeetal., 2020; Liu Setal., 2020)。為此，研究人員開發(fā)了另一種果蠅突變系統(tǒng)，即 “OR67dGAL4knock-in” 突變系統(tǒng)(Kurtovicetal., 2007)。該系統(tǒng)利用GAL4/UAS將目的OR基因表達(dá)在果蠅at1毛形感器空神經(jīng)元中，再結(jié)合SSR技術(shù)記錄表達(dá)異源受體的神經(jīng)元的功能(Kurtovicetal., 2007)?！癘R67dGAL4knock-in” 突變系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于鱗翅目昆蟲PRs的配體篩選和功能研究。如蘋果蠹蛾C.pomonella受體CpomOR6a在轉(zhuǎn)基因果蠅毛形感器at1神經(jīng)元中表達(dá)時(shí)能夠靈敏地識(shí)別性信息素拮抗劑(反)-8-(反)-10-十二碳二烯-1-醇乙酸酯[(E,E)-8,10-dodecadien-1-yl acetate] (Cattaneoetal., 2017)；Wang B等(2018)利用該系統(tǒng)異源表達(dá)煙青蟲H.assulta、棉鈴蟲H.armigera和煙芽夜蛾Heliothisvirescens3個(gè)近緣種的性信息素受體OR13，結(jié)果顯示3種昆蟲的OR13均能夠特異性識(shí)別性信息素成分(順)-11-十六碳烯醛(cis-11-hexadecenal)。

轉(zhuǎn)基因果蠅技術(shù)為OR基因異源表達(dá)提供了觸角感器淋巴液等生理環(huán)境以及蛋白組件。該方法采用單感器記錄技術(shù)使得待測(cè)氣味分子以氣體形式進(jìn)入至感器內(nèi)部，更符合真實(shí)的細(xì)胞環(huán)境。然而該系統(tǒng)也存在一定的缺點(diǎn)，例如獲得轉(zhuǎn)基因果蠅品系過程復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng)，操作復(fù)雜、且難度較大(Wang Betal., 2016)。

Wang B等(2016, 2018)比較了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)在ORs功能研究上的適應(yīng)性，結(jié)果表明兩個(gè)研究方法得到的結(jié)果是一致的，說明了這兩個(gè)系統(tǒng)均適用于氣味受體功能研究。因此，在進(jìn)行ORs功能鑒定時(shí)，可以先采用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在體外快速篩選氣味受體對(duì)應(yīng)的配體，再結(jié)合轉(zhuǎn)基因果蠅異源表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步精確地鑒定氣味受體的功能，實(shí)現(xiàn)雙系統(tǒng)快速且準(zhǔn)確鑒定ORs與配體之間的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。使用不同表達(dá)系統(tǒng)鑒定ORs功能對(duì)溶劑選擇也有一定的要求，例如溶劑正己烷揮發(fā)性強(qiáng)，更適合于轉(zhuǎn)基因果蠅系統(tǒng)中對(duì)特定化合物激活的受體功能檢測(cè)；而石蠟油具有重復(fù)性好的特點(diǎn)，適合高通量篩選化合物；二甲基亞砜溶解性較好，是爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)的較為理想的溶劑。

4.1.3細(xì)胞系異源表達(dá)結(jié)合電生理技術(shù):細(xì)胞系異源表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合鈣離子成像方法也成功應(yīng)用于昆蟲氣味受體的功能研究。該技術(shù)原理是將構(gòu)建好的OR和Orco的基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系并啟動(dòng)瞬時(shí)表達(dá)，利用膜片鉗或者鈣離子成像技術(shù)檢測(cè)氣味受體對(duì)配體的反應(yīng)。常用細(xì)胞系主要包括人類胚腎細(xì)胞系(HEK293細(xì)胞系)和草地貪夜蛾S.frugiperda卵巢細(xì)胞系(Sf9細(xì)胞系)等。HEK293細(xì)胞系在異源細(xì)胞系表達(dá)中應(yīng)用最為廣泛，目前已在蘋果蠹蛾C.pomonella、紅醋栗穿孔蛾Lamproniacapitella和半紫毛頂蛾E.semipurpurella等昆蟲中成功應(yīng)用(Cattaneoetal., 2017; Yuvarajetal., 2018; Houetal., 2020)。除了常用的HEK293細(xì)胞系，Xu 等(2015)通過Sf9細(xì)胞系異源表達(dá)系統(tǒng)明確煙青蟲H.assulta性信息素受體HassOR13能夠特異性識(shí)別性信息素成分(順)-11-十六碳烯醛[(Z)-11-hexadecenal]。但有報(bào)道表明，Sf9細(xì)胞系異源表達(dá)OR基因系統(tǒng)中具有功能反應(yīng)的細(xì)胞比例較低(Corcoranetal., 2014)。

體外功能研究方法簡(jiǎn)便易行，但是缺乏體內(nèi)真實(shí)的細(xì)胞生理?xiàng)l件及細(xì)胞表達(dá)的上游環(huán)境(Miazzietal., 2019a, 2019b)。因此，研究人員通過在反應(yīng)體系中添加相應(yīng)的PBP，提高了性信息素受體對(duì)性信息素的敏感性和選擇性(Grosse-Wildeetal., 2006; Sunetal., 2013; Changetal., 2015; Zhang QHetal., 2017)。近期，Hou等(2020)系統(tǒng)地比較了兩種體外功能研究方法，結(jié)果表明借助爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)半紫毛頂蛾E.semipurpurellaEsemOR4能夠特異性識(shí)別性信息素成分(順)-6-壬烯-2-醇[(R,Z)-6-nonen-2-ol]，而HEK293細(xì)胞系表達(dá)系統(tǒng)則未能識(shí)別該配體，說明了爪蟾卵母細(xì)胞結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)更加能夠準(zhǔn)確地反映OR識(shí)別氣味配體的功能。

4.2 氣味受體體內(nèi)功能研究方法

盡管體外功能研究能夠記錄ORs的功能反應(yīng)特征，但ORs在昆蟲體內(nèi)的生理特性及其作用機(jī)理并不十分清楚。因此，體內(nèi)功能研究方法應(yīng)運(yùn)而生，為真實(shí)、準(zhǔn)確地研究氣味受體功能提供了新途徑。

4.2.1基因沉默技術(shù)：RNA干擾(RNA interference, RNAi)是基因沉默常用的技術(shù)手段。Fire等(1998)首次在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans中證明了雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)是基因沉默的有效方法。RNAi技術(shù)主要作用機(jī)制可分2步，1)切割外源dsRNA：dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶Dicer剪切成小干擾RNA(siRNA)；2)目的基因沉默：siRNA解鏈后，反義鏈與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合，再與目的基因mRNA 結(jié)合并將其降解，從而引起靶標(biāo)基因功能沉默(Bernsteinetal., 2001)。

dsRNA通常以注射、飼喂、浸泡和涂抹等方法進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，其中注射方式最為常用且效果最好。RNAi技術(shù)發(fā)展早且相對(duì)成熟，具有簡(jiǎn)單、便捷的特點(diǎn)，在半翅目和膜翅目昆蟲氣味受體功能驗(yàn)證研究中得以廣泛應(yīng)用。Zhang RB等(2017)發(fā)現(xiàn)注射dsApisOR5后的豌豆蚜Acyrthosiphonpisum喪失了其對(duì)蚜蟲報(bào)警信息素(反)-β-法尼烯[(E)-β-farnesene]的識(shí)別能力，說明ApisOR5在豌豆蚜識(shí)別報(bào)警信息素的過程中發(fā)揮著重要作用，為以該受體為靶標(biāo)篩選高效穩(wěn)定的蚜蟲驅(qū)避劑奠定了理論基礎(chǔ)；Wang YL等(2017)報(bào)道干擾荔枝蝽平腹小蜂AnastatusjaponicusAjapOR35基因后，其對(duì)具有產(chǎn)卵吸引效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)(反)-α-法尼烯[(E)-α-farnesene]和β-石竹烯(β-caryophyllene)的EAG 反應(yīng)值下降，說明AjapOR35可能與其寄主定位和產(chǎn)卵行為密切相關(guān)。

RNAi技術(shù)也具有一定的局限性，例如在鞘翅目昆蟲中基因沉默效率較高，但在鱗翅目昆蟲中干擾效果不太理想(胡少茹等, 2019; 曹松等, 2020)，主要原因是dsRNA易被鱗翅目昆蟲體內(nèi)的核酸降解酶降解，致使RNAi效率較低(Shuklaetal., 2016; Guanetal., 2018)。其次，當(dāng)外源合成的dsRNA/siRNA以飼喂、浸泡和涂抹等方法進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，需要穿透害蟲腸道圍食膜、細(xì)胞膜甚至體壁等屏障，進(jìn)而降低沉默效率。再次，雖然傳統(tǒng)的注射方式效果較好，但易對(duì)昆蟲造成損傷且不易操作。RNAi技術(shù)的另一個(gè)缺陷是具有時(shí)效性，沉默效果會(huì)隨著時(shí)間的推移慢慢消失，而且不能夠穩(wěn)定遺傳(Linetal., 2015; Chenetal., 2020)。隨著納米科學(xué)的不斷發(fā)展，納米材料作為一種dsRNA遞送載體，可以提高dsRNA穿透害蟲體壁等屏障的能力，提升沉默效率。相較于傳統(tǒng)的遞送策略，納米載體介導(dǎo)的RNAi遞送系統(tǒng)具有高效、穩(wěn)定、低劑量、緩釋等優(yōu)點(diǎn)(Yanetal., 2021)。因此，RNAi技術(shù)結(jié)合納米載體有望快速實(shí)現(xiàn)RNAi農(nóng)藥商品化，為害蟲防控提供了新思路。

4.2.2基因編輯技術(shù)：基因編輯是指利用核酸內(nèi)切酶在基因組的特定位置產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞自身的 DNA 損傷修復(fù)機(jī)制對(duì)切口位置進(jìn)行非同源末端連接或同源重組修復(fù)，從而產(chǎn)生基因插入、缺失等多種突變類型?；蚓庉嫾夹g(shù)已從第一代的鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)技術(shù)發(fā)展到第二代轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like efector nucleases, TALENs)技術(shù)，再到第三代CRISPR/Cas系統(tǒng)[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated proteins]。新興起的CRISPR/Cas9 技術(shù)依靠單鏈向?qū)NA(single-guide RNA, sgRNA)對(duì)原間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)上游約20 nt的靶序列識(shí)別，再通過Cas9核酸酶進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因組定點(diǎn)編輯。

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷完善，該技術(shù)已成功用于昆蟲傳統(tǒng)氣味受體共受體(Orco)和鱗翅目昆蟲性信息素受體(PRs)等的功能研究(圖2)。Fandino等(2019)敲除煙草天蛾M.sexta氣味受體共受體基因MsexOrco后，其對(duì)性信息素和寄主植物揮發(fā)物等氣味的電生理反應(yīng)顯著降低，說明了MsexOrco在煙草天蛾嗅覺識(shí)別過程中的必要性；敲除印度跳蟻Harpegnathossaltator的Orco基因后，其工蟻對(duì)信息素的感受能力明顯下降且突變體的觸角葉體積和嗅小球的數(shù)量明顯減少(Yanetal., 2017)。CRISPR/Cas9技術(shù)以其操作的便捷性，高效的基因編輯能力在鱗翅目昆蟲氣味受體功能研究中漸受青睞。Chang HT等(2017)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除棉鈴蟲H.armigera性信息素受體基因HarmOR16后，突變體雄蟲喪失了對(duì)(順)-11-十六碳烯醇[cis-11-hexadecenol]的趨避行為反應(yīng)，且不能區(qū)分雌蟲是否性成熟，進(jìn)而與未成熟的雌蟲進(jìn)行交配，導(dǎo)致后代存活率降低。該項(xiàng)研究結(jié)果揭示了HarmOR16受體參與調(diào)控棉鈴蟲H.armigera選擇最優(yōu)交配時(shí)間的分子機(jī)制。Garczynski等(2017)等通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)蘋果蠹蛾C.pomonella性信息素受體基因CpomOR1-/-突變體雌蟲的產(chǎn)卵量及卵孵化率均顯著下降，證明了CpomOR1與其雌蟲的生殖能力密切相關(guān)。Liu XL等(2020)利用 “體外(爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))+體內(nèi)(CRISPR/Cas9技術(shù))” 雙系統(tǒng)證實(shí)了PxylOR35和PxylOR49共同決定小菜蛾P(guān).xylostella雌蛾的產(chǎn)卵選擇性，揭示了小菜蛾雌蟲利用植物揮發(fā)物定位寄主進(jìn)行產(chǎn)卵的關(guān)鍵分子機(jī)制。Guo等(2021)發(fā)現(xiàn)鱗翅目中存在一個(gè)高度保守的直系同源基因(棉鈴蟲H.armigera氣味受體基因HarmOR42及其同源基因)且形成獨(dú)特的進(jìn)化分支，并通過“體外(爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))+體內(nèi)(CRISPR/Cas9技術(shù))” 雙系統(tǒng)證明了棉鈴蟲氣味受體HarmOR42能夠特異識(shí)別被子植物花香的主要揮發(fā)物苯乙醛(phenylacetaldehyde)，說明該受體在鱗翅目昆蟲尋找寄主植物特別是花的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。CRISPR/Cas9技術(shù)在其他目昆蟲中也有報(bào)道，Guo等(2020)借助 “體外(爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))+體內(nèi)(CRISPR/Cas9技術(shù))” 雙系統(tǒng)證實(shí)了LmigOR35是東亞飛蝗L.migratoria群聚信息素4-乙烯基苯甲醚(4-vinylanisole)的特異性受體，繼而對(duì)東亞飛蝗群居信息素功能進(jìn)行了全面而充分的鑒定和驗(yàn)證。

與基因沉默技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)能夠徹底沉默目的基因表達(dá)，因此結(jié)果更為準(zhǔn)確且能穩(wěn)定遺傳。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)剪切靶基因上多個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)更加靈活(Gaoetal., 2016)。但也具有一定局限性，例如基因編輯技術(shù)步驟較為復(fù)雜，需要通過多代篩選來獲得純合突變品系，操作過程對(duì)儀器平臺(tái)以及操作人員熟練程度要求較高。同時(shí)，該系統(tǒng)存在一定的脫靶現(xiàn)象，但通過兩個(gè)sgRNA靶標(biāo)一個(gè)基因可以有效降低脫靶率(Kleinstiveretal., 2016; Zhang DBetal., 2017)。

5 小結(jié)與展望

昆蟲嗅覺系統(tǒng)在昆蟲行為選擇過程中發(fā)揮著重要作用，其中氣味受體是外周神經(jīng)系統(tǒng)中接收嗅覺識(shí)別信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，研究ORs的功能對(duì)于解析昆蟲嗅覺編碼機(jī)制十分重要。自21世紀(jì)始，關(guān)于昆蟲ORs的研究論文層出不窮。Montagné等(2015)綜述了2000-2014年(15年)期間昆蟲ORs的研究進(jìn)展以及研究技術(shù)的發(fā)展歷程。在此基礎(chǔ)上，本文針對(duì)2015年以來(近5年)有關(guān)昆蟲OR研究工作的發(fā)文情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，歸納總結(jié)了昆蟲OR基因鑒定、表達(dá)定位、蛋白結(jié)構(gòu)等的研究方法、原理和特點(diǎn)等。分析結(jié)果顯示，2015-2019年利用基因組測(cè)序技術(shù)在27種昆蟲中鑒定了2 543個(gè)OR基因，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)從89種昆蟲中鑒定了5 111個(gè)OR基因(表1; 表2)，為昆蟲ORs結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定基礎(chǔ)。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，利用冷凍電鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)了昆蟲ORs蛋白結(jié)構(gòu)的解析，為揭示大分子蛋白生物結(jié)構(gòu)與功能互作機(jī)制提供了技術(shù)支撐。此外，本文重點(diǎn)綜述了昆蟲氣味受體功能研究常用技術(shù)的原理和特點(diǎn)，分析了各自的優(yōu)勢(shì)和不足，列舉了重要害蟲ORs的研究進(jìn)展，為ORs研究方法的選擇提供一定的借鑒作用(Wang Betal., 2016, 2018; Caoetal., 2020; Houetal., 2020)。

盡管昆蟲氣味受體功能研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但是仍有以下幾個(gè)方面需要深入研究：1)昆蟲體內(nèi)擁有大量氣味受體基因，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，應(yīng)繼續(xù)挖掘重大農(nóng)林害蟲的嗅覺基因，并且針對(duì)每一個(gè)特異性基因開展功能研究，全面系統(tǒng)揭示害蟲識(shí)別寄主植物、交配和產(chǎn)卵以及躲避天敵等行為的分子機(jī)制。發(fā)展更加簡(jiǎn)便快捷、高靈敏度且重復(fù)性好的基因功能驗(yàn)證手段仍是未來一段時(shí)間內(nèi)的主要目標(biāo)。2)目前鱗翅目昆蟲中的PRs功能研究取得了較大的進(jìn)展，但其他目昆蟲的ORs功能研究仍然較少。近年來，在害蟲識(shí)別配偶和寄主植物的嗅覺分子機(jī)制進(jìn)行了深入研究，而有關(guān)昆蟲如何協(xié)同識(shí)別性信息素和寄主植物揮發(fā)物的分子機(jī)制尚未明確。此外，天敵昆蟲與害蟲之間的氣味識(shí)別機(jī)制研究仍不夠深入，挖掘天敵識(shí)別害蟲的關(guān)鍵嗅覺基因，有助于篩選天敵昆蟲行為調(diào)節(jié)劑，降低靶標(biāo)害蟲危害。3)氣味受體功能研究正從基因水平轉(zhuǎn)向蛋白結(jié)構(gòu)層面，冷凍電鏡技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了昆蟲氣味受體三級(jí)結(jié)構(gòu)的解析。氣味受體蛋白晶體結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白組學(xué)等方法有助于揭示氣味分子與ORs的結(jié)合機(jī)制及其激活模式，從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度深入探討每一種昆蟲如何演化出自己的獨(dú)特受體，從而特異性識(shí)別寄主植物、配偶和天敵等化學(xué)線索。4)盡管我們針對(duì)氣味受體功能基礎(chǔ)研究取得了一些進(jìn)展，但如何將這些理論成果應(yīng)用于害蟲防控更值得我們深入思考。RNAi技術(shù)在害蟲防治領(lǐng)域已取得突破性進(jìn)展，但由于dsRNA合成成本較高，少有成熟產(chǎn)品問世。隨著合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，通過改造工程菌有望實(shí)現(xiàn)低成本、大規(guī)模合成dsRNA，這一技術(shù)為開發(fā)新型昆蟲行為調(diào)節(jié)劑提供了新視角。同時(shí)，基因編輯技術(shù)的發(fā)展為基于轉(zhuǎn)基因昆蟲進(jìn)行害蟲防治提供了新途徑，通過敲除害蟲關(guān)鍵靶標(biāo)基因，干擾害蟲交配和定位寄主，壓低田間蟲口數(shù)量，實(shí)現(xiàn)綠色防控。