○湯北偉

2021年6月，我縣半城鎮(zhèn)一名養(yǎng)殖戶塘口的河蟹和小龍蝦出現(xiàn)了死亡，塘口面積60畝，水草部分發(fā)黑腐爛，河蟹放養(yǎng)密度1400只/畝，塘口自帶小龍蝦，河蟹每天死亡50-60只，吃食明顯減少，病蟹活力較差，小龍蝦也有少量死亡。筆者對病蟹、病蝦的肝胰腺進行了病原分離、16SrD‐NA序列分析鑒定，并開展藥敏試驗；對病蝦、病蟹的鰓進行白斑綜合病毒的提取及PCR法分子檢測技術進行鑒定，采用對癥施藥、調水等方法成功處理病情。

1 方法

1.1 病原菌的分離、鑒定及藥敏試驗

（1）病原菌的分離：用滅菌棉簽蘸取河蟹、小龍蝦肝胰腺，均勻涂于營養(yǎng)瓊脂和TCBS培養(yǎng)基上，分別置于28℃、37℃恒溫培養(yǎng)18-24小時后，觀察菌落形態(tài)，并挑取優(yōu)勢菌株劃線接種在營養(yǎng)瓊脂平板和3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，分別置于28℃ 、37℃ 恒溫培養(yǎng)18-24小時。

（2）細 菌的鑒定：把分離出的細菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司，利用細菌16SrDNA序列測序的方法對細菌進行種屬鑒定。

（3）藥敏試驗：通過南京菲恩醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的藥敏板進行藥敏試驗，分別測定細菌分離株對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉的敏感程度。

1.2 白斑綜合病毒核酸提取及檢測

從病蟹、病蝦中取約100mg鰓組織，按照生工生物工程（上海）股份有限公司的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒的說明進行DNA提取，對白斑綜合病毒DNA樣本采用《GB/T28630.2-2012白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測法》進行檢測。PCR擴增體系總量為50μL，分 別 為 :25μLMixTaq 酶（Takara），18μL無菌水，1μL正向引物，1μL反向引物，5μL模板。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結果

2.1 病原菌鑒定

通過細菌16SrDNA序列測序的方法，從病蟹中分離的細菌為維氏氣單胞菌、擬態(tài)弧菌，從病蝦中分離的細菌為弗氏檸檬酸桿菌。

2.2 病原菌的藥敏試驗結果

3株細菌對抗菌藥物的最小抑菌濃度如表1所示。

表1 3株細菌對抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照表（單位：μg/mL）

參照2013年抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準，維氏氣單胞菌、擬態(tài)弧菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。弗氏檸檬酸桿菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對甲砜霉素中敏，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。

2.3 白斑綜合病毒PCR檢測結果

PCR檢測結果顯示病蝦、病蟹都感染了白斑綜合病毒，如圖1所示。

圖1 白斑綜合病毒PCR檢測結果

M:DNAMarker（自上到下依次 為 2000、1000、750、500、250、100bp）；1.陰性對照；2.陽性對照；3.小龍蝦樣本；4.河蟹樣本

3 分析與治療

從病蟹中分離到維氏氣單胞菌、擬態(tài)弧菌，這兩種細菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥。從病蝦中分離到的弗氏檸檬酸桿菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟甲喹均敏感，對甲砜霉素中敏，對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥，PCR結果表明病蟹和病蝦都感染了白斑綜合病毒。

對該塘口的死蝦、死蟹，在遠離養(yǎng)殖塘處深度掩埋，對于腐爛的水草要及時撈出，適當換水，并積極治療。該塘口死亡數(shù)量約1只/畝，治療方法以改善塘口環(huán)境為主。把水位降至50cm，第1天用強氧化底改1次，過硫酸氫鉀粉劑（含量30%）250g/畝；第2天使用聚維酮碘（含量10%），500mL用2-3畝；第3天停藥一天；第4天使用硫化氫氧化細菌改善塘底環(huán)境，方法為：水位50cm，每畝用量為0.4kg，干撒，4天用一次，連用4次。治療期間要減少投料，并在飼料中添加殼聚糖、多維增加河蟹抵抗力。通過本次治療，河蟹、龍蝦的死亡情況明顯改善。

水溫20-30℃時，小龍蝦極易感染白斑綜合病毒，該河蟹塘口由于清塘不徹底，塘口中自帶的龍蝦感染白斑綜合病毒后，傳染給河蟹，造成河蟹感染白斑綜合病毒。下年度清塘時，應加滿水，水位淹沒所有的龍蝦洞，用菊酯類藥物徹底清塘，可防止在河蟹養(yǎng)殖過程中混入小龍蝦。