喬 璐，楊 艷，唐代詩，杜 婷，顧 勇

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，主要來源于葡萄、花生和桑椹等植物，其中葡萄中含量較高。研究表明，白藜蘆醇具有降低血小板聚集、預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的作用，同時(shí)還可以抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如食管癌、乳腺癌和肺癌等。目前，白藜蘆醇如何影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及其具體機(jī)制尚不明確。本文通過體外實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響及其對結(jié)腸癌細(xì)胞MyD88/TLR4/NF-kB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑 HT-29、sw480和 LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。白藜蘆醇、VEGF、MyD88、TRL4、NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3抗體均購于美國Santa Cruz公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒與引物均購于日本寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞體外培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞(10/ml)培養(yǎng)在75 cm組織培養(yǎng)瓶，設(shè)定為：對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組(白藜蘆醇0、25、50、100 μmol/L)處理結(jié)腸癌細(xì)胞，處理時(shí)間為24 h。

1.2.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞培養(yǎng)后利用甲醛固定，加入0.1% Triton X-100通透細(xì)胞膜。根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書加入TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌后加入顯色液。陽性表達(dá)為凋亡細(xì)胞核呈棕褐色(正常細(xì)胞核為藍(lán)色)。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，利用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析測量軟件分析，計(jì)數(shù)每張照片陽性表達(dá)面積及累積光密度。

1.2.3 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中VEGF表達(dá) 收集各組處理后的對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后再4 ℃ 3000 r/min離心14 min，收集細(xì)胞上清液。參照ELISA試劑盒說明書檢測0、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇處理后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)變化，每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 檢索基因文庫中所要檢測目的基因的cDNA序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)，由日本寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.5 Western blot檢測 收集各組處理后的對數(shù)生長期的HT-29、sw480和 LoVo細(xì)胞蛋白，并用BCA法進(jìn)行定量。各組各取30 μg樣品置于聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。用2 ml的BSA封閉液封閉1 h，再加入2 ml MyD88、TLR4和NF-kB、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3和β-actin (1∶1000)一抗后4 ℃孵育過夜，次日通過ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。

1.2.6 RT-PCR 根據(jù)Trizol說明書提取對照組和不同劑量白藜蘆醇處理組細(xì)胞中的總RNA，將提取的總RNA在65 ℃孵育5 min，再4 ℃孵育2 min。反轉(zhuǎn)錄利用Prime Script RT試劑盒完成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒完成。將對照組的一個(gè)樣品作為參照，其余樣品均按下列公式計(jì)算與參照的比值，各組之間對比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。公式：ΔΔ=(-)-(-)，目的mRNA的量=2。

2 結(jié) 果

2.1 不同劑量白藜蘆醇處理組結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡結(jié)果 與對照組相比，隨著白藜蘆醇劑量的增加，結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、sw480和 LoVo的凋亡率顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在HT-29和LoVo細(xì)胞系中，低劑量處理組與對照組凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組與對照組凋亡率對比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。ELISA檢測結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇劑量的增高，結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、sw480和 LoVo上清液中VEGF蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。在sw480和LoVo細(xì)胞系中，低劑量處理組與對照組VEGF表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，中、高劑量組與對照組VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，表2)。

2.2 不同劑量白藜蘆醇處理組細(xì)胞凋亡關(guān)鍵分子表達(dá)變化 與對照組相比，隨著白藜蘆醇劑量的增高，結(jié)腸癌 HT-29、sw480和 LoVo細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表達(dá)明顯降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表達(dá)明顯升高，呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，圖1，表3)。

2.3 不同劑量白藜蘆醇處理組MyD88/TLR4/NF-kB信號通路中關(guān)鍵分子表達(dá)變化 與對照組相比，中高劑量組隨著白藜蘆醇劑量的增高，結(jié)腸癌HT-29、sw480和LoVo細(xì)胞中MyD88、TLR4和NF-kB的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05，圖1，表3)。低劑量組與對照組相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與處理劑量及作用時(shí)間有關(guān)。

3 討 論

白藜蘆醇，又名芪三酚，3,4’,5-三羥基芪。目前研究已證實(shí)，白藜蘆醇具有抑制腫瘤細(xì)胞血管生長、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡分化，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。對肝癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌、前列腺癌等多種腫瘤有明確的抗腫瘤作用，且白藜蘆醇對正常細(xì)胞無毒性或僅具有較低毒性，有望成為新一代的抗腫瘤藥物。但其對結(jié)腸癌的具體作用和機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白A1表達(dá)，參與 p53 信號通路激活所致的細(xì)胞凋亡和增殖阻滯作用。p53 信號通路中的 Bcl-2 和Bax蛋白間的比例決定腫瘤細(xì)胞是否接受凋亡發(fā)生的信號。Bcl-2 家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，通過阻止線粒體細(xì)胞色素C 的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用；Bax是 Bcl-2 家族中參與細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要成員，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激促發(fā)凋亡機(jī)制時(shí)，Bax從胞質(zhì)遷移至線粒體和核膜，導(dǎo)致包括細(xì)胞色素C在內(nèi)的多種促凋亡蛋白的釋放，并激活caspases，產(chǎn)生caspases級聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行細(xì)胞凋亡；而caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行分子之一，可以剪切細(xì)胞凋亡過程中的許多關(guān)鍵蛋白。白藜蘆醇能有效抑制 Bcl-2 蛋白的表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，促進(jìn)caspase-9和caspase-3表達(dá)，加速Hela細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究通過TUNEL法檢測白藜蘆醇對于結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡，并呈劑量依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白含量表達(dá)明顯降低，Bax和cleaved-Caspase 3的mRNA和蛋白含量表達(dá)明顯升高，呈劑量依賴性。我們還進(jìn)一步檢測了白藜蘆醇對于結(jié)腸癌細(xì)胞VEGF的影響，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理后結(jié)腸癌細(xì)胞上清液中VEGF蛋白表達(dá)明顯降低，提示白藜蘆醇可能還通過影響結(jié)腸癌血管生成而抑制腫瘤進(jìn)展。

多項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇可通過激活 p53 依賴性和非依賴性途徑、Fas依賴性途徑、Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信號通路誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。經(jīng)典的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MyD88/TLR4/NF-κB參與激活機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MyD88/TLR4/NF-kB信號通路參與多種腫瘤的多個(gè)病理生理學(xué)過程。MyD88含有TLR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，與Toll的結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)而募集白介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor associate kinase, IRAK),引起IRAK自身磷酸化，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放多種因子等一系列效應(yīng)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)外研究結(jié)果顯示TLR4在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床 TNM分期有關(guān)，且與腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)和微血管密度有關(guān)，提示TLR4可能在促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和間質(zhì)血管新生方面起作用，進(jìn)而影響結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期。而白藜蘆醇對于結(jié)腸癌MyD88/TLR4/NF-kB信號通路的作用有待進(jìn)一步研究。本研究中利用白藜蘆醇處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，細(xì)胞中MyD88、TLR4和NF-kB蛋白和mRNA水平均顯著下降，且呈劑量依賴性，提示白藜蘆醇能夠通過抑制MyD88/TLR4/NF-kB信號通路而參與結(jié)腸癌惡性生物學(xué)行為的調(diào)控。

綜上所述，本研究初步探討了白藜蘆醇通過抑制結(jié)腸癌MyD88/TLR4/NF-kB信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為白藜蘆醇輔助治療結(jié)腸癌提供了理論依據(jù)。但本研究僅對白藜蘆醇體外的作用進(jìn)行了分析研究，需要進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的作用。