于春雷， 李 旭， 孫文松

(1.遼寧省農(nóng)科院藥用植物研究所， 遼寧 遼陽(yáng) 111000； 2.遼寧省經(jīng)濟(jì)作物研究所， 遼寧 遼陽(yáng) 111000)

遼細(xì)辛(Asarumheterotropoidesvar.manshuricum(Maxim.)Kitag.)為馬兜鈴科細(xì)辛屬多年生草本植物[1]。具特異辛香氣味，根入藥，有解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅、溫肺化飲的功效。臨床上常用于治療風(fēng)寒頭痛、痰飲咳喘、關(guān)節(jié)疼痛、鼻塞、牙痛等癥[2]。遼細(xì)辛為東北著名的道地中藥材，應(yīng)用歷史悠久，需求剛性強(qiáng)。除藥用外，遼細(xì)辛在化工業(yè)方面也得以廣泛應(yīng)用，常用于靶向藥物、日用品、香精、殺蟲(chóng)劑、綠色農(nóng)藥等產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[3-4]。需求量的增加促進(jìn)了種植面積擴(kuò)大，但近年來(lái)遼細(xì)辛藥材商品質(zhì)量卻逐年下降，種植區(qū)域也呈現(xiàn)集中趨勢(shì)。經(jīng)實(shí)地考察發(fā)現(xiàn)，氣候因素、品種特性退化以及種子質(zhì)量參差不齊，造成了遼細(xì)辛藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的不均一和種植區(qū)域的改變。因此，通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地遼細(xì)辛種子特性分析，建立遼細(xì)辛種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為發(fā)掘良種區(qū)域、保障優(yōu)質(zhì)種子種苗的供應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)市售種子規(guī)范化奠定理論基礎(chǔ)，最終實(shí)現(xiàn)從中藥材產(chǎn)業(yè)鏈源頭把控藥材品質(zhì)的目的。

本研究參考GB/T 3543—1995 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程[5]，在遼細(xì)辛道地產(chǎn)區(qū)收集13份種子，進(jìn)行凈度、千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、含水量、生活力指標(biāo)的測(cè)定，應(yīng)用現(xiàn)代統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析凝練種子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[6-8]。在對(duì)不同產(chǎn)地遼細(xì)辛種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)的基礎(chǔ)上，對(duì)種植區(qū)域地理位置與種子品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，為發(fā)掘良種區(qū)域，保護(hù)良種資源提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果對(duì)提高藥材產(chǎn)量和質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本、促進(jìn)遼細(xì)辛規(guī)范化種植以及推動(dòng)遼細(xì)辛GAP基地建設(shè)均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1供試種子

2020年6月于遼細(xì)辛東北道地產(chǎn)區(qū)采集的13份遼細(xì)辛種子。經(jīng)遼寧省農(nóng)科院藥用植物研究所中藥材研究室鑒定為馬兜鈴科植物遼細(xì)辛(Asarumheterotropoidesvar.manshuricum(Maxim.)Kitag.)的成熟種子。種子采集后，去除果皮陰干，置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏，于1個(gè)月內(nèi)完成各項(xiàng)檢測(cè)。供試種子信息見(jiàn)表1。

表1 遼細(xì)辛種子信息Table 1 Information of A. heterotropoides seeds

1.1.2儀 器

RQH-250型人工氣候箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，MGC-250型光照培養(yǎng)箱(上海鰲珍儀器制造有限公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，ME 204/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.1.3試 劑

純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，無(wú)水乙醇(遼寧泉瑞試劑有限公司)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(北京酷來(lái)搏科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1凈度分析

按照GB/T 3543 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 凈度分析的規(guī)定，凈度分析試驗(yàn)樣品應(yīng)至少含有2 500個(gè)種子單位的重量。采用“四分法”取樣，對(duì)于不同產(chǎn)地的遼細(xì)辛種子分別稱(chēng)取60 g。將種子置于操作臺(tái)白板之上，分離樣品中其他植物種子和雜質(zhì)，將分離后的遼細(xì)辛凈種子、雜質(zhì)分別稱(chēng)重，每個(gè)產(chǎn)地重復(fù)3次，計(jì)算種子凈度，重型混雜物進(jìn)行結(jié)果換算。

種子凈度(%)=[凈種子重量/(凈種子重量+其他種子重量+雜質(zhì)重量)]×100%。

1.2.2含水量測(cè)定

按照GB/T 3543 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測(cè)定的規(guī)定，采用低恒溫(105±2)℃烘干法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含水量。

種子水分(%)=[(M2-M3)/(M2-M1)]×100%。

式中：M1為干燥樣品盒重量(g)；M2為干燥樣品盒和烘前樣品總重量(g)；M3為干燥樣品盒和烘后樣品總重量(g)。

1.2.3千粒重測(cè)定

對(duì)凈度分析后的樣品種子分別采用百粒法、五百粒法和千粒法測(cè)定其重量，每種方法重復(fù)3次，比較平均值與變異系數(shù)。

1.2.4生活力測(cè)定

稱(chēng)取0.25 g TTC溶解于少許95%乙醇后，用蒸餾水稀釋并定容至250 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0，配置成0.1%TTC溶液備用。在不同產(chǎn)地的種子中隨機(jī)選取50粒，重復(fù)3次，浸泡6 h。用解剖刀將種子縱向切開(kāi)置于染色液中常溫染色18 h[9]，取出后用清水沖洗1～2次，觀察種子染色情況。種子縱切面全部或大部分被染成紅色的即為具有生活力的種子，沒(méi)被染色的為失去生活力的種子。

1.2.5發(fā)芽率測(cè)定

按照GB/T 3543 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)的規(guī)定，選用雙層濾紙作為發(fā)芽床。在不同地區(qū)的遼細(xì)辛凈種子中隨機(jī)抽取300粒，3次重復(fù)，每次重復(fù)100粒。將種子均勻擺放于發(fā)芽床上，置于溫度15 ℃，光照/黑暗(12 h/12 h)的MGC-250型光照培養(yǎng)箱中，從第1粒種子發(fā)芽開(kāi)始，每隔10 d記錄種子發(fā)芽數(shù)，至第5周結(jié)束，計(jì)算平均發(fā)芽率[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Exce 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和聚類(lèi)分析，根據(jù)分析結(jié)果劃分遼細(xì)辛種子等級(jí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地遼細(xì)辛種子各指標(biāo)分析

2.1.1凈度與含水量分析

表2表明，不同來(lái)源的遼細(xì)辛種子凈度差異顯著(p<0.05)，凈度范圍在87.81%～98.31%之間。有8份樣品凈度達(dá)到92%以上，占檢測(cè)樣品的61.54%。遼細(xì)辛種子中雜質(zhì)主要為干癟種子，其他植物種子等雜質(zhì)較少，因此種子凈度間接反映了種子成熟度，是種子品質(zhì)的重要影響因素。13份樣品中來(lái)自吉林通化快大茂鎮(zhèn)、通化富江鄉(xiāng)、通化柳河向陽(yáng)鄉(xiāng)的3份樣品和遼寧新賓北四平鄉(xiāng)、旺門(mén)清鎮(zhèn)、紅升鄉(xiāng)的3份樣品種子凈度均達(dá)到了95%以上，說(shuō)明上述地區(qū)采集的種子成熟度較高，品質(zhì)較好。含水量的測(cè)定結(jié)果表明，不同來(lái)源的遼細(xì)辛種子含水量在10.90%～12.19%區(qū)間內(nèi)。方差分析表明，遼寧省撫順市新賓縣響水河鄉(xiāng)、平頂山鎮(zhèn)、木奇鎮(zhèn)，遼寧省撫順市清原縣英額門(mén)鎮(zhèn)，遼寧省丹東市寬甸縣下露河朝鮮族鄉(xiāng)的5份種子含水量顯著高于遼寧省撫順市新賓縣北四平鄉(xiāng)和吉林省通化市柳河縣向陽(yáng)鄉(xiāng)，其他來(lái)源種子間差異均不顯著。

表2 遼細(xì)辛種子凈度和含水量分析Table 2 Clarity and water content analysis of A. heterotropoides seeds

2.1.2千粒重分析

表3表明，百粒重、五百粒重、千粒重3種方法測(cè)定千粒重在3.547 8～4.813 0 g之間，平均值為4.370 9 g。不同來(lái)源遼細(xì)辛種子間千粒重差異顯著(p<0.05)，吉林通化快大茂鎮(zhèn)、通化富江鄉(xiāng)、通化柳河向陽(yáng)鄉(xiāng)的3份樣品和遼寧新賓北四平鄉(xiāng)、旺門(mén)清鎮(zhèn)、紅升鄉(xiāng)、永陵鎮(zhèn)的4份種子的千粒重均顯著高于其他地區(qū)。3種方法測(cè)定的遼細(xì)辛種子千粒重變異系數(shù)最大值為2.76%，說(shuō)明3種方法均適用于遼細(xì)辛種子重量的測(cè)定，這與郭靖等[7]對(duì)遼細(xì)辛千粒重測(cè)定方法的研究結(jié)論相同。但本試驗(yàn)中千粒重法變異系數(shù)均在1.55%以下，在測(cè)定中可作為優(yōu)選方法。

表3 不同測(cè)定方法的遼細(xì)辛種子千粒重Table 3 The 1000-seed weight of A. heterotropoides seeds determined by different methods

2.1.3生活力和發(fā)芽率分析

表4表明，13份遼細(xì)辛種子生活力范圍為62.67%～93.67%，平均值為80.16%。不同來(lái)源遼細(xì)辛種子生活力差異顯著(p<0.05)，其中吉林省的3份種子生活力均在93%以上，顯著高于其他來(lái)源的種子。遼寧新賓北四平鄉(xiāng)、響水河鄉(xiāng)、旺清門(mén)鎮(zhèn)、紅升鄉(xiāng)、永陵鎮(zhèn)的5份種子生活力達(dá)到82%以上。種子生活力受收獲、加工、存儲(chǔ)等外在因素以及種子特性和種子個(gè)體發(fā)育等內(nèi)在因素的共同影響。此次實(shí)地采種過(guò)程中，最大限度地保證外在影響因素的一致性，因此本研究中內(nèi)因是種子生活力差異性的主要影響因素。13份種子發(fā)芽率在52.50%～93.13%之間，平均值為75.26%。不同來(lái)源遼細(xì)辛種子間發(fā)芽率差異顯著(p<0.05)，吉林省的3份種子的發(fā)芽率均顯著高于其他地區(qū)，其中吉林柳河向陽(yáng)鄉(xiāng)和吉利通化富江鄉(xiāng)的種子發(fā)芽率達(dá)到92%以上，占測(cè)試種子總數(shù)的15.38%。吉林通化快大茂鎮(zhèn)、遼寧新賓北四平鄉(xiāng)、遼寧新賓旺清門(mén)鎮(zhèn)、遼寧新賓紅升鄉(xiāng)的種子發(fā)芽率均達(dá)到80%以上，占測(cè)試種子的30.77%。

表4 遼細(xì)辛種子生活力和發(fā)芽率分析Table 4 Analysis of viability and germination rate of A. heterotropoides seeds

2.2 遼細(xì)辛種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定

2.2.1檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)13份種子的5項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)與采集地地理坐標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。表5表明，質(zhì)量指標(biāo)中凈度、千粒重、發(fā)芽率和生活力之間呈極顯著正相關(guān)性，含水量與其他指標(biāo)間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明5項(xiàng)指標(biāo)均為遼細(xì)辛種子等級(jí)劃分中的重要依據(jù)。其中發(fā)芽率與生活力相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.988，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的可操作性，將兩項(xiàng)指標(biāo)合并為一項(xiàng)生活力，作為種子等級(jí)劃分的主要指標(biāo)之一。因含水量受環(huán)境影響較大，加之遼細(xì)辛種子具有頑拗特性，測(cè)定其安全水標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于種子等級(jí)劃分更為重要，故含水量不作為主要指標(biāo)。采集地地理坐標(biāo)與種子質(zhì)量指標(biāo)的相關(guān)性分析表明，種子凈度與海拔呈顯著相關(guān)，發(fā)芽率與經(jīng)度呈顯著相關(guān)，生活力與經(jīng)緯度顯著相關(guān)，說(shuō)明種子質(zhì)量存在顯著的地域差異，因此，本研究中將凈度、千粒重、生活力作為遼細(xì)辛種子質(zhì)量等級(jí)劃分的主要指標(biāo)，含水量和采集地區(qū)作為參考指標(biāo)。

表5 種子各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of each index in seed

2.2.2檢測(cè)指標(biāo)系統(tǒng)聚類(lèi)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)遼細(xì)辛種子的5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，聚類(lèi)方法采用組間鏈接法，區(qū)間選擇平方歐氏距離。圖1表明，13份種子在閾值為10處聚為2類(lèi)。第1類(lèi)包括吉林不同來(lái)源的3份種子與遼寧新賓縣旺清門(mén)鎮(zhèn)、響水河鄉(xiāng)、紅升鄉(xiāng)、永陵鎮(zhèn)、北四平鄉(xiāng)的5份種子。第2類(lèi)包括遼寧撫順新賓平頂山鎮(zhèn)、紅廟子鄉(xiāng)、木奇鎮(zhèn)，清原英額門(mén)鎮(zhèn)和丹東市寬甸下露河朝鮮族鄉(xiāng)的5份種子。

圖1 遼細(xì)辛種子5項(xiàng)指標(biāo)系統(tǒng)聚類(lèi)分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis of five indexes in A. heterotropoides seeds

2.2.3種子質(zhì)量等級(jí)劃分

對(duì)遼細(xì)辛種子質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行K-平均值聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 種子質(zhì)量指標(biāo)K-平均值聚類(lèi)分析Table 6 K-mean clustering analysis of seed quality index

綜合每項(xiàng)分析結(jié)果及K-聚類(lèi)分析確定的各指標(biāo)范圍，以種子的凈度、千粒重、生活力為分級(jí)指標(biāo)，將遼細(xì)辛種子分為3級(jí)，結(jié)果見(jiàn)表7。以最低定級(jí)作為分級(jí)原則，13個(gè)不同產(chǎn)地的遼細(xì)辛種子分為一級(jí)種子2個(gè)，二級(jí)種子6個(gè)，三級(jí)種子5個(gè)。

表7 種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table 7 Seed quality grading standard

3 結(jié)論與討論

本研究收集了不同來(lái)源的13份遼細(xì)辛種子，對(duì)凈度、千粒重、含水量、生活力、發(fā)芽率進(jìn)行檢測(cè)研究，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析將遼細(xì)辛種子分為3個(gè)質(zhì)量等級(jí)。實(shí)際生產(chǎn)中，為保證藥材品質(zhì)建議選擇1～2級(jí)種子。本研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的遼細(xì)辛種子質(zhì)量之間存在顯著差異。相關(guān)性分析結(jié)果表明，采集地的緯度與海拔與種子質(zhì)量顯著相關(guān)。系統(tǒng)聚類(lèi)分析結(jié)果以及13份種子等級(jí)的劃分表明，高品質(zhì)遼細(xì)辛種子多集中在北緯41°40′59″～42°02′45″，海拔308.5～494.1 m區(qū)域內(nèi)。

遼細(xì)辛種子具有頑拗特性，種子安全水的確定尤為重要。常溫下北細(xì)辛含水量區(qū)間52.4%～66.7%為限量標(biāo)準(zhǔn)[10]。邢麗偉等[11]研究表明，4 ℃存儲(chǔ)條件下含水量降至15%以上時(shí)，遼細(xì)辛的種子活力不會(huì)受到影響。本研究根據(jù)對(duì)不同來(lái)源種子含水量的測(cè)定，初步確定遼細(xì)辛種子存儲(chǔ)安全水范圍為10.90%～11.86%，該指標(biāo)的確定將冷藏條件下遼細(xì)辛種子安全含水量區(qū)間進(jìn)一步降低。含水量的降低可以延長(zhǎng)種子保存時(shí)間，對(duì)于遼細(xì)辛種質(zhì)保存具有重要意義。