孫海濤，陳志玲

（首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

0 引 言

微管骨架是細(xì)胞骨架的主要成員，在細(xì)胞的多項(xiàng)生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如細(xì)胞生長、細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋@些功能的發(fā)揮依賴于微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性及可調(diào)控性.研究表明有多種微管結(jié)合蛋白可以調(diào)控微管的動(dòng)態(tài)，協(xié)助微管執(zhí)行功能，如：MAP200促進(jìn)微管聚合、katanin蛋白能夠切割微管、MAP65促進(jìn)微管成束和EB蛋白結(jié)合在微管正端調(diào)控微管骨架動(dòng)態(tài)[1-2].而驅(qū)動(dòng)蛋白（kine‐sin）家族成員較為特殊，是馬達(dá)蛋白通過水解三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）產(chǎn)生的能量沿微管運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而在膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)、有絲分裂、蛋白復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)和微管動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[3-4].

從20世紀(jì)80年代，Vale等[5]在烏賊（Loligo pea‐leii）神經(jīng)元軸突內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)蛋白以來，迄今在不同物種中報(bào)道的驅(qū)動(dòng)蛋白多達(dá)幾百種，基于驅(qū)動(dòng)蛋白氨基酸序列相似性、馬達(dá)結(jié)構(gòu)域相似性和進(jìn)化過程中的相關(guān)性，將驅(qū)動(dòng)蛋白分為14個(gè)亞家族（驅(qū)動(dòng)蛋白-1～14）和個(gè)體（Ungrouped orphans）驅(qū)動(dòng)蛋白[3]，但是許多驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員的功能并不是很清楚.驅(qū)動(dòng)蛋白均含有1個(gè)高度保守的馬達(dá)結(jié)構(gòu)域，約由350個(gè)氨基酸殘基組成，此區(qū)域具有ATP酶催化活性和微管結(jié)合位點(diǎn)，依據(jù)馬達(dá)結(jié)構(gòu)域在驅(qū)動(dòng)蛋白多肽鏈中所處位置的不同，分為N端、C端和中間驅(qū)動(dòng)蛋白.一般來說，N端驅(qū)動(dòng)蛋白沿微管正向運(yùn)輸，C端驅(qū)動(dòng)蛋白沿微管負(fù)向運(yùn)輸，中間驅(qū)動(dòng)蛋白則從正端或負(fù)端解聚微管.驅(qū)動(dòng)蛋白-1～12、驅(qū)動(dòng)蛋白-13和驅(qū)動(dòng)蛋白-14分別為N端驅(qū)動(dòng)蛋白、中間驅(qū)動(dòng)蛋白和C端驅(qū)動(dòng)蛋白，現(xiàn)有研究表明，一些特殊的驅(qū)動(dòng)蛋白并不嚴(yán)格遵循此規(guī)律，驅(qū)動(dòng)蛋白-8和驅(qū)動(dòng)蛋白-14除沿微管運(yùn)輸外，還具有解聚微管的特性[6-7].除馬達(dá)區(qū)域以外，其他部位的氨基酸序列并不保守，具有多變性，主要是負(fù)責(zé)形成二聚體以及調(diào)節(jié)功能等.

體外生化研究表明，驅(qū)動(dòng)蛋白-1家族成員多以四聚體形式存在，包含驅(qū)動(dòng)蛋白重鏈（kinesin heavy chain，KHC）和輕鏈（kinesin light chain，KLC）2種亞基.KHC包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為馬達(dá)結(jié)構(gòu)域、二聚化結(jié)構(gòu)域、頸鏈和尾部.其中：馬達(dá)結(jié)構(gòu)域位于驅(qū)動(dòng)蛋白分子的N末端，由2個(gè)相同的頭部組成，每個(gè)頭部都含有微管結(jié)合位點(diǎn)，并具有ATP酶活性[8]；二聚化結(jié)構(gòu)域也稱為莖部，由2個(gè)a-螺旋相互纏繞組成，幫助驅(qū)動(dòng)蛋白形成二聚體；頸鏈?zhǔn)沁B接頭部和二聚化結(jié)構(gòu)域的一段約14個(gè)氨基酸殘基組成的短肽；尾部位于驅(qū)動(dòng)蛋白分子的C末端，由2個(gè)較小的球狀結(jié)構(gòu)組成，保守性低，C末端負(fù)責(zé)與其他亞基或“貨物”結(jié)合，有些驅(qū)動(dòng)蛋白通過相連的KLC來間接與“貨物”結(jié)合.關(guān)于驅(qū)動(dòng)蛋白頭部的運(yùn)動(dòng)方式，目前，步進(jìn)（hand-over-hand）模型被大家普遍接受，此模型認(rèn)為，馬達(dá)的2個(gè)頭部運(yùn)動(dòng)與人的2條腿走路時(shí)類似，交替前進(jìn)，其中一個(gè)頭部與微管結(jié)合時(shí)，另一個(gè)頭部才從微管上解離，每個(gè)頭部前進(jìn)一步的距離為16 nm.驅(qū)動(dòng)蛋白在頭部的帶動(dòng)下，從而拖動(dòng)“貨物”沿微管完成定向移動(dòng).多細(xì)胞動(dòng)物中，驅(qū)動(dòng)蛋白-1不僅可以運(yùn)輸膜結(jié)構(gòu)的“貨物”，如囊泡、線粒體和溶酶體等，還可以運(yùn)輸非膜結(jié)構(gòu)的“貨物”，如mRNA等.動(dòng)物神經(jīng)元的軸突、真菌的菌絲和植物的花粉管等細(xì)胞中，“貨物”運(yùn)輸活躍.在果蠅（Dro‐sophila melanogaster）和秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）中，驅(qū)動(dòng)蛋白-1的基因（Kin-1）為必需基因，其KHC突變會(huì)造成胚胎發(fā)生異常、神經(jīng)肌肉缺陷，其缺失會(huì)導(dǎo)致幼蟲死亡[9-10].因此，為了研究Kin-1的體內(nèi)功能，選擇低等真核生物顯得尤為必要.

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，粗糙脈孢菌（Neu‐rospora crassa）作為典型絲狀真菌模式生物，其基因組序列已于2003年公布，使得利用反向遺傳學(xué)手段構(gòu)建其中感興趣的基因敲除突變株成為可能.更重要的是，粗糙脈孢菌菌絲具有典型的極性生長特點(diǎn)，囊泡類物質(zhì)、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等的運(yùn)輸非常活躍，因此，粗糙脈孢菌無疑是研究體內(nèi)Kin-1功能的良好材料.本研究旨在通過構(gòu)建Kin-1敲除突變株Kin-1KO，分析其表型的變化，研究Kin-1的體內(nèi)功能，為進(jìn)一步深入闡明真菌的生長發(fā)育機(jī)制提供一定的依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和材料

分析純瓊脂粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀和硫酸鎂等購自北京江晨文軒生物有限公司，DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶等購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司，1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自美國賽默飛世爾科技有限公司，潮霉素B、瓊脂糖、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物和DNA片段回收試劑盒與植物細(xì)胞壁鈣熒光白（calcofluor white，CFW）購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物科技有限公司.

野生型粗糙脈孢菌菌株87-3和Ku70RIP由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)何群教授提供，大腸桿菌JM109菌株購自北京索萊寶科技有限公司.所用引物依據(jù)粗糙脈孢菌菌株基因組序列以及潮霉素抗性基因hph的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.引物的名稱及序列見表1.

表1 構(gòu)建基因敲除突變株所用引物

1.2 儀器

使用上海一恒科技有限公司生產(chǎn)的LRH-150、DHP-9082型培養(yǎng)箱進(jìn)行菌株培養(yǎng)；使用美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)的MAXQ 4000型搖床進(jìn)行菌株的液體培養(yǎng)；使用德國艾本德公司生產(chǎn)的5424臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行樣品常溫離心，離心半徑8.4 cm、離心速度為 4 000～12 000 r/min、每次 1～10 min；使用德國艾本德公司生產(chǎn)的5424R臺(tái)式離心機(jī)進(jìn)行樣品4℃低溫離心，離心半徑8.4 cm、離心速度為1 500～12 000 r/min、每次3～5 min；使用德國拜耳公司TC-25/H PCR儀進(jìn)行核酸片段的擴(kuò)增；使用美國bio-rad伯樂公司生產(chǎn)的041BR電泳槽、JY-SPCT電泳儀和Gel Doc 1000紫外凝膠成像儀進(jìn)行核酸片段檢測；使用美國bio-rad伯樂公司生產(chǎn)的Gene Pulser Xcell電穿孔儀進(jìn)行分生孢子轉(zhuǎn)化；使用德國徠卡顯微系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)的LEICADMRE熒光顯微鏡觀察菌絲形態(tài)和分枝；使用日本愛普生RX630掃描儀掃描培養(yǎng)皿、試管和競爭性生長管中菌落和菌絲的生長狀態(tài).

1.3 粗糙脈孢菌菌株Kin-1KO構(gòu)建

參考Colot等[11]的方法進(jìn)行菌株培養(yǎng)和方法改進(jìn)，構(gòu)建菌株Kin-1KO，對(duì)應(yīng)構(gòu)建策略如圖1.操作步驟：（1）以粗糙脈孢菌菌株87-3基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增Kin-1的上游（5'flank）、下游（3'flank）DNA片段，長度各約1 000 bp，所用引物為Kin-11FNotI/Kin-12RSpeI和Kin-13FHindⅢ/Kin-14RXhoⅠ，限制性內(nèi)切酶消化；（2）分別與酶切后的質(zhì)粒pBluescript-SK-hph連接，構(gòu)建完成重組質(zhì)粒pBlue‐script-SK-Kin-15'flank-hph和pBluescript-SK-hph-Kin-13'flank；（3）分別以上述質(zhì)粒為模板，利用引物對(duì)Kin-1FNotI/hph-1、Kin-14RXhoⅠ/hph-2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大量Kin-15'flank+hph和hph+Kin-13'flank片段；（4）各取 2 mg片段混合后，通過電穿孔法轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌菌株Ku70RIP，對(duì)野生型菌株的Ku70基因進(jìn)行突變后，抑制DNA非同源重組，大大增強(qiáng)了同源重組的效率，作為遺傳重組敲除目的基因的背景菌株，利用同源重組以hph基因替換宿主菌靶基因Kin-1，通過潮霉素抗性篩選獲得陽性克?。唬?）挑取陽性克隆，并提取基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測，獲得擴(kuò)增出5'flank+hph和hph+3'flank片段的克??；（6）將分生孢子通過5 mm孔徑的濾膜過濾，獲得小分生孢子，潮霉素抗性篩選并結(jié)合PCR鑒定的方法，獲得Kin-1KO純合突變體.

圖1 同源重組構(gòu)建粗糙脈孢菌菌株Kin-1KO示意（a）粗糙脈孢菌基因組DNA及各引物在基因組中的位置；（b）同源重組敲除Kin-1

1.4 Kin-1KO突變株表型分析

1.4.1 菌落生長

從菌株87-3、菌株Ku70RIP和菌株Kin-1KO中，分別挑取分生孢子，制成相同質(zhì)量濃度的懸液，接種于培養(yǎng)基中央，30℃培養(yǎng)12～48 h后，掃描記錄菌落生長狀況.

1.4.2 菌絲生長和分生孢子形成

同上，挑取3種分生孢子后，分別接種于斜面底部1/3處，30℃黑暗培養(yǎng)1 d，轉(zhuǎn)移至室溫光照培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間掃描記錄.

1.4.3 菌絲生長速率

同上，挑取3種分生孢子后，分別接種于競爭性生長管（race tubes）一端，室溫光照培養(yǎng)24 h后，標(biāo)記菌絲生長前沿，轉(zhuǎn)入黑暗條件培養(yǎng)，每隔24 h標(biāo)記1次菌絲生長前沿，至菌絲生長至競爭性生長管另一端時(shí)，從培養(yǎng)箱中取出，掃描、記錄并統(tǒng)計(jì)分析各菌株菌絲生長速率.每一菌株至少重復(fù)3次.

1.4.4 菌絲形態(tài)

參考Cotado-Sampayo等[12]的方法，在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，加入15 mL培養(yǎng)基，冷卻至室溫后，45°角插入無菌蓋玻片，沿蓋玻片和培養(yǎng)基狹縫加入5 mL相同質(zhì)量濃度的上述3種分生孢子懸液，30℃培養(yǎng)12 h，3.7%甲醛固定，0.5 mg/mL CFW染色后封片，顯微鏡觀察拍照.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

從美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）查詢Kin-1基因序列（NCU09730）及其上下游序列結(jié)果顯示，Kin-1由2 997個(gè)核苷酸組成，包含2個(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框（open reading frame，ORF）區(qū)域?yàn)?2 787 bp，編碼928個(gè)氨基酸，粗糙脈孢菌驅(qū)動(dòng)蛋白-1結(jié)構(gòu)示意如圖2所示，包含馬達(dá)結(jié)構(gòu)域、頸鏈、莖部和尾部，為典型的驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員.

圖2 粗糙脈孢菌驅(qū)動(dòng)蛋白1

2.2 粗糙脈孢菌中Kin-1KO突變體構(gòu)建

在Kin-1KO突變體構(gòu)建中，分別獲得Kin-15'flank+hph（2 007 bp）和hph+Kin-13'flank（2 358 bp）片段后，轉(zhuǎn)化至Ku70RIP菌株.陽性菌落轉(zhuǎn)至斜面上培養(yǎng)轉(zhuǎn)接3代后，提取基因組DNA、PCR初步鑒定Kin-1KO突變體.PCR鑒定結(jié)果如圖3所示.表明：初步獲得了2株突變體Kin-1KO2#和14#，即能夠擴(kuò)增出片段5′flank+hph和hph+3′flank，無目的基因Kin-1條帶，而Ku70RIP對(duì)照中擴(kuò)增出Kin-1條帶，無片段5′flank+hph和hph+3′flank；濾膜過濾后，得到僅含1個(gè)細(xì)胞核的小分生孢子，以new1F/hph-1、new4R/hph-2為引物時(shí)，分別擴(kuò)增出大小為2 131和2 566 bp的片段，以Kin-1F/R為引物時(shí)未擴(kuò)增出目的基因Kin-1條帶；而對(duì)照Ku70RIP菌株中，以 new1F/hph-1、new4R/hph-2為引物時(shí)未擴(kuò)增出條帶，以Kin-1F/R為引物時(shí)擴(kuò)增出了目的基因Kin-1的條帶，為3 063 bp.共獲得了4株Ku70RIPKin-1KO純合突變體，分別編號(hào)為2#-8、2#-9、2#-10和14#-1.

圖3 粗糙脈孢菌Kin-1KO菌株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定（a）雜合菌株；（b）純合菌株

2.3 粗糙脈孢菌Kin-1KO表型分析

2.3.1 菌落生長情況

野生型菌株87-3和菌株Ku70RIP的生長情況如圖4所示.在36 h時(shí)，菌株87-3的菌落接近鋪滿培養(yǎng)基表面，48 h全面覆蓋；對(duì)應(yīng)時(shí)間菌株Kin-1KO的菌落直徑僅約為野生型的1/3，其菌落生長速度均明顯減慢，表明Kin-1敲除后，菌落生長速度明顯受到了抑制.從菌落的形態(tài)來看，菌株Ku70RIP菌落疏松，菌株Kin-1KO的菌落形狀呈花椰菜型，較緊密.

圖4 不同菌株接種不同時(shí)間后菌落生長情況

2.3.2 菌絲生長和分生孢子的形成情況

不同菌株的菌絲生長和分生孢子的形成情況如圖5所示.菌株87-3和菌株Ku70RIP的菌絲飽滿，均勻地生長在斜面培養(yǎng)基上，且分生孢子集中出現(xiàn)在斜面頂端；菌株Kin-1KO的菌絲表面干癟，緊緊貼附在斜面培養(yǎng)基表面，分生孢子數(shù)量明顯減少，在斜面培養(yǎng)基表面不規(guī)則分布.

圖5 不同菌株的菌絲生長和分生孢子形成情況（a）第1天；（b）第7天

2.3.3 菌絲生長速率情況

不同菌株的菌絲生長速率如圖6所示.菌株87-3和菌株Ku70RIP的菌絲轉(zhuǎn)入黑暗培養(yǎng)8 d后，生長至競爭性生長管的另一端，二者的平均生長速率分別為（3.87 ±0.27）和（3.87 ±0.45）cm/d；Kin-1KO菌絲生長速率受到了明顯抑制，前5天，Kin-1KO2#-8、2#-9、2#-10和 14#-1的平均生長速率分別為（1.00±0.01）、（0.92±0.03）、（0.87±0.04）和（0.91±0.01）cm/d，隨后生長速率逐漸減小.

圖6 競爭性生長管分析菌絲生長情況（a）生長情況圖示；（b）生長速率分析

2.3.4 菌絲形態(tài)

不同菌株的菌絲分枝情況如圖7所示.與菌株87-3和菌株Ku70RIP相比，Kin-1缺失后，菌株Kin-1KO的菌絲分枝明顯增多、菌絲直徑增加和細(xì)胞長度明顯變短.

圖7 不同菌株的菌絲分枝情況（a）菌株 87-3；（b）菌株 Ku70RIP；（c）菌株 Kin-1KO

3 討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，2003年，粗糙脈孢菌全基因組測序完成，構(gòu)建基因敲除突變株是研究基因體內(nèi)功能的一種非常有效的方法，因此，為了深入分析驅(qū)動(dòng)蛋白-1在粗糙脈孢菌菌絲極性生長中的功能，本研究中以粗糙脈孢菌為材料，通過同源重組對(duì)其Kin-1基因進(jìn)行了敲除，證實(shí)敲除菌株表型存在明顯的缺陷，主要體現(xiàn)在菌落生長減慢、菌絲生長速率下降、菌絲分枝增多和分生孢子數(shù)量明顯減少等.這些結(jié)果表明：Kin-1不是粗糙脈孢菌生命活動(dòng)的必需基因，其缺失后粗糙脈孢菌雖然生長異常，但是能夠存活；Kin-1在菌絲極性生長過程中起著重要的調(diào)控作用.

真菌菌絲以極性生長為典型特征，極性一旦確定后，便以驚人的速度延伸.在快速的極性生長過程中，需要充足的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜前體物質(zhì)，連續(xù)地合成，并運(yùn)輸囊泡類物質(zhì)和細(xì)胞器等到生長部位.在菌絲頂端區(qū)域有一特殊的細(xì)胞器—頂體（Spit‐zenk?rper），其被認(rèn)為是頂端生長的囊泡貯存供給中心，雖然目前對(duì)頂體的成分及組裝機(jī)制不是很清楚，但是一般認(rèn)為，由微管骨架經(jīng)長距離運(yùn)輸囊泡類等物質(zhì)到頂體，然后再由微絲骨架將頂體內(nèi)的囊泡類等物質(zhì)經(jīng)短距離運(yùn)送至生長的質(zhì)膜部位.驅(qū)動(dòng)蛋白是一類非常重要的基于微管骨架運(yùn)輸?shù)鸟R達(dá)蛋白，通過水解ATP將化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械能，從而產(chǎn)生沿微管骨架的定向運(yùn)動(dòng).Fuchs等[13]表明當(dāng)用專一性藥物苯菌靈（benomyl）處理解聚微管骨架后，玉米黑粉菌（Ustilago maydis）菌絲生長緩慢；Steinberg 和 Schliwa[14]曾通過 5′-Race等方法獲得了粗糙脈孢菌NKin的cDNA序列；Seiler等[15]對(duì)NKin進(jìn)行點(diǎn)突變獲得的驅(qū)動(dòng)蛋白功能缺陷株中，證實(shí)其在菌絲生長、分枝等方面均表現(xiàn)異常；Lehmler等[16]對(duì)玉米黑粉菌Kin-1無效突變株的研究表明，菌絲頂端膜物質(zhì)的積累消失，綠色熒光蛋白與Kin-1的融合蛋白定位于頂端特定的區(qū)域，與頂體囊泡緊密相連[17].在叢赤殼菌（Nectria haematococca）中，Kin-1基因缺失后，菌絲細(xì)胞內(nèi)頂體明顯變小，囊泡類物質(zhì)運(yùn)輸受到抑制，菌絲頂端彎曲[18].由此可見，不論是作為軌道的微管骨架，還是作為能量來源的驅(qū)動(dòng)蛋白-1，在頂體的形成及菌絲的極性生長中二者缺一不可.因此，本研究中Kin-1缺失后，囊泡運(yùn)輸?shù)哪芰縼碓词艿接绊懀柚沽司z生長所需原料的運(yùn)輸，進(jìn)而抑制菌絲的極性生長.

4 結(jié)束語

本研究通過構(gòu)建粗糙脈孢菌Kin-1缺失突變體，證明了其調(diào)控著菌絲生長發(fā)育.迄今為止，微管骨架在極性生長中的研究取得了一些進(jìn)展，但是仍有許多問題亟待解決，如：驅(qū)動(dòng)蛋白家族除驅(qū)動(dòng)蛋白-1亞家族外，還有其他14個(gè)亞家族成員，而在粗糙脈孢菌基因組中，有12個(gè)基因分別編碼不同的驅(qū)動(dòng)蛋白亞家族成員，其分別運(yùn)輸哪些不同的“貨物”，哪些區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合“貨物”，功能是否存在重疊或互相依賴等，這些問題都是后續(xù)的研究方向.