韓云云，袁學(xué)文，栗藝芳，鄧 冰,*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；3.山西省襄垣縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 長(zhǎng)治 046200）

香菇（Lentinus edodes）屬擔(dān)子菌綱（Basidaiomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomatacete）香菇屬（Lentinus），2020年國(guó)內(nèi)香菇總產(chǎn)量達(dá)到1 188.21萬(wàn)t，在所有食用菌中居于首位[1]。鮮食香菇在貯藏過(guò)程中極易發(fā)生褐變，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。對(duì)雙孢菇和杏鮑菇的研究發(fā)現(xiàn)，以酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）、雙酚氧化酶（Diphenoloxidase，DPO）和漆酶（Laccase，LAC）等為代表的多酚氧化酶（Poly phenol oxidase，PPO）是直接造成子實(shí)體褐變的關(guān)鍵酶之一[4]。TYR和LAC能催化酪氨酸（單酚化合物）形成3,4-二羥基苯丙氨酸，之后該化合物被進(jìn)一步氧化成多巴醌，在非酶催化條件下多巴醌轉(zhuǎn)化為多巴色素（紅色）、5,6-二羥基吲哚和5,6-吲哚醌（黃色），并經(jīng)過(guò)聚合反應(yīng)形成黑色素（紫色）和黑素（黑色）等褐變物質(zhì)[4-7]。目前香菇采后褐變過(guò)程中發(fā)揮主要作用的酶種類尚無(wú)定論，同時(shí)褐變過(guò)程中涉及的生理生化機(jī)制和分子機(jī)制尚不明確。過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）是真核生物抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，在機(jī)體應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-10]。另外有研究表明，在過(guò)氧化物氧化相關(guān)活性物質(zhì)產(chǎn)生色素沉積的過(guò)程中POD發(fā)揮了重要作用，而通過(guò)外源處理鈍化POD活性可以有效抑制香菇褐變發(fā)生，表明POD可能亦是造成食用菌褐變發(fā)生的關(guān)鍵酶[11-13]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）為含有巰基的POD酶類，目前研究發(fā)現(xiàn)GPX在調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代謝和抵抗壓力脅迫等過(guò)程中發(fā)揮作用，但是對(duì)于其在園藝產(chǎn)品采后褐變，尤其是以香菇為代表的食用菌采后褐變發(fā)生中的作用機(jī)制尚不清楚[14-15]。

本研究基于香菇基因組數(shù)據(jù)篩選香菇LeGPX基因，通過(guò)基因克隆明確其編碼序列，利用生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)其基本生物學(xué)信息，并通過(guò)熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)研究其在香菇采后貯藏中的表達(dá)模式，通過(guò)以上研究以期為明確香菇采后褐變機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

香菇：于2021年5月采自山西省臨縣山圪嶗農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社，挑選菌蓋直徑一致、無(wú)機(jī)械傷且未開(kāi)傘香菇，采摘后置于4℃貯藏。分別在貯藏0、4、8、12、16、24、28 d留取菌蓋和菌柄部位，所有樣品經(jīng)液氮速凍后置于超低溫（-80℃）冰箱保存。

總RNA提取試劑盒、克隆載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和Transetta感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、無(wú)縫克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；pCOLD-ProS2載體：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop ONE超微量分光光度計(jì)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；Mini-Sub cell GT電泳系統(tǒng)，CFX96熒光定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)科技公司；Tone96G梯度PCR儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；Tanon4100凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；WSC-S型色差儀，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因鑒定

通過(guò)基迪奧云平臺(tái)（https://www.omicshare.com/tools/）對(duì)課題組已獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中所有的編碼基因進(jìn)行PFAM注釋，以E值＜0.01為準(zhǔn)提取包含GPX結(jié)構(gòu)的序列，之后利用NCBIBlastP確定蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。使用IBS1.0對(duì)蛋白注釋結(jié)果和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制。

1.2.2 基因克隆

1.2.2.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行凍存樣品總RNA的提取，用100μL無(wú)酶水溶解RNA沉淀，水平電泳檢測(cè)RNA提取質(zhì)量，NanoDrop ONE超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。以1μg總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)產(chǎn)物稀釋10倍，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.2.2 基因克隆

參照“1.2.1”中鑒定的序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)的擴(kuò)增引物（表1）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers in thisstudy

PCR反應(yīng)體系：1μL模板，上游和下游引物（10μmol/L）各2μL，PCRSupermix25μL，無(wú)菌水20μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃變性5 min，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)（95℃30 s，55℃10 s，72℃50 s），72℃延伸10 min。水平電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并回收目的片段凝膠，使用試劑盒純化目的片段。將純化產(chǎn)物連接至EASY cloning載體，重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。37℃過(guò)夜培養(yǎng)后用PCR驗(yàn)證陽(yáng)性菌落，委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及多序列比對(duì)

從NCBI下載部分真菌GPX蛋白序列，使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。參照系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，使用BioEdit軟件對(duì)LeGPX蛋白與相近物種GPX蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2.3 蛋白生物信息學(xué)分析

使用在線軟件Sequence Manipulation Suite對(duì)蛋白氨基酸組成、分子式和分子質(zhì)量、帶電荷氨基酸組成和等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)及總疏水指數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。使用在線軟件Prabi預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)組成及分布，在線軟件SWISS-MODEL構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。使用在線軟件ExPASy-ProtScale分析蛋白親疏水基團(tuán)組成和分布，Excel軟件繪制圖譜。使用在線軟件SignalP 4.1 Server掃描蛋白序列前60位氨基酸中信號(hào)肽分布，Excel軟件繪制圖譜。使用在線軟件TMpred Server掃描蛋白全位點(diǎn)跨膜結(jié)構(gòu)，Excel軟件繪制圖譜。使用Cell-Ploc軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位情況。

1.2.4 蛋白原核表達(dá)及純化

參照“1.2.2”獲得的序列和pCOLD-ProS2圖譜設(shè)計(jì)用于構(gòu)建重組載體的引物，經(jīng)片段純化和連接構(gòu)建原核表達(dá)載體，PCR驗(yàn)證載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)入Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞[16]。參照蘇俊等[16]的方法，采用15℃結(jié)合異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，保存誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后菌液，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。采用鎳離子親和純化方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，保存貫穿液和各濃度咪唑洗脫液（30、50、100 mmol/L），SDS-PAGE檢測(cè)純化效果[17]。

1.2.5 相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

將“1.2.2”獲得的cDNA稀釋10倍作為模板，參照確定的基因序列設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR反應(yīng)的引物（表1），按熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)程序。以起始點(diǎn)為對(duì)比，使用2-ΔΔt方法進(jìn)行不同樣品（均包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）LeGPX基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算[18]。

1.2.6 色差測(cè)定

分別于貯藏0、4、8、12、16、24、28 d，使用WSC-S型色差儀測(cè)定菌蓋表面標(biāo)記部位及菌蓋切開(kāi)后中心部位（菌肉）色差值。不同部位色差值測(cè)定均以每5個(gè)香菇為一組，分別設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

使用IBM SPSSStatistics軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，使用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LeGPX基因鑒定

在香菇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到1條與已知物種GPX基因具有同源性的編碼序列（Coding sequence，CDS）。對(duì)該序列編碼的蛋白進(jìn)行PFAM注釋，結(jié)果顯示該蛋白48～156氨基酸殘基為GPX結(jié)構(gòu)域（圖1A），結(jié)合CDD注釋結(jié)果確定篩選到的序列為L(zhǎng)eGPX基因的CDS。對(duì)LeGPX基因DNA序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該基因DNA序列長(zhǎng)度839 bp，包含5個(gè)外顯子；對(duì)該基因上游2 kb序列進(jìn)行啟動(dòng)子位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該基因的啟動(dòng)子區(qū)位于上游802bp左右（圖1B）。

圖1 LeGPX基因PFAM注釋結(jié)果(A)及基因結(jié)構(gòu)(B)Fig.1 PFAMannotation result(A)and gene structure(B)of LeGPX

2.2 LeGPX基因克隆

參照鑒定到的LeGPX基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增CDS的引物，以香菇cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物符合預(yù)期大?。▓D2A）；將克隆得到的序列與香菇基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示所得序列與預(yù)測(cè)序列完全一致。為進(jìn)一步驗(yàn)證克隆結(jié)果的可靠性，參照已公布的其他真菌GPX氨基酸數(shù)據(jù)構(gòu)建了LeGPX蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示LeGPX蛋白與小皮傘（Marasmiusfiardii）和灰色果腐菌（Moniliophthoraroreri）的GPX親緣關(guān)系較近（圖2B）。同時(shí)使用BioEdit軟件對(duì)LeGPX、MfGPX和MrGPX蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示以上蛋白均包含3段GPX特征序列（NTASA(K)CGFT、I(V)L(V)AFPCNQF和KWNFEKFL(V)）以及3個(gè)催化殘基位點(diǎn)（圖2C），符合GPX的一般特征[19]。以上結(jié)果證實(shí)已經(jīng)成功克隆了香菇LeGPX基因。

圖2 LeGPX基因克?。ˋ）、系統(tǒng)發(fā)育分析（B）及蛋白同源比對(duì)分析（C）Fig.2 Gene cloning(A),phylogenetic analysis(B)and homologouscomparison(C)analysisof LeGPX

2.3 LeGPX蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 LeGPX理化性質(zhì)分析采用在線軟件Sequence Manipulation Suite預(yù)測(cè)LeGPX蛋白的理化性質(zhì)。LeGPX氨基酸殘基數(shù)為206，其中亮氨酸（Leu，8.70%）、蘇氨酸（Thr，7.80%）、丙氨酸（Ala，7.30%）和甘氨酸（Gly，7.30%）為該蛋白中占比最多的幾種氨基酸；分子式為C1029H1599N269O301S8，分子量為22.811 kD；帶正電荷氨基酸（精氨酸和賴氨酸）和帶負(fù)電荷氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）數(shù)量分別為16和44，理論等電點(diǎn)8.83，為堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)31.89（小于50），為穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 LeGPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用在線軟件Prabi對(duì)LeGPX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。LeGPX蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲（46.6%）和α-螺旋（29.1%）為主，延伸鏈和β折疊分別占17.5%和6.8%（圖3A）。使用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)LeGPX蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示無(wú)規(guī)則卷曲為該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中最明顯的組件；同時(shí)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中還存在3個(gè)可能的催化殘基位點(diǎn)，與蛋白同源序列比對(duì)結(jié)果相符（圖3B）。

圖3 LeGPX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（A）和三級(jí)結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Theprediction of secondary structure(A)and tertiary structure(B)of LeGPX protein

2.3.3 LeGPX蛋白親水性分析

親水性分析結(jié)果顯示：LeGPX蛋白表面存在198個(gè)暴露的親疏水基團(tuán)，其中氨基酸殘基第75位（纈氨酸）疏水性作用最強(qiáng)，為1.967；第98位（賴氨酸）疏水性作用最弱，為-2.511（圖4）。整體來(lái)看LeGPX蛋白表面的總親水位點(diǎn)數(shù)量（122個(gè)）多于總疏水位點(diǎn)（76個(gè)），整體疏水指數(shù)為-0.164（圖4），說(shuō)明該蛋白為親水蛋白。

圖4 LeGPX蛋白親水性分析Fig.4 The hydrophilicity analysisof LeGPX protein

2.3.4 LeGPX蛋白細(xì)胞定位與信號(hào)肽分析

蛋白質(zhì)在合成后需要轉(zhuǎn)運(yùn)至相應(yīng)位置發(fā)揮作用，明確細(xì)胞定位對(duì)于探明其生物學(xué)功能具有重要意義。使用SignalP4.1 Server軟件預(yù)測(cè)LeGPX蛋白信號(hào)肽，結(jié)果顯示前60位氨基酸中最高信號(hào)肽分值（Max.C）、最高原始剪切位點(diǎn)分值（Max.Y）和最高綜合剪切位點(diǎn)分值（Max.S）均小于0.5（圖5A），且信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示為不存在信號(hào)肽。使用在線軟件TMpred Server預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5B）。綜合信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果可以說(shuō)明LeGPX蛋白為非分泌蛋白，該蛋白在合成之后不進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌系統(tǒng)，并且不存在進(jìn)入其他細(xì)胞器的可能。使用在線軟件Cell-Ploc分析其亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果亦顯示LeGPX蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。

圖5 LeGPX信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Signal peptide and transmembrane structural domain analysisof LeGPX protein

2.4 香菇GPX蛋白原核表達(dá)分析

將構(gòu)建成功的pCOLD-ProS2-LeGPX載體轉(zhuǎn)進(jìn)Transetta感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)低溫結(jié)合IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生了大小約為50 kD的重組蛋白（圖6中2～7泳道），并且對(duì)照組中未出現(xiàn)重組蛋白（圖6中1泳道）。LeGPX-ProS2重組蛋白表達(dá)成功，并且外源IPTG濃度不會(huì)影響該重組蛋白的積累（圖6中2～7泳道）。使用鎳離子親和純化方法對(duì)上清蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用50 mmol/L咪唑可有效洗脫LeGPX-ProS2重組蛋白（圖7）。

圖6 LeGPX蛋白原核表達(dá)Fig.6 Theprokaryotic expressionsof LeGPXprotein

圖7 LeGPX-ProS2重組蛋白純化Fig.7 Purification of LeGPX-ProS2 recombinant protein

2.5 LeGPX基因在香菇采后貯藏期間的表達(dá)模式分析

香菇在采后貯藏期間會(huì)出現(xiàn)明顯的褐變現(xiàn)象，有研究表明該現(xiàn)象的發(fā)生可能與代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致的氧化還原失衡有關(guān)。如圖8A所示，香菇采后貯藏期間菌蓋表面L*值呈逐漸下降趨勢(shì)，反映在子實(shí)體上表現(xiàn)為表皮顏色由灰褐色逐步轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?。菌肉部位發(fā)生褐變較晚，該部位L*值表現(xiàn)為貯藏初期無(wú)顯著變化，至貯藏中期（12～16 d）和貯藏末期（20～24 d）出現(xiàn)兩次顯著下降（圖8B）。通過(guò)相對(duì)表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，菌蓋部位LeGPX基因表達(dá)量在貯藏期間整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，采后8、12、16、20、28d時(shí)LeGPX基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于貯藏初值（P＜0.05），其中采后16、20 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到初值12倍左右（圖8C）。菌柄部位LeGPX基因在貯藏初期（4～8 d）即顯著上調(diào)表達(dá)（15倍），貯藏12～28 d仍保持相對(duì)高表達(dá)狀態(tài)（圖8D）。整體來(lái)看，與菌蓋部位相比，香菇采后貯藏期間LeGPX基因在菌柄部位表達(dá)更為活躍

圖8 香菇采后L*值及LeGPX基因相對(duì)表達(dá)量變化Fig.8 L*valuesand the relative expression levels changesof LeGPX gene in postharvest L.edodes

3 討論與結(jié)論

真核生物氧化還原系統(tǒng)中存在豐富的抗氧化酶，其中POD是消除活性氧、酚類和胺類等氧化產(chǎn)物的關(guān)鍵酶[5]。目前動(dòng)植物中已鑒定到的POD酶體包括辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）、甲狀腺過(guò)氧化物酶（Thyroid peroxidase，TPO）、血紅素過(guò)氧化物酶（Heme peroxidase，HP）、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、錳過(guò)氧化物酶（Manganeseperoxidase，MnP）和GPX等，其中GPX為動(dòng)物、植物和真菌共有[20]。動(dòng)物GPX分子結(jié)構(gòu)中一般含有1個(gè)硒代半胱氨酸，是酶分子中具有催化活性的作用位點(diǎn)；植物GPX與動(dòng)物GPX序列高度相似，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)含有硒的植物，其酶分子催化位點(diǎn)是半胱氨酸（Cystine，Cys）[21]。本研究通過(guò)基因克隆明確了LeGPX蛋白的氨基酸殘基序列，通過(guò)同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其酶分子中的催化位點(diǎn)（Cys）與植物相同（靈芝以及草菇GPX研究中存在相同結(jié)果），并且催化活性區(qū)（NTASA(K)CGFT）和標(biāo)志基序（I(V)L(V)AFPCNQF）也與其他植物GPX相似[19,22]。前期研究發(fā)現(xiàn)多種食用菌中均能檢測(cè)到硒代半胱氨酸，結(jié)合香菇LeGPX催化位點(diǎn)特性，暗示其可能與植物GPX功能類似[23]。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)LeGPX蛋白不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，是定位于細(xì)胞質(zhì)的非分泌蛋白，該結(jié)果與多種植物GPX細(xì)胞定位情況相同[24]。

菌蓋表皮和菌肉褐變是香菇采后貯藏期間的主要問(wèn)題之一，目前對(duì)于該類褐變發(fā)生的機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)研究。荔枝表皮、鴨梨果心以及雙孢蘑菇表皮采后褐變相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，褐變發(fā)生初始階段機(jī)體的POD活性會(huì)迅速上升，褐變發(fā)生中期活性降低并保持平穩(wěn)，褐變后期POD活性會(huì)隨褐變程度加深而逐步升高；POD可能通過(guò)催化谷胱甘肽或酚類物質(zhì)氧化引起呈色物質(zhì)積累，進(jìn)而造成機(jī)體發(fā)生褐變[4,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)菌蓋和菌柄部位LeGPX基因在香菇發(fā)生褐變前期和末期均會(huì)出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，暗示該基因可能是造成香菇采后褐變的因素之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，與菌蓋部位相比LeGPX基因在菌柄部位更為活躍。脫離栽培基質(zhì)后的菌柄可能承擔(dān)為彈射孢子提供能量的作用，相比菌蓋該部位代謝更為旺盛，由此造成的氧化損傷產(chǎn)物積累可能是引起香菇褐變發(fā)生的誘因。

本研究基于基因組數(shù)據(jù)鑒定并克隆了香菇LeGPX基因的編碼序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析明確了LeGPX蛋白的生物學(xué)特性，通過(guò)構(gòu)建重組載體、原核表達(dá)和金屬離子親和純化獲得了LeGPX可溶蛋白，同時(shí)借助qRT-PCR方法明確了LeGPX基因在香菇褐變發(fā)生中的表達(dá)模式。以上結(jié)果為深入開(kāi)展香菇采后褐變發(fā)生機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)。