孫 蓉，肖 琳，宋明潔，何靜杰,賈建平

(中國康復(fù)研究中心 神經(jīng)康復(fù)K2科，北京100068)

阿爾茨海默病(AD)是一種以記憶力明顯下降為主要表現(xiàn)的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。流行病學(xué)和家系研究表明遺傳因素在AD的發(fā)病中占有很重要的地位[1]。近年來AD基因?qū)W的研究取得了很大的進(jìn)展。已確定與AD有關(guān)的基因分別為淀粉樣APP(APP)基因[2-3]、載脂蛋白E(ApoE4)基因[4-5]、早老素1(PSEN1)基因[6]和早老素2(PSEN2)基因[7]。然而目前只有少數(shù)AD發(fā)現(xiàn)有這些基因的突變，并且部分突變并不致病[8]。以往的研究多側(cè)重于對(duì)DNA本身序列的關(guān)注，而有些表型和疾病的發(fā)生并非DNA序列的改變[9]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)部分基因啟動(dòng)子區(qū)變異在某些人群中可能與AD的發(fā)病有關(guān)[10-12]。本研究檢測(cè)中國北方漢族人群BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，并通過遺傳學(xué)分析其與AD發(fā)病的關(guān)系，為AD的發(fā)病機(jī)制及今后臨床治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

研究分為散發(fā)性阿爾茨海默病(SAD)組、輕度認(rèn)知障礙(MCI)組和對(duì)照組，SAD組35例(男17例，女18例)，平均發(fā)病年齡63.5±5.3歲。符合美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)對(duì)AD臨床診斷。一級(jí)親屬中無癡呆和精神病患者，屬散發(fā)病例。MCI組33 例(男14例，女19例)，平均發(fā)病年齡64.2±5.8歲。經(jīng)MMSE評(píng)分、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)、Hachinski缺血評(píng)分和門診系統(tǒng)體檢診斷。對(duì)照組22例(男11例，女11例)，平均年齡67.5±7.4歲，無記憶和智能障礙，MMSE評(píng)分>28分。3組間年齡、性別、教育程度上差異無顯著意義，均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

甲基化修飾試劑盒購自美國Chemicon公司。Taq HS熱啟動(dòng)酶購自大連寶生物公司。Massarray點(diǎn)樣及芯片儀為美國Sequenom公司產(chǎn)品。PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。GloMaxTM96微孔熒光分析儀為美國Promega公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1DNA的提取及亞硫酸鹽修飾 抽取靜脈血10 ml，用枸櫞酸葡萄糖(ACD)抗凝，鹽析法提取DNA。用分光光度計(jì)分別測(cè)定260 nm、280 nm波長時(shí)的OD值。A260/A280比值大于2.0說明有RNA的污染，可用RNA酶處理樣品；比值小于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，可用酚-氯仿抽提。按照Chemicon甲基化修飾試劑盒說明對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾及純化回收。

1.3.2引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)锽ACE1啟動(dòng)子區(qū)-407至+61，片段大小為468 bp。引物由上海生工合成，序列為Forward:GTTGGTTGTTTAGGTTATTATAATTTAGTT;Rev

ers:TAAATCTTCCCAAATCCCTAAATA。在正向引物5’端加入10mer tag，用于平衡PCR反應(yīng)；反向引物5’端加入T7-Promoter 序列，用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄。以亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃變性15 min；94℃20 s，62℃30 s，72℃60 s，45個(gè)循環(huán)；72℃ 3 min；4℃ ∞。PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用2 μl堿性磷酸酶(SAP)處理，去除體系中游離的dNTP。

1.3.3體外轉(zhuǎn)錄及RNase A特異性T酶切 體外轉(zhuǎn)錄與酶切反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，反應(yīng)體系包含SAP處理后PCR產(chǎn)物2 μl，RNase-free ddH2O 3.15 μl，5× T7 Polymerase Buffer 0.89 μl，T Cleavage Mix 0.24 μl，100 mM DTT,0.22 μl，T7 RNA & DNAPolymerase 0.44 μl，RNase A 0.06 μl。反應(yīng)程序?yàn)?7℃ 3 h，4℃ ∞。每個(gè)樣品中加水20 μl稀釋，震蕩混勻，加入6mg Clean Resin樹脂純化10 min，3 200 g離心5 min。

1.3.4質(zhì)譜檢測(cè) 將純化后產(chǎn)物點(diǎn)至384孔芯片上，使用MALDI-TOF基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)，檢測(cè)數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件(SEQUENOM)分析并輸出結(jié)果。

1.3.5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)(pGL3-Basic及pRL-TK)為報(bào)告基因載體，用基因重組技術(shù)構(gòu)建含BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)的報(bào)告基因質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞和人宮頸癌上皮(HeLa)細(xì)胞。在每次進(jìn)行轉(zhuǎn)染的過程中，同時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，以證實(shí)每次轉(zhuǎn)染的成功與否。

1.3.6細(xì)胞干預(yù)及相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè) 選取S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(復(fù)甲基化)、5-脫氧雜氮胞苷(5-aza-CdR)(去甲基化)、血清剝奪(降低能量和凋亡)及模擬AD病理環(huán)境(Aβ25-35)四種干預(yù)因素。轉(zhuǎn)染后24 h，用不同劑量的各種處理因素作用細(xì)胞24 h，用MTT法計(jì)算細(xì)胞活力，選取適合濃度進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。用GloMaxTM96微孔熒光分析儀檢測(cè)LAF及LAR。相對(duì)熒光素酶活性(RLA)以表示不同啟動(dòng)子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)分析

BACE1基因啟動(dòng)子在-407 至+60區(qū)域有23個(gè)潛在甲基化位點(diǎn)。本次研究分析了前21個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平(因檢測(cè)技術(shù)限制，CpG16和CpG23未能檢測(cè))。

2.2 甲基化率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)大多數(shù)CpG位點(diǎn)甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%。與MCI組和對(duì)照組相比，SAD組患者BACE1 啟動(dòng)子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位點(diǎn)甲基化率明顯降低(P<0.01)。MCI組與對(duì)照相比，各位點(diǎn)甲基化程度的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化率

2.3 年齡與甲基化率的相關(guān)性

BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化率與年齡之間存在負(fù)性線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R=-0.643，P<0.01)。隨著年齡的增長，甲基化程度逐漸降低(圖1)。

圖1 基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率與年齡的相關(guān)性分析

2.4 不同處理因素下啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

選擇SAM 255 μmol/L、5-aza-CdR 55 μmol/L和Aβ25-35 15 μmol/L作為最后的工作濃度，在這些濃度下細(xì)胞活力都在80%左右。對(duì)比各種處理因素下啟動(dòng)子質(zhì)粒的RLA，無論是在SH-SY5Y細(xì)胞中，還是在HeLa細(xì)胞中， BACE1啟動(dòng)子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性在SAM干預(yù)下，與非處理組相比均明顯下降(P<0.01)。而在Aβ25-35干預(yù)下，BACE1啟動(dòng)子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性與非處理組相比增加約20%，但這種變化僅在SY5Y細(xì)胞中(SY5Y細(xì)胞中P=0.000；Hela細(xì)胞中P=0.092)。雙熒光基因報(bào)告分析表明啟動(dòng)子質(zhì)粒在血清剝奪及5-aza-CdR干預(yù)下的RLA與非處理組相比均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 BACE1質(zhì)粒在不同處理因素下的RLA比較

3 討論

AD是老年期癡呆的主要原因之一，由德國巴伐利亞精神病學(xué)家Alois Alzheimer在1907年首先描述并以其名字命名。病理上表現(xiàn)為腦組織萎縮，在新大腦皮質(zhì)、海馬的神經(jīng)元中有神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)、細(xì)胞外老年斑(SP)和腦血管中淀粉樣蛋白(Aβ)沉積[13]。AD的病因目前尚不清楚，以往主要理論是唯蛋白假說(protein-only)，直接歸因于相關(guān)蛋白如β淀粉樣蛋白等的聚集作用，然而蛋白聚集發(fā)生在后期，AD的發(fā)生和發(fā)展不能完全用唯蛋白模型解釋[14]。

遺傳因素導(dǎo)致疾病的發(fā)生主要有兩大類機(jī)制：基因機(jī)制和表觀遺傳機(jī)制?；驒C(jī)制指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、染色體丟失和重排；表觀遺傳機(jī)制是在基因的DNA序列和基因產(chǎn)物沒有發(fā)生改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，并最終導(dǎo)致了表型的變化。隨著AD遺傳學(xué)研究的逐漸深入，越來越多的證據(jù)向“基因決定論”提出了挑戰(zhàn)。FAD患者的研究[15]發(fā)現(xiàn)，即使具有完全相同基因組的兩個(gè)孿生子，發(fā)病年齡、臨床癥狀都不完全相同。這說明還有別的遺傳學(xué)機(jī)制在FAD發(fā)生過程中也起著重要的作用。遺傳學(xué)中的一個(gè)前沿領(lǐng)域：表觀遺傳學(xué)為人們提供了解答這類問題的新思路。1999年Wolffe[16]將表觀遺傳改變定義為未發(fā)生DNA序列改變的、可遺傳的基因表達(dá)改變。這些表觀遺傳的變化與老化、生活方式、環(huán)境暴露和遺傳因子密切相關(guān)，通過染色質(zhì)重構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞生理活性以及獲得疾病的危險(xiǎn)性與嚴(yán)重性[17]。表觀遺傳調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA三種方式，其中以DNA甲基化修飾最為常見。DNA甲基化是生物體在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTS)的作用下，以SAM為甲基供體,將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上去的過程。

Lahiri DK[18]提出了“Latent Early-Life Associated Regulation”(LEARn)模型，假定特殊基因的潛在表達(dá)觸發(fā)了AD的發(fā)生和發(fā)展。根據(jù)這個(gè)模型，各種影響因素開始于早期階段，其長期的存在破壞了基因調(diào)節(jié)，如通過其轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)干擾基因調(diào)節(jié)，導(dǎo)致相關(guān)蛋白過表達(dá)和隨后的Aβ沉積。這個(gè)模型主要作用于基因的調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子)，通過特定基因啟動(dòng)子內(nèi)特定位點(diǎn)的甲基化起作用。

β分泌酶是一種轉(zhuǎn)膜天門冬氨酸蛋白酶—β位點(diǎn)APP裂解酶(BACE1和BACE2)，BACE1和BACE2被稱為新的轉(zhuǎn)膜天門冬氨酸(ASP)蛋白酶家族[19]。研究[20]表明由轉(zhuǎn)錄因子水平的變化造成BACE1 表達(dá)的升高可能部分地促進(jìn)AD的病理進(jìn)程，進(jìn)一步導(dǎo)致AD發(fā)病。

本研究通過對(duì)35例AD患者、33例MCI患者和22例正常人外周血BACE1(-407 至+60)啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的檢測(cè)，分析基因甲基化模式的改變?cè)贏D發(fā)病過程中所起的作用。BACE1基因在所研究的啟動(dòng)子區(qū)域分別有23個(gè)甲基化位點(diǎn)。我們研究了21個(gè)位點(diǎn)，其中大多數(shù)CpG位點(diǎn)甲基化程度很低，平均甲基化率小于10%，與MCI組和正常對(duì)照組相比，SAD組患者BACE1 啟動(dòng)子在-167,-46,-19,+23和+28CpG位點(diǎn)的甲基化程度明顯降低。MCI組與正常對(duì)照相比，各CpG位點(diǎn)甲基化程度的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，特定基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度與SAD發(fā)病有明顯的相關(guān)性，BACE1可能通過甲基化改變基因轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步影響淀粉樣蛋白β分泌酶的活性，從而導(dǎo)致AD發(fā)病。

本研究分析了甲基化水平與年齡的相關(guān)性，結(jié)果顯示BACE1基因(相關(guān)系數(shù)R=-0.643)啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化率與年齡之間存在負(fù)性線性相關(guān)。引起衰老的分子機(jī)制至少與兩個(gè)方面有關(guān),其一是細(xì)胞損傷的積累，其二是衰老的相關(guān)基因。表觀遺傳修飾是重要的基因調(diào)控手段，其在衰老中起重要作用。隨著年齡的增長，基因甲基化程度逐漸降低，而高齡是AD的重要危險(xiǎn)因素之一，因此推測(cè)DNA甲基化改變可能對(duì)AD發(fā)病起到一定作用。

基于以上理論和結(jié)論，為了進(jìn)一步闡明BACE1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的改變與AD的關(guān)系，我們進(jìn)行了功能學(xué)研究。通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了pGL-BACE1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞24 h后，進(jìn)行了復(fù)甲基化(SAM)、去甲基化(5-aza-CdR)及血清剝奪(降低能量和凋亡)等四種干預(yù)處理。熒光素酶報(bào)告分析顯示，在SY5Y細(xì)胞中，BACE1啟動(dòng)子質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性在Aβ25-35干預(yù)下與非處理組相比增加約20%。說明β淀粉樣蛋白可以影響B(tài)ACE1的表達(dá)。在雙熒光基因報(bào)告中，我們發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細(xì)胞中啟動(dòng)子的活性都較HeLa細(xì)胞中高，表明BACE1基因的表達(dá)具有神經(jīng)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)性。

SAM是DNA胞嘧啶甲基化的主要供甲基來源。在轉(zhuǎn)移甲基過程中SAM脫甲基變成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH可被水解成HCY。在維生素B12(VitB12)催化下，5-甲基甲氫葉酸鹽把甲基遞給HCY使其變成蛋氨酸(Met)。Met和三磷酸腺苷(ATP)反應(yīng)生成SAM，整個(gè)甲基循環(huán)就完成。AD患者的外周血具有高半胱氨酸、低VitB12和葉酸的特點(diǎn)[21]。我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SH-SY5Y和HeLa細(xì)胞后的基因檢測(cè)，結(jié)果顯示復(fù)甲基化試劑SAM可引起B(yǎng)ACE1啟動(dòng)子啟動(dòng)活性的改變。這個(gè)結(jié)果證實(shí)了DNA甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。其原因可能由于以下幾個(gè)方面：直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子和各種啟動(dòng)子識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合；甲基化的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子引起基因沉默[22]；通過影響核小體的位置或與其染色體蛋白質(zhì)相互作用而改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制[23]；甲基化結(jié)合蛋白2(mecp2)C端的轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域(TRD)可以與染色體結(jié)合，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)型，并與組蛋白脫乙?；?HDAC)等蛋白共同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[24]。

研究結(jié)果顯示，無論是在SH-SY5Y細(xì)胞中，還是在HeLa細(xì)胞中，每種啟動(dòng)子質(zhì)粒在血清剝奪和5-aza-CdR干預(yù)下的RLA與非處理組相比均無顯著性差異，即這些環(huán)境因素并沒有引起B(yǎng)ACE1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的變化。分析原因可能是由于啟動(dòng)子對(duì)這些干預(yù)因素敏感性較低，以上變化尚不能引起其轉(zhuǎn)錄活性的改變；另一方面，也可能由于重組質(zhì)粒中，BACE1啟動(dòng)子區(qū)甲基化率低，5-aza-CdR去甲基化處理不能明顯改變甲基化狀態(tài)，因此不能明顯改變轉(zhuǎn)錄活性。并且，AD是一種多個(gè)環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的疾病，單一的一種環(huán)境因素尚不能成功模擬AD的病理環(huán)境；最后，由于本研究是在體外環(huán)境下進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)功能研究，而在體內(nèi)各種因素的相互作用才是AD發(fā)生的真正環(huán)境，這也可能是導(dǎo)致出現(xiàn)以上陰性結(jié)果的主要原因。

通過以上的研究，我們發(fā)現(xiàn)了BACE1基因甲基化程度的改變與SAD發(fā)病有明顯相關(guān)性。SAM可以通過誘導(dǎo)甲基化抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而影響淀粉樣蛋白分泌酶的活性，進(jìn)一步導(dǎo)致AD發(fā)病。

目前關(guān)于阿爾茨海默病表觀遺傳的研究取得一定的進(jìn)展[25-27]，但認(rèn)識(shí)還不夠，基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在AD發(fā)生發(fā)展中所起的作用尚不清楚。甲基化可能會(huì)作為一個(gè)很好的分子標(biāo)志[19]，對(duì)SAD的早期篩查，診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后均具有重要的臨床意義，但尚需進(jìn)一步的深入研究。