馬宗軍，吳 鵬,丁小力,陳 振,于辛酉,張小羽

隨著人口老齡化速度加快，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(PO)已成為嚴(yán)重威脅中老年人生活質(zhì)量的慢性疾病[1-2]。骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展與多種因素密切相關(guān)。研究表明，遺傳因素與后天不同的生活方式及生活環(huán)境,如飲食習(xí)慣、身體鍛煉、年齡的老齡化與性別等均會(huì)對(duì)PO產(chǎn)生一定的影響[3-5]。MORRISON等[6]于1994年首次揭示維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性與骨密度有關(guān)以來，VDR被證實(shí)與OP疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。VDR基因位于染色體12q13-14。研究表明，炎癥、感染、自身免疫疾病、慢性代謝性疾病如糖尿病，甚至腫瘤等多種疾病均顯示出與VDR基因多態(tài)性的相關(guān)性[7-9]。大量研究顯示[10-11]，原發(fā)性骨質(zhì)疏松與VDR基因BsmⅠ多態(tài)性有關(guān)，但不同地區(qū)PO疾病中VDR基因多態(tài)性的差異性研究相對(duì)較少，且結(jié)論不一。而寧夏回族自治區(qū)地處我國西北地區(qū)，人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)及體育文化活動(dòng)與其他地區(qū)存在一定的差異。本研究旨在采用PCR-RFLP對(duì)寧夏地區(qū)老年女性PO患者VDR基因型頻率分布進(jìn)行檢測，探討其與VDR基因多態(tài)性分布的特征，為進(jìn)一步篩選女性的易感基因提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：根據(jù)我國骨質(zhì)疏松癥專家共識(shí)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，從寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院收集近3年(2016至2018年)骨科門診及住院患者中符合納入與排除標(biāo)準(zhǔn)的女性原發(fā)性PO患者(A組)230例，平均年齡(66.2±2.8)歲(55～78歲)，平均身高(160.5±3.4)cm(153.0～171.5 cm)，平均體重(58.9±5.3)kg (53.0～73.7 kg)。選擇與病例組相匹配的健康女性為對(duì)照組(B組)224例，平均年齡(65.2±2.7)歲(53～74)歲，平均身高(160.1±2.6)cm(159.7～170.1 cm)，平均體重(60.2±4.9)kg(52.7～74.8 kg)。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并與患者簽署相關(guān)知情同意，嚴(yán)格按照相關(guān)規(guī)定開展實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn)，按原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南(2001)[13]：①年齡≥55歲且為女性；②門診及住院除外與骨代謝相關(guān)性疾病的原發(fā)性PO；③所有患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①所有繼發(fā)PO；②既往存在骨代謝相關(guān)疾??；③既往服用抗骨質(zhì)疏松癥藥物者。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞DNA提取試劑盒采用德國Qiagen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit。PCR擴(kuò)增VDR所需的特異性上、下游引物是由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用美國Thermo公司Thermo ScientificTMPhusionTMkit。限制性內(nèi)切酶BsmⅠ為美國NEB生命科技有限公司產(chǎn)品。其他試劑如磷酸鹽緩沖液、乙醇、異丙醇、電泳試劑等均為國產(chǎn)分析純。

1.4 方法

1.4.1 提取外周血DNA:按照提取試劑盒說明書提取血液DNA。

1.4.2 擴(kuò)增VDR基因：PCR擴(kuò)增采用的上、下游引物，分別為5’-GAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3’ (30 bp)、5’-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC -3’(24 bp)[10]。50 μl反應(yīng)體系：2×Mix 25 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μl，模板 DNA 1 μl，加入ddH2O至總體積50 μl，95 ℃ 5 min；隨后95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠純化。

1.4.3 限制性酶切擴(kuò)增產(chǎn)物：采用BsmⅠ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)體系為：2 μl 10×buffer，0.5 μl(2U)BsmⅠ內(nèi)切酶，10 μl PCR產(chǎn)物，無菌去離子水補(bǔ)足總體積至20 μl，37 ℃過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后紫外檢測酶切結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，基因型頻率與遺傳平衡定律的符合Hardy-Weinberg定律。

2 結(jié)果

2.1 VDR基因擴(kuò)增及酶切鑒定結(jié)果:經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物為1850 bp，與 VDR基因DNA片段長度一致。 純化產(chǎn)物經(jīng)BsmⅠ酶切，缺乏相應(yīng)酶切位點(diǎn)為BB型(1 850 bp)，Bb型(1850、1 200、650 bp)為雜合子，bb型(1 200、650 bp)則代表存在相應(yīng)酶切位點(diǎn)的等位基因。本研究所有基因型頻率分布均符合 Hardy-Weinberg平衡，PO患者VDR基因以bb型居多，見圖1(目錄后)。

2.2 VDR基因型和等位基因頻率多態(tài)性分布:對(duì)所有患者的基因型頻率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，寧夏老年女性骨質(zhì)疏松患者bb、Bb、BB基因型頻率分布分別為78.69%、19.72%、1.59%。寧夏老年對(duì)照組女性bb、Bb、BB基因型頻率分布分別為66.81%、32.77%和0.42%。寧夏女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的VDR基因型頻率分布2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 2組老年女性骨質(zhì)疏松患者的VDR基因型與等位基因頻率比較

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是臨床上較為常見的一種慢性疾病，包括環(huán)境、基因遺傳、營養(yǎng)等多種原因?qū)е碌墓敲芏群凸琴|(zhì)量下降。而VDR基因是較早被確認(rèn)的與骨質(zhì)疏松相關(guān)的基因，其多態(tài)性與原發(fā)性骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究證實(shí)了寧夏地區(qū)老年女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者中VDR基因頻率的分布狀況，提示不同地區(qū)女性PO和VDR多態(tài)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

VDR是一種DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于外周血單核細(xì)胞和活化的T細(xì)胞[14]。VDR屬于核受體超家族，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。VDR基因最常見的多態(tài)性位點(diǎn)，包括BsmⅠ、FokⅠ、Taq Ⅰ和ApaⅠ酶切位點(diǎn)。本研究選取的BsmⅠ酶切位點(diǎn)，位于VDR基因第8個(gè)內(nèi)含子，其本身不表達(dá)為蛋白質(zhì)，但是會(huì)通過改變VDR基因mRNA的穩(wěn)定性、mRNA轉(zhuǎn)錄的剪接位點(diǎn)、或內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件，影響基因的表達(dá)及功能，是關(guān)鍵的VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)之一[15]。

維生素D是重要的骨代謝調(diào)節(jié)激素之一，不同群體之間VDR基因多態(tài)性的分布頻率具有顯著性差異[11]。美國、澳大利亞、法國以Bb基因型最多，其次為bb型，BB型占17%～22%[16]。本研究結(jié)果顯示，寧夏老年女性主要以bb基因型為主(78.69%)，BB基因型占僅1.59%，表明不同種族具有顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果與之前報(bào)道的中國新疆、內(nèi)蒙古地區(qū)VDR基因多態(tài)性的分布頻率相近，同時(shí)與韓國及日本的研究結(jié)果相近[11,17]。MORRISON等研究發(fā)現(xiàn)[6]，60歲以上健康婦女75%的BB基因型的骨密度低于骨折域，可能成為骨質(zhì)疏松患者，提示該基因型與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。

不同地區(qū)的VDR基因多態(tài)性分布還可能與人群的遺傳背景、生活習(xí)慣及地理環(huán)境等因素相關(guān)。遺傳因素在影響骨密度的因素中占著主要地位，根據(jù)VDR基因多態(tài)性的研究回顧，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)在BB基因型分布頻率上具有差異性，提示在今后的臨床實(shí)踐中或可根據(jù)不同地區(qū)將VDR基因型多態(tài)性作為骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)，同時(shí)對(duì)比和分析同一地區(qū)不同性別骨質(zhì)疏松患者VDR基因型頻率分布進(jìn)行檢測，對(duì)VDR基因多態(tài)性分布有重要的指導(dǎo)意義。研究寧夏老年女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的VDR基因多態(tài)性分布，將為評(píng)估此地區(qū)老年人群的PO相關(guān)并發(fā)癥如骨質(zhì)疏松性壓縮骨折的風(fēng)險(xiǎn)提供參考。