王涵，劉倩，郭子晨，王韻婷，王伶毓，趙江燕，張連中，孫雅煊*

（1．北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢驗(yàn)中心，北京 100191；3.北京鴻測(cè)科技發(fā)展有限公司，北京 100176）

腸道菌群是腸道中寄生的微生物總稱，可以分為有益菌群、中間菌群和有害菌群，各個(gè)菌群相互制約，相互依賴，能夠維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，對(duì)保持機(jī)體健康極其重要[1]。多項(xiàng)研究表明，腸道微生態(tài)紊亂與許多人類疾病有關(guān)，腸道菌群失調(diào)會(huì)導(dǎo)致糖尿病、心血管疾病和阿爾茨海默病等疾病[2-4]。因此，機(jī)體腸道菌群的良好共生關(guān)系與機(jī)體健康有著密切的聯(lián)系。

益生菌是對(duì)人體健康有益的活性微生物，可用來調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡，促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)的吸收[5]。乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌可以通過積極參與宿主物質(zhì)代謝的調(diào)控、免疫防御等方式建立腸道菌群的平衡，具有增強(qiáng)免疫力、改善血糖和血脂代謝、預(yù)防和改善酒精肝損傷等生理活性[6-9]。合生元是對(duì)宿主產(chǎn)生有益影響的益生菌和益生元混合物，通過促進(jìn)益生菌在宿主腸道內(nèi)定植增殖，同時(shí)發(fā)揮益生菌的生理活性和益生元的促生長(zhǎng)作用，更有利于宿主健康，可以維持腸道微生物菌群平衡，改善肝硬化患者肝功能，提高免疫調(diào)節(jié)能力等[10-11]。

乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalissub sp.lactisV9）是一種從健康兒童糞便中分離出來的動(dòng)物雙歧桿菌乳酸亞種，具有良好耐酸、耐膽鹽特性[12-14]。V9菌株可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，刺激抗體和細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體免疫力改善腹瀉，也可以增加腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量從而緩解便秘[15-16]。干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang）具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、改善血脂和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功能[17-19]。此外，干酪乳桿菌Zhang還可以增加腸道中的乳桿菌屬、羅氏菌屬、糞球菌屬等有益菌和抑制布勞特氏菌屬、雷爾氏菌屬等有害菌的生長(zhǎng)，起到調(diào)節(jié)腸道菌群作用[20-21]。植物乳桿菌 P-8（Lactobacillus plantarum P-8）是從牧民傳統(tǒng)發(fā)酵的奶制品中分離得到的一株益生菌，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品，能夠在體外抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，在臨床試驗(yàn)中口服植物乳桿菌P-8能夠增加腸道中的雙歧桿菌，減少致病菌[22-23]。鼠李糖乳桿菌R9639分離自天然發(fā)酵酸馬奶，具有良好的耐受性，能夠以活的狀態(tài)進(jìn)入人體腸道。上述幾種益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群方面表現(xiàn)出良好活性，因此研究者對(duì)這些菌株復(fù)配后的活性進(jìn)行分析。白曉曄[16]利用干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9混合受試于便秘患者，發(fā)現(xiàn)混合益生菌有助于調(diào)節(jié)炎癥因子，進(jìn)而改善便秘；Xu等[24]利用干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8和乳雙歧桿菌V9灌胃幼犬，發(fā)現(xiàn)其具有改善腹瀉的功效。上述復(fù)配菌劑的活性多集中在便秘腹瀉方面，鮮有研究將4種益生菌與益生元復(fù)配后對(duì)于抗氧化性、腸道菌群調(diào)節(jié)活性進(jìn)行研究。本研究按比例混合4種益生菌與低聚果糖，探究合生元制劑對(duì)小鼠腸道菌群影響及其抗氧化作用，為益生菌功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48只18 g～22 g BALb/c健康SPF級(jí)雄性小鼠、基礎(chǔ)飼料[許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008]：北京華阜康生物科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測(cè)中心SPF級(jí)動(dòng)物室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0038。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施方案已通過了北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)意見書編號(hào)2021-5）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

鼠李糖乳桿菌R9639、植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9：北京鴻測(cè)科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Infinite M NANO TECAN酶標(biāo)儀：廣州深華公司；UV-4802紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯儀器有限公司；CPA225D電子分析天平：美國(guó)Sartorius公司；Centrifuge 5702 RH-低速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；Hula Dancer basic渦旋混合儀：德國(guó)IKA公司；Milli-Q EQ 7000實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)：法國(guó)Millipore公司。

1.1.4 試劑

伊紅美藍(lán)瓊脂、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂、乳桿菌選擇性培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基、氯化鈉：麥克林試劑公司；冰乙酸、低聚果糖：海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷胱甘肽測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測(cè)定試劑盒、總超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒、丙二醛測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；白介素-6試劑盒、白介素-1β試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及動(dòng)物分組

將乳雙歧桿菌V9、植物乳桿菌P-8、干酪乳桿菌Zhang和鼠李糖乳桿菌R9639混勻（活菌數(shù)占比：V9為62.5%，Zhang為12.5%，R9639為12.5%，P8為12.5%），制備混合菌劑。48只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為4組，每組12只，記為對(duì)照組、L組（0.2×107CFU/kg+0.05 g/kg低聚果糖）、M 組（0.4×107CFU/kg+0.1 g/kg低聚果糖）和H組（1.2×107CFU/kg+0.3 g/kg低聚果糖），每日灌胃一次，連續(xù)灌胃14 d。每天記錄小鼠體重與攝食量。

1.2.2 臟器系數(shù)測(cè)定

灌胃14 d后，小鼠眼眶采血，脫頸處死，分別取小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、胸腺和小腸并測(cè)定質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞因子測(cè)定

各組小鼠眼眶采血至離心管中，制備血清，嚴(yán)格按照ELISA說明書檢測(cè)白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平。

1.2.4 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

取出各組小鼠肝臟、小腸，將0.9%生理鹽水和樣品按9∶1的體積比進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作測(cè)定肝臟、小腸組織中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-superoxide dismutase，T-SOD） 活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性。

1.2.5 菌群計(jì)數(shù)

第0天給予灌胃前和第14天給予灌胃后24 h，在無菌條件下?lián)烊∵m量小鼠糞便，在稀釋液中充分振蕩混勻，10倍系列稀釋至10-8。所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示。

表1 腸道菌群檢驗(yàn)用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件Table 1 Medium and culture conditions for intestinal flora test

1.2.6 糞便中腸道菌群的16S rDNA高通量測(cè)序分析

灌胃合生元制劑14 d后，收集4組小鼠的新鮮糞便0.5 g以上，提取并檢測(cè)樣本的基因組DNA，利用引物 341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖膠電泳純化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物，選擇主帶大小在400 bp～450 bp之間的序列，割膠回收目標(biāo)條帶，使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒構(gòu)建文庫，通過定量和文庫檢測(cè)上機(jī)測(cè)序。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，通過單因素方差分析對(duì)照組與各劑量組之間顯著性差異。小鼠腸道菌群計(jì)數(shù)，各劑量組與空白組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各組自身前后比較采用成對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 合生元制劑對(duì)小鼠體重與攝食量的影響

小鼠體重與攝食量見圖1。

圖1 合生元制劑對(duì)小鼠體重和攝食的影響Fig.1 Effect of synbiotics on body weight and food intake of mice

由圖1可知，與對(duì)照組相比，給予合生元制劑各組的小鼠的體重、攝食量差異不明顯。

2.2 合生元制劑對(duì)小鼠臟器影響

小鼠臟器系數(shù)見表2。

表2 小鼠臟器系數(shù)Table 2 Mouse organ coefficient

由表2可知，與對(duì)照組相比，各組小鼠的心、肝、脾臟、肺、腎和胸腺臟器系數(shù)無顯著差異。

2.3 合生元制劑對(duì)炎癥因子的影響

小鼠血清中IL-1β含量和血清中IL-6含量見圖2。

圖2 血清中IL-1β含量和血清中IL-6含量Fig.2 Serum IL-1β and IL-6 levels

由圖2可知，與對(duì)照組相比，H組IL-1β含量顯著下降（p＜0.05），IL-6含量有下降趨勢(shì)，但無顯著差異（p＞0.05）。IL-6參與體內(nèi)各種炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的免疫損傷，并在病毒感染及其進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[25]。IL-1β是由單核細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)關(guān)節(jié)內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)[26]。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食導(dǎo)致血清IL-1β和IL-6含量顯著增加，在給予乳雙歧桿菌V9后抑制了血清中IL-1β和IL-6 的產(chǎn)生[12]。Zheng等[27]發(fā)現(xiàn)，給予 1×105CFU 的干酪乳酸菌Zhang給哺乳期小鼠可以減少小鼠乳腺組織中炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)。本研究中IL-1β水平顯著降低，說明合生元制劑可能影響促炎因子的產(chǎn)生。

現(xiàn)如今國(guó)內(nèi)的電力企業(yè)使用監(jiān)測(cè)系統(tǒng)時(shí)結(jié)合自動(dòng)化技術(shù)具有重要的影響作用，合理使用自動(dòng)化在線檢測(cè)，可以及時(shí)找出設(shè)備運(yùn)行期間的故障，并可對(duì)設(shè)備運(yùn)行的安全性起到保障作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)供電系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)采集工作。通常情況下，國(guó)內(nèi)的自動(dòng)化監(jiān)測(cè)系統(tǒng)在監(jiān)測(cè)技術(shù)研究領(lǐng)域一直使用到大量的人力、物力，且監(jiān)測(cè)技術(shù)的開發(fā)和利用更是為實(shí)現(xiàn)電力系統(tǒng)的自動(dòng)化管理，并在減少成本的同時(shí)還可以有效提升我國(guó)電力企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和運(yùn)行效率。

2.4 合生制劑對(duì)抗氧化指標(biāo)的影響

小鼠小腸及肝臟組織抗氧化指標(biāo)見表3。

表3 合生元制劑對(duì)小鼠小腸及肝臟組織抗氧化指標(biāo)Table 3 Antioxidant indexes of small intestine and liver tissues in mice administrated with synbiotics

由表3可知，在小腸和肝臟組織中，與對(duì)照組相比，各個(gè)劑量組T-SOD活力、GSH含量和GSH-Px活力均有明顯的升高，其中，H組有極顯著升高（p＜0.01）。小腸組織中的M、H組MDA含量顯著降低（p＜0.05），肝臟組織中的H組MDA含量顯著降低（p＜0.05），說明合生元制劑有著較好的抗氧化能力。李欣益等[28]曾探討益生菌雙歧桿菌V9對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠肝功能、氧化應(yīng)激及脂代謝的影響，研究發(fā)現(xiàn)灌胃V9的大鼠肝臟MDA含量顯著降低，SOD活力顯著升高。

2.5 益生菌對(duì)小鼠腸道微生物的影響

2.5.1 合生元制劑對(duì)常見腸道微生物的影響

小鼠腸道微生物含量見表4。

表4 對(duì)小鼠腸道微生物含量的影響Table 4 Effect of synbiotics on mouse intestinal flora lg CFU/g

由表4可知，各組灌胃前各類微生物含量均無明顯差異。灌胃14 d后，對(duì)照組灌胃前后對(duì)比無差異。各劑量組的腸桿菌、腸球菌這兩種有害菌灌胃前后對(duì)比無顯著差異，L組的乳桿菌和雙歧桿菌這兩種有益菌灌胃前后對(duì)比顯著增加（p＜0.05），M、H組乳桿菌、雙歧桿菌胃前后對(duì)比極顯著增加（p＜0.01）。

與對(duì)照組相比，灌胃14 d后，各劑量組的腸桿菌、腸球菌均無顯著差異（p＞0.05）。各劑量組乳桿菌、雙歧桿菌都明顯增加，M、H組效果極顯著（p＜0.01）。

綜上可以說明灌胃合生元制劑可以促進(jìn)有益菌的增長(zhǎng)，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。

2.5.2 對(duì)腸道微生物多樣性的影響

圖3 各組小鼠腸道菌群門水平的物種相對(duì)豐度Fig.3 Effect of synbiotics on relative abundance of dominant phyla

圖4 各組小鼠腸道菌群屬水平的物種相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal microflora in mice

如圖3、圖4所示，經(jīng)過各組的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：在門水平上，各組主要由Firmicutes和Bacteroidota組成，與對(duì)照組相比，各個(gè)組Actinobacteriota豐度明顯增加，L組 Verrucomicrobiota明顯增加，M、H組 Verrucomicrobiota明顯減少。在屬水平上，對(duì)照組主要包括Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group，L組主要包括 GCA-900066575、Bacteroides、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lactobacillus、Bifidobacterium，M、H 組主要包括 Bacteroides、Alistipes、Lachnospiraceae_NK4-A136_group、Lactobacillus、Bifidobacterium。與對(duì)照相比各劑量組Lactobacillus、Bifidobacterium均明顯增多，Lachnospiraceae_NK4A136_group減少。

差異物種相對(duì)豐度聚類熱圖見圖5。

圖5 差異物種相對(duì)豐度聚類熱圖Fig.5 Heat map of relative abundance of differential taxa

由圖5可以看出，與對(duì)照組相比，L組Rikenella顯著增加（p＜0.05）、achnospiraceae_NK4A136_group和Lachnospiraceae_UCG-001顯著減少（p＜0.05）。M組Roseburia、Muribaculum 顯著減少（p＜0.05），Bifidobacterium 顯著增加（p＜0.05），GCA-900066575、Lachnospiraceae_UCG-001 極顯著減少（p＜0.01），Rikenella、unidentified_Ethanoligenenaceae、Alistipes、Odoribacter、Lac －tobacillus極顯著增加（p＜0.01）。H組Bacteroides顯著減少，Bifidobacterium、Helicobacter、Lactobacillus、Rikenella、Alistipes顯著增加（p＜0.05）。

M、H 組中 Alistipes、Bifidobacterium 和 Lactobacillus顯著增加（p＜0.05），Alistipes可能與肝纖維化、結(jié)腸炎、癌癥免疫治療和心血管疾病相關(guān)[29]。Sung等[30]將患有退補(bǔ)償性肝硬化的患者與急性肝腦病患者之間的糞便微生物群進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)Alistipes豐度減少與肝腦病復(fù)發(fā)的增加有關(guān)。雙歧桿菌（Bifidobacterium）是人類胃腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群之一，可以有效抑制腸道病原體的抑制和輪狀病毒感染[31]。乳酸菌（Lactobacillus）可以改善胃腸道功能、抑制腸道內(nèi)有害菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力等功能[32]。

MRPP分析，主要是用于分析高維度數(shù)據(jù)組間相似性的統(tǒng)計(jì)方法。MRPP分析見表5。

表5 MRPP分析Table 5 Multi-response permutation procedure（MRPP）analysis

對(duì)組間群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行MRPP分析，A＞0表示各組間差異大于組內(nèi)差異，組間差異大，顯著性小于0.05說明差異顯著[33]。由表5可知，與對(duì)照組相比，各個(gè)組的組間差異均大于組內(nèi)差異，其中對(duì)照組與M、H組有極顯著差異（顯著性＜0.01）。

3 結(jié)論

根據(jù)各組小鼠腸道中菌群含量變化差異及菌群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，合生元制劑可以增加小鼠腸道中雙歧桿菌及乳桿菌，增加有益菌豐度，與此同時(shí)抑制炎癥因子產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化能力。本次研究結(jié)果進(jìn)一步探究了益生菌在腸道中的作用，為研究合生元制劑在功能食品中的開發(fā)與研究提供幫助。