黃曉莉，楊 慧，吳 玲，張春花，文海云，吳曉麗

(1.淮安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 淮安 223002；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院,江蘇 南京 210004)

子宮肌瘤是育齡期婦女最常見的良性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但病因尚不明確[1]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)是自身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的一類RNA分子[2]。研究表明，lncRNAs雖然不能直接轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的各類蛋白質(zhì)，但其本身具有較強(qiáng)大的調(diào)控功能[3]。近年來，lncRNAs在子宮肌瘤臨床預(yù)測、診斷和治療中的作用日益受到重視，有研究將lncRNAs作為預(yù)測年輕子宮平滑肌瘤患者是否進(jìn)展為靜脈內(nèi)平滑肌瘤病的生物學(xué)標(biāo)志[4]。本研究旨在探討lncRNAs在子宮平滑肌瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究隨機(jī)選取2016年1月至2020年12月于我院因單發(fā)、多發(fā)性(≥2個)子宮肌瘤入院行手術(shù)子宮肌瘤切除術(shù)(開腹、經(jīng)陰道、腹腔鏡)的25～50歲患者為研究對象，各100例。單發(fā)子宮肌瘤組患者平均年齡 39.7歲(25～50歲)，多發(fā)性子宮肌瘤組平均年齡43歲(27～50歲)。取樣的子宮肌瘤直徑均>5cm，選取其切除后或旋切術(shù)中留取的腫瘤瘤心為肌瘤組，選取內(nèi)膜下1cm組子宮肌壁層為對照組，切除的標(biāo)本組織存放于-80℃低溫冰箱。本研究通過淮安市婦幼保健院倫理委員會審查，患者均知情同意。

1.2 lncRNAs的篩選

采用NONCODE科學(xué)數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址為http://www.noncode.org)選取與子宮及子宮肌瘤組織相關(guān)的lncRNAs，從中篩選出子宮肌瘤相關(guān)研究尚未報道的lncRNAs：LINC00958、MIR4435、SNHG5。

1.3 研究方法

收集的臨床樣品首先抽提RNA，通過質(zhì)檢合格后，RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)使用管家基因GAPDH(不同樣品間表達(dá)量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

1.3.1 RNA提取與質(zhì)量檢測

設(shè)計并合成qRT-PCR引物(表1)，引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG(SYBR?Green)的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。取適量新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品(50～100mg)，加入1mL的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen)，勻漿后抽提RNA。

表1 qRT-PCR的合成引物列表

采用紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度。使用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)使用說明將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2相對定量實驗

進(jìn)行相對定量實驗前，需將樣品的目的基因及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，用以做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的qRT-PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增和檢測，其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司。對檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品目的基因相對含量。得出qRT-PCR實驗結(jié)果及相關(guān)圖表。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 lncRNAs在四組標(biāo)本中的表達(dá)比較

方差分析顯示，LINC00958、MIR4435和SNHG5在單發(fā)性子宮肌瘤組、單發(fā)性子宮肌瘤對照組、多發(fā)性子宮肌瘤組、多發(fā)性子宮肌瘤對照組四組標(biāo)本中表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別是907.400、26.160、3.390，P<0.05)，見表2。

表2 lncRNAs在四組標(biāo)本中的表達(dá)比較

2.2 lncRNAs在多發(fā)性子宮肌瘤患者兩組標(biāo)本中的表達(dá)

對單發(fā)性肌瘤組與對照組之間、多發(fā)性肌瘤組與對照組之間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示LINC00958在單發(fā)、多發(fā)性肌瘤組中的表達(dá)(5.81×10-4±0.32×10-4、5.83×10-4±3.14×10-4)均低于其相應(yīng)的對照組(1.23×10-3±0.75×10-3、1.88×10-3±0.40×10-3)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別是79.690、32.080，P<0.05)；而MIR4435、SNHG5在單發(fā)、多發(fā)性肌瘤組中的表達(dá)與其相應(yīng)的對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(tMIR4435值分別是1.869、0.077,tSNHG5值分別是0.671、1.229，P>0.05)，見表3。

表3 lncRNAs在肌瘤組與對照組標(biāo)本之間的兩兩比較

2.3 lncRNAs在單發(fā)性與多發(fā)性子宮肌瘤標(biāo)本間的表達(dá)

對單發(fā)與多發(fā)性肌瘤組之間、單發(fā)與多發(fā)性肌瘤對照組之間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示LINC00958、MIR4435、SNHG5單發(fā)與多發(fā)性肌瘤對照組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別是15.910、6.342、2.717，P<0.05)；MIR4435在單發(fā)與多發(fā)性肌瘤組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.102，P<0.05)，而LINC00958、SNHG5在單發(fā)與多發(fā)性肌瘤組之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別是0.421、1.071，P>0.05)，見表4。

表4 3種lncRNAs在單發(fā)性與多發(fā)性子宮肌瘤標(biāo)本之間的兩兩比較

3 討論

3.1 常見的單發(fā)性子宮肌瘤和多發(fā)性子宮肌瘤存在不同

子宮肌瘤是育齡期婦女最常見的良性腫瘤，多見于30～50歲婦女，其診斷金標(biāo)準(zhǔn)為病理檢查，病理類型以子宮平滑肌瘤為主，由平滑肌及結(jié)締組織組成。子宮肌瘤的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但其病因與發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與正常肌層的細(xì)胞突變、性激素及局部生長因子間的相互作用等有關(guān)[5]。臨床上常見的肌瘤有單發(fā)性子宮肌瘤和多發(fā)性子宮肌瘤，相關(guān)文獻(xiàn)報道單發(fā)性子宮肌瘤是由單克隆平滑肌細(xì)胞增殖而成，而多發(fā)子宮肌瘤是由不同克隆細(xì)胞形成[6]。本研究中單發(fā)與多發(fā)性肌瘤對照組之間的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 lncRNAs在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起作用

lncRNAs以往長期被認(rèn)為是人類基因組中不具有生物學(xué)功能的“暗物質(zhì)”；但近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNAs可以參與人類基因的轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，在染色質(zhì)修飾及基因組印記等層面也同樣能夠起到調(diào)控作用[7]。某些特定的lncRNAs在特定的腫瘤細(xì)胞中可以檢測出表達(dá)水平的改變，可作為腫瘤早期預(yù)防、診斷與治療方面新的分子生物學(xué)標(biāo)記及臨床監(jiān)測指標(biāo)[8]。有研究采用高通量基因芯片技術(shù)方法檢測子宮肌瘤組織與正常子宮肌層組織中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)情況，以期闡明lncRNAs 在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，為患者個體化基因治療提供理論依據(jù)[9]。

3.3 lncRNALINC00958、MIR4435、SNHG5在單發(fā)性和多發(fā)性子宮肌瘤中的表達(dá)

lncRNA LINC00958定位于人染色體11p15.3，參與八類腫瘤的表達(dá)上調(diào)，包括肝細(xì)胞肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等，且與腫瘤患者的臨床病理分期以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)[10,11]。LINC00958被廣泛研究報道為促癌基因，用于腫瘤的臨床預(yù)防、診斷、治療的新靶標(biāo)，但其在子宮內(nèi)膜癌的研究中被發(fā)現(xiàn)為抑癌基因[12]；而lncRNA LINC00958在子宮肌瘤組織中的表達(dá)尚無研究報道。子宮肌瘤雖然大多數(shù)是良性腫瘤，但也存在類似于惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、種植、復(fù)發(fā)等情況[13]。進(jìn)一步研究LINC00958在子宮肌瘤中的作用，可以為臨床預(yù)測子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00958在單、多發(fā)性肌瘤組中的表達(dá)均低于其相應(yīng)的對照組表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

MIR4435-2HG定位于人2號染色體長臂，研究表明其與卵巢癌、乳腺癌、胃腸癌和頭頸部腫瘤等有關(guān)[14-16]。Ouyang等人研究發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG可能通過P38/MAPK和VEGF途徑參與惡性腫瘤的發(fā)展[17]。MIR4435-2HG在子宮肌瘤組織中的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報道，本研究發(fā)現(xiàn)其在單發(fā)與多發(fā)性肌瘤組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但在單發(fā)及多發(fā)性子宮肌瘤標(biāo)本中的MIR4435表達(dá)量與其對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異。

SNHG5是核仁小分子非編碼RNA宿主基因家族成員之一，定位于人6q15染色體，與乳腺癌、鼻咽癌、食管癌、骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)[18-20]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SNHG5通過SNHG5/miR-25-3p/BTG2軸在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[21]。此外，SNHG5還可通過負(fù)調(diào)控miR-132，促進(jìn)SOX4表達(dá)，從而促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[22]。SNHG5在子宮肌瘤組織中的表達(dá)尚無文獻(xiàn)報道，本研究發(fā)現(xiàn)其在單發(fā)及多發(fā)性子宮肌瘤標(biāo)本中的表達(dá)量均無統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述，本課題通過NONCODE科學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選出與子宮及宮頸組織相關(guān)的lncRNA LINC00958、MIR4435、SNHG5，發(fā)現(xiàn)LINC00958在單發(fā)及多發(fā)子宮肌瘤標(biāo)本中的表達(dá)量均顯著低于肌瘤旁組織，為揭示子宮肌瘤lncRNA通路的發(fā)病分子機(jī)制，及子宮肌瘤的預(yù)測與治療提供了新線索。未來應(yīng)進(jìn)一步研究LINC00958如何在子宮肌瘤的發(fā)病過程發(fā)揮抑制作用，可通過檢測LINC00958的表達(dá)劃分高危人群，預(yù)測子宮肌瘤的發(fā)生。此外，以LINC00958為靶點，還可指導(dǎo)子宮肌瘤治療方法的選擇與應(yīng)用。