文│王書敏（江蘇省泗陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)站）

隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，我國(guó)臨床分離的一些細(xì)菌對(duì)某些藥物的耐藥性已居世界首位，耐藥菌繼發(fā)感染人數(shù)已占住院感染患者總?cè)藬?shù)的30%左右。令人擔(dān)憂的是，開發(fā)一種新的抗菌藥一般需要大約10年的時(shí)間，而近幾年一代耐藥菌株的產(chǎn)生只需要2年時(shí)間，細(xì)菌耐藥性的增長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過新藥研發(fā)速度。目前能與細(xì)菌感染對(duì)抗的抗菌藥數(shù)量不斷減少、活性不斷減弱，如任其發(fā)展，人類將面臨隨之而來的“后抗生素時(shí)代”，即對(duì)細(xì)菌性感染束手無策的黑暗時(shí)代。因此，開發(fā)抗耐藥性藥物引起了包括歐美在內(nèi)越來越多國(guó)家的重視。

近年來，有望作為抗生素替代品之一的中藥研究取得了一定的進(jìn)展。如宓偉等研究表明，中藥黃連、黃柏、大黃、銀柴胡和石榴皮水煎液具有較強(qiáng)的抗菌作用。冷會(huì)勇等認(rèn)為，中藥用于臨床多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的治療具有一定的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。其他研究表明，中藥能降低耐藥菌所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的活性，使其部分或全部恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性，延長(zhǎng)抗生素的使用壽命。

16S rRNA甲基化酶是臨床菌產(chǎn)生的一種介導(dǎo)4，6-二脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素耐藥的耐藥決定因子。該耐藥決定因子的遺傳背景中含有質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列等可動(dòng)遺傳因子，因此，在臨床耐藥菌中具有廣泛傳播的能力。本研究以構(gòu)建的16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌及10種中藥免煎顆粒為研究對(duì)象，研究10種中藥免煎顆粒對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的影響，以期為臨床開發(fā)抗菌新藥及新制劑奠定基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1.材料。

（1）菌株。16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌、質(zhì)控菌E.coli ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

（2）培養(yǎng)基。水解酪蛋白肉湯（MH Broth）、水解酪蛋白瓊脂（MH agar），購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。紅四氮唑購(gòu)自揚(yáng)州科能生物技術(shù)有限公司。

（3）主要儀器設(shè)備。

（4）供試藥物。

2.方法。

（1）受試藥液的制備及稀釋。稱取受試中藥顆粒，分別用滅菌超純水溶解成表1的藥物濃度，針頭濾器過濾后分裝，于-20℃或-70℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 藥物貯備液配制濃度表

（2）菌液制備。在MH瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于2～5毫升Muller-Hinton（MH）肉湯管中，37℃振蕩培養(yǎng)4～8小時(shí)，用調(diào)節(jié)過鈣鎂離子的MH肉湯稀釋菌液，使稀釋菌液達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫龋侔?∶100稀釋菌液至含菌量約為1×106CFU/毫升，備用。

（3）MICs測(cè)定。首先向96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入稀釋好的菌液（1×106CFU，毫升）100微升，再向第一排孔中加入稀釋好的藥液100微升，混合均勻。取第一排的混合液100微升至第二排，混合均勻后依次稀釋至最后一排，棄去最后的100微升。稀釋菌液于15分鐘內(nèi)接種完畢。37℃培養(yǎng)16～18小時(shí)，每次做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)定3個(gè)對(duì)照組，分別為質(zhì)控菌組（大腸桿菌ATCCR25922），只加菌液不加藥物組，不加藥液和菌液組。

（4）結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。觀察結(jié)果2小時(shí)前，向每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入0.5%的紅四氮唑溶液5微升，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

電子天平images/BZ_48_933_2092_2268_2135.pngimages/BZ_48_933_2184_2268_2227.pngimages/BZ_48_933_2275_2268_2318.png上海精密科學(xué)儀器有限公司凈化工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器毫升S-3020（2-09-1032） 日本

當(dāng)只加菌液不加藥物時(shí)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)，呈現(xiàn)紅色，不加藥液和菌液的對(duì)照組無細(xì)菌生長(zhǎng)，呈現(xiàn)無色，試驗(yàn)組小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為MIC值（小孔呈現(xiàn)無色）。當(dāng)出現(xiàn)單一跳孔，記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度，如出現(xiàn)多孔跳孔現(xiàn)象，則不記錄結(jié)果，重新試驗(yàn)。

二、結(jié)果

由表2可知，10種中藥免煎顆粒對(duì)16S rRNA甲基化酶耐藥重組菌的最低抑菌濃度分別為20（黃連）、80（黃芩）、80（黃柏）、320（苦參）、320（穿心蓮）、80（連翹）、1280（白頭翁）、160（蒲公英）、10（五倍子）、80（烏梅）毫克/毫升。

表2 10種中藥對(duì)16SrRNA甲基化酶耐藥大腸桿菌的體外抑菌活性

images/BZ_49_213_508_1547_551.png黃柏顆粒 2014-12-5 1412017 6 江陰天江藥業(yè)有限公司images/BZ_49_213_599_1547_642.png蒲公英顆粒 2015-1-20 1501053 15 江陰天江藥業(yè)有限公司images/BZ_49_213_691_1547_734.png烏梅顆粒 2014-12-16 1412062 10 江陰天江藥業(yè)有限公司images/BZ_49_213_782_1547_825.png黃芩炭顆粒 2013-3-5 1303143 10 江陰天江藥業(yè)有限公司images/BZ_49_213_874_1547_917.png五倍子顆粒 2014-8-20 1408125 3 江陰天江藥業(yè)有限公司images/BZ_49_213_966_1547_1008.png

三、分析與討論

中藥免煎顆粒是在中藥飲片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種中藥新劑型，它具有給藥劑量較準(zhǔn)確、藥效穩(wěn)定、藥量易于控制等優(yōu)點(diǎn)。因此，在臨床應(yīng)用上存在廣闊的發(fā)展空間。本研究結(jié)果表明，10種中藥免煎顆粒對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的體外抑菌作用各不相同。其中以黃連、五倍子對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的體外抑菌最強(qiáng)，有望成為抗耐藥菌感染的藥源。

五倍子（Galla chinensis）具有斂肺降火、澀腸止瀉、斂汗止血、收濕斂瘡等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，五倍子具有抗菌、抗病毒、清除自由基等作用，在臨床上配合其他藥物治療腹瀉、口腔潰瘍、腎囊腫等疾病，獲得了較好的療效。李仲興等研究結(jié)果表明，五倍子水煎劑的MIC為0.102毫克/毫升，低于本研究中五倍子對(duì)16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的MIC值（10毫克/毫升）。同時(shí)，李仲興等研究表明五倍子對(duì)甲氧西林金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC50分別為0.051毫克/毫升，高于本研究結(jié)果。

黃連（Coptidis rhizoma）有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，現(xiàn)代研究表明，黃連的有效成分具有抗菌、抗病毒、抗真菌和抗寄生蟲等藥理作用。譚榀新等研究表明黃連提取物對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的耐藥蛋白質(zhì)圖譜發(fā)生改變。張景皓等研究表明，不同濃度的黃連溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌未呈現(xiàn)抑菌活性，對(duì)D群屎腸球菌、大腸桿菌的MIC均為0.063克/毫升。本研究中，黃連對(duì)16SrRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的MIC為20毫克/毫升，高于黃連水煎液對(duì)D群屎腸球菌、大腸桿菌的MIC。

中藥不但可直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，還可通過抑制細(xì)菌呼吸、糖及其中間產(chǎn)物及核酸、蛋白質(zhì)的代謝達(dá)到抑菌作用。另外，中藥可通過增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能而達(dá)到清除細(xì)菌的作用。本課題組通過初步研究表明，中藥五倍子、黃連、黃芩對(duì)耐藥菌有一定的抑菌作用，而這些藥物通過哪種機(jī)制發(fā)揮作用，將有待于做進(jìn)一步的研究和探索。

四、結(jié)論

中藥黃連、五倍子對(duì)16SrRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌有較強(qiáng)的抑制作用，表明這兩種中藥對(duì)16S rRNA甲基化酶多重耐藥菌感染的治療具有一定的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。