龐曉軍 盧琳琳 黎東旺 趙一宇 劉國(guó)勇

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）08-0968-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.08.11

摘 要 目的 探究鬼針草總黃酮（TFB）對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞胰島素抵抗（IR）的影響。方法 取鬼針草，用80%乙醇回流提取，制得TFB。利用棕櫚酸體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞復(fù)制IR模型，考察低、中、高質(zhì)量濃度（20、40、80 mg/L）TFB對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響;以二甲雙胍為陽(yáng)性對(duì)照，考察低、中、高質(zhì)量濃度（20、40、80 mg/L）TFB對(duì)細(xì)胞中胰島素受體底物1（IRS-1）、c-Jun氨基端激酶（JNK）和蛋白激酶C（PKC）表達(dá)的影響。采用分子對(duì)接技術(shù)探討槲皮素、槲皮苷等8個(gè)TFB主要活性成分與IRS-1、JNK、PKC蛋白的相互作用。結(jié)果 TFB低、中、高質(zhì)量濃度組細(xì)胞的葡萄糖消耗量均較模型組顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與正常組比較，模型組細(xì)胞中的IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)量均顯著降低，PKC蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組和二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組能上調(diào)IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)并下調(diào)PKC蛋白的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。TFB中的海生菊苷與IRS-1蛋白的分子對(duì)接能量打分值為-7.9 kcal/mol（1 kcal=4.816 kJ），海生菊苷、蘆丁與JNK蛋白的分子對(duì)接能量打分值均為-9.3 kcal/mol，槲皮苷與PKC蛋白的分子對(duì)接能量打分值為-4.9 kcal/mol，成分與蛋白間的相互作用包括形成氫鍵、疏水鍵等。結(jié)論 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR有顯著的改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IRS、JNK、PKC蛋白的表達(dá)有關(guān);海生菊苷、蘆丁和槲皮苷可能是改善IR的潛在活性成分。

關(guān)鍵詞 鬼針草總黃酮;人肝癌HepG2細(xì)胞;胰島素抵抗;胰島素受體底物1、c-Jun氨基端激酶;蛋白激酶C;分子對(duì)接

Effects of total flavonoids of Bidens pilosa on insulin resistance in HepG2 cells

PANG Xiaojun1，2，LU Linlin2，LI Dongwang1，2，ZHAO Yiyu3，LIU Guoyong4（1. Dept. of Pharmacy， the Second People’s Hospital of Qinzhou， Guangxi Qinzhou 535000， China; 2. College of Pharmacy， Guangxi Medical University， Nanning 530021， China; 3. Dept. of Rehabilitation，the Second People’s Hospital of Qinzhou， Guangxi Qinzhou 535000， China; 4. Dept. of Radiology， the Second People’s Hospital of Qinzhou， Guangxi Qinzhou 535000， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To explore the effects of total flavonoids of Bidens polisa L. （TFB） on insulin resistance （IR） of HepG2 cells. METHODS B. polisa L. was refluxed and extracted with 80% ethanol to obtain TFB. Palmitic acid was used to induce IR mode of HepG2 cells in vitro. The effects of low-concentration， medium-concentration and high-concentration （20， 40， 80 mg/L） of TFB on the consumption of glucose were investigated. Using metformin as positive control， the effects of low-concentration， medium-concentration and high-concentration （20， 40， 80 mg/L） of TFB on the protein expression of insulin receptor substrate-1 （IRS-1）， c-Jun N-terminal kinase （JNK） and protein kinase C （PKC） were investigated. Molecular docking technology was used to explore the interaction between eight main active components of TFB such as quercetin， quercitrin and IRS-1， JNK and PKC proteins. RESULTS The glucose consumption of TFB low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with normal group， the expression of IRS-1 and JNK protein in the model group decreased significantly， and the expression of PKC protein increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the protein expression of IRS-1 and JNK could up-regulated while the protein expression of PKC down-regulated in TFB low-concentration， medium-concentration and high-concentration groups and metformin positive control group （P<0.05 or P<0.01）. The score of molecular docking energy between maritimetin in TFB and IRS-1 protein was ? -7.9 kcal/mol （1 kcal=4.816 kJ）. The scores of molecular docking energy of maritimetin， rutin and JNK protein were -9.3 kcal/mol. The score of molecular docking energy between quercitrin and PKC protein was -4.9 kcal/mol. Interactions between components and proteins included forming hydrogen bonds， hydrophobic bonds and so on. CONCLUSIONS TFB can significantly improve IR of HepG2 cells， the mechanism of which may be related to the regulation of protein expression of IRS， JNK and PKC. Maritimetin， rutin and quercitrin may be potential active ingredients for improving IR.

KEYWORDS ? total flavones of Bidens polisa L.; human hepatoma HepG2 cells; insulin resistance; insulin receptor substrate-1; c-Jun N-terminal kinase; protein kinase C; molecular docking

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指機(jī)體對(duì)胰島素生物反應(yīng)性降低的一種現(xiàn)象，表現(xiàn)為胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性分泌過(guò)多胰島素而產(chǎn)生高胰島素血癥[1]。IR是代謝綜合征、2型糖尿病、高血壓、心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅人類的健康[2]。IR的患病率正在增加，尤其是在發(fā)展中國(guó)家的年輕人口中，患病率達(dá)20%～40%[3]。中醫(yī)藥在改善IR方面具有效果顯著、成本低、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)，探究中藥對(duì)IR的作用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[4]。據(jù)最新報(bào)道顯示，近5年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有IR改善作用的中藥活性成分有35種，其中黃酮類成分有11種，約占三分之一。鬼針草總黃酮（total flavonoids of Bidens polisa L.，以下簡(jiǎn)稱“TFB”）是其中的主要代表成分[4]。TFB具有抗炎、抗氧化、抗肝纖維化等多種藥理作用[5]。有研究指出，c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路在IR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6]。黃酮類化合物在改善IR方面具有明顯的作用，且這種作用可能與調(diào)控JNK信號(hào)通路有關(guān)[7]。雖然已有報(bào)道指出，TFB可以通過(guò)調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶1/葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（phosphoinositide 3-kinase/serine-threonine protein kinase 1/glucose transporter protein 4，PI3K/AKT1/GLUT4）信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子編碼基因及蛋白的表達(dá)來(lái)改善HepG2細(xì)胞的IR狀態(tài)[8]，但有關(guān)TFB對(duì)IR及JNK相關(guān)信號(hào)通路的作用尚待進(jìn)一步的探究。為此，本研究擬復(fù)制HepG2細(xì)胞IR模型并結(jié)合分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，探討TFB改善IR的可能作用機(jī)制，為研發(fā)改善IR作用的潛在活性藥物提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有SpectraMax Plus 384型酶標(biāo)儀（香港分子儀器公司），ZF-2型三用紫外分析儀（上海市安亭電子儀器廠），Odyssey型紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司），PowerPac Basic電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），3111型二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），SHA-CA型恒溫水浴鍋（常州易晨?jī)x器制造有限公司），1334型無(wú)菌操作臺(tái)（長(zhǎng)沙米淇?jī)x器設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

鬼針草藥材（批號(hào)20190604）購(gòu)自欽州醫(yī)藥有限責(zé)任公司，經(jīng)欽州市第二人民醫(yī)院趙一宇副主任中醫(yī)師鑒定為菊科鬼針草屬植物鬼針草B. polisa L.的地上部分。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201711，純度≥98%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;HPD-100大孔吸附樹脂（粒度16～60目，批號(hào)20180424）購(gòu)自天津市海光化工有限公司;棕櫚酸（palmic acid，PA）對(duì)照品（批號(hào)P104234，純度≥99%）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（批號(hào)分別為20181112、20181121）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;鹽酸二甲雙胍腸溶片（批號(hào)20181114，規(guī)格0.5 g）購(gòu)自貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）消化液、青鏈霉素混合液、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、10×TBST緩沖液（批號(hào)分別為20181129、20181212、20181030、20181025、20181220、20181201）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western一抗稀釋液、Western二抗稀釋液（批號(hào)分別為20181127、20181124、P0256、P0258）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒（批號(hào)20180205）購(gòu)自上海榮盛生物藥業(yè)股份有限公司;兔源JNK單克隆抗體、兔源胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）單克隆抗體（批號(hào)分別為9252、2382）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Tchnology公司;兔源蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）多克隆抗體（批號(hào)ab182126）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;小鼠源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)10021293）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglo- bulin G，IgG）二抗（批號(hào)BST16K26C16L54）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

2 方法

2.1 TFB的制備及純度測(cè)定

參考杜利月等[9]、瞿慧等[10]的研究方法并進(jìn)行改良：取鬼針草藥材適量，用10倍量的80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，合并提取液;將提取液過(guò)濾、合并、濃縮至無(wú)醇味，加適量熱水，超聲促溶，冷卻后抽濾，得濾液。濾液經(jīng)預(yù)處理好的HPD-100大孔吸附樹脂吸附24 h后，先以2倍柱體積的水洗去雜質(zhì)，再用3倍柱體積的70%乙醇進(jìn)行洗脫并收集洗脫液，濃縮至無(wú)乙醇味，冷凍干燥后即得TFB樣品（每1 kg鬼針草藥材得TFB樣品54 g），采用紫外分析儀于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)得其純度為52.72%（以蘆丁計(jì)）。

2.2 TFB和PA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按5×104個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空白組。實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的TFB[5、10、20、40、80、160 mg/L，以含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)基（后同）配制，濃度參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]，對(duì)照組加入含0.5%DMSO的完全培養(yǎng)基，空白組加入不含細(xì)胞、不含藥物的完全培養(yǎng)基，每孔加入量均為100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5%CO2條件（后同）下培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/L的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后，吸棄上層液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩脫色10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（optical density，OD）并計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）×100%。上述步驟均需避光操作。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，檢測(cè)PA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，PA濃度分別為50、75、100、125、150、175、200 μmol/L（以完全培養(yǎng)基為溶劑，濃度參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，作用時(shí)間設(shè)為24 h和48 h，其余設(shè)置與操作同前。

2.3 HepG2細(xì)胞IR模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，分為對(duì)照組和模型組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入新配制的含PA 50、75、100、125、150、175、200 μmol/L的完全培養(yǎng)基（濃度參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），培養(yǎng)24 h或48 h后，吸棄原有培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，換上無(wú)酚紅的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，以酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)基上清液中的葡萄糖含量并計(jì)算葡萄糖消耗量，選擇最優(yōu)的PA濃度和作用時(shí)間，以復(fù)制PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR模型。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.4 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR模型葡萄糖消耗量影響的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組，模型組，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組（20、40、80 mg/L，濃度參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h，除正常組外，其余各組參照“2.3”項(xiàng)下最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方法，使用PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞復(fù)制IR模型。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，以酶標(biāo)儀檢測(cè)葡萄糖含量并計(jì)算葡萄糖消耗量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.5 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR模型中IRS-1、PKC、JNK蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組，模型組，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組（20、40、80 mg/L，濃度參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）以及二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組（1 mmol/L，濃度參考文獻(xiàn)[8]設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，除正常組外，其余各組參照“2.3”項(xiàng)下最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方法，使用PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞復(fù)制IR模型。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄各組培養(yǎng)液，細(xì)胞用PBS清洗1次，加入RIPA裂解液150～250 μL，于冰上裂解20～30 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。將各組樣本的蛋白與上樣緩沖液按體積比1 ∶ 3混合后，放入沸水中煮5 min使變性。取變性蛋白100 μg，上樣到10%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用TBST緩沖液封閉，在4 ℃下與IRS-1、PKC、JNK、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000）孵育過(guò)夜，用TBST緩沖液洗滌3次，滴加HRP標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 1 000）避光孵育1 h，再次用TBST緩沖液洗滌后，使用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)顯影，通過(guò)Image J v1.8.0軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值來(lái)表示其表達(dá)量。

2.6 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

根據(jù)朱冬春等[11]的研究以及TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcmspw.com），檢索到槲皮素（quercetin）、槲皮苷（quercitrin）、異槲皮苷（isoquercitrin）、金絲桃苷（hyperoside）、蘆丁（rutin）、木犀草素（luteolin）、奧卡寧（okanin）、海生菊苷（maritimetin）共8個(gè)TFB的主要活性成分，利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載上述成分的三維結(jié)構(gòu)，基于OpenBabel 2.4.1軟件，在MMFF94力場(chǎng)下對(duì)成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化。從RCSB Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）下載IRS-1（PDB ID：1K3A）、JNK（PDB ID：3V6R）、PKC（PDB ID：2UZP）蛋白晶體的三維結(jié)構(gòu)，使用AutoDockTools 1.5.6軟件進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，并對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行除去水分子、添加氫原子、添加電荷等處理，以PDBQT格式保存。利用AutoDock Vina 1.1.2分子對(duì)接軟件，根據(jù)蛋白配體的位置，確定蛋白活性位點(diǎn)的坐標(biāo)，其余參數(shù)均采用默認(rèn)值，選取對(duì)接結(jié)合能量最低的構(gòu)象用于分子對(duì)接結(jié)合模式分析，獲取每個(gè)成分的分子對(duì)接能量打分值（其絕對(duì)值越高，表明對(duì)接結(jié)構(gòu)越緊密且穩(wěn)定）[12]，并使用Discovery Studio 2016分子模擬軟件的“可視化功能”對(duì)分子對(duì)接結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化展示。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，5～80 mg/L的TFB對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著影響（P>0.05），但160 mg/L的TFB可顯著降低細(xì)胞的存活率（P<0.05），如圖1所示。因此，以20、40、80 mg/L作為TFB的低、中、高質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)研究。

3.2 PA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，經(jīng)50、75、100 μmol/L的PA作用24 h后，細(xì)胞的存活率均無(wú)明顯變化（P>0.05）;經(jīng)125、150、175、200 μmol/L的PA作用24 h后，細(xì)胞的存活率均顯著降低（P<0.01）。經(jīng)50～200 μmol/L的PA作用48 h后，細(xì)胞的存活率均顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3 PA對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

與對(duì)照組比較，經(jīng)75～200 μmol/L的PA作用24 h后，細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;經(jīng)50～200 μmol/L的PA作用48 h后，細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著降低（P<0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)合“3.2”項(xiàng)下結(jié)果，以75 μmol/L的PA作用24 h誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立IR模型。

3.4 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR模型葡萄糖消耗量的影響

與正常組比較，經(jīng)PA刺激后，模型組細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著下降（P<0.05），提示造模成功;與模型組比較，經(jīng)不同質(zhì)量濃度的TFB處理后，各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量均顯著增加（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明TFB改善了IR。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.5 TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR模型中IRS-1、JNK、PKC蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞中IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)量均顯著降低，PKC蛋白的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組和二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)量均顯著升高，PKC蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見(jiàn)圖4～圖5。

3.6 8個(gè)TFB主要活性成分與IRS-1、JNK、PKC蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

槲皮素、槲皮苷等8個(gè)TFB主要活性成分均作用于IRS-1、JNK、PKC蛋白的活性口袋位置，且對(duì)接良好，其分子對(duì)接能量打分值如表2所示。其中，與IRS-1蛋白分子對(duì)接能量打分值絕對(duì)值最高的成分為海生菊苷（分子對(duì)接能量打分值為-7.9 kcal/mol，1 kcal=4.186 kJ），該成分能夠與IRS-1蛋白的SER979、ASN1110、MET1052、GLU1050氨基酸殘基形成氫鍵，與MET1112、ALA1001、VAL983形成疏水鍵，與TYR8、ARG1109、ASP1056等具有范德華力，其苯環(huán)與MET1112間存在硫-π鍵作用（圖6A）。與JNK蛋白分子對(duì)接能量打分值絕對(duì)值最高的成分為海生菊苷和蘆?。ǚ肿訉?duì)接能量打分值均為-9.3 kcal/mol），海生菊苷能夠與JNK蛋白的ASP207、LYS93氨基酸殘基形成氫鍵，與ILE70、VAL196、LEU206、VAL78形成疏水鍵，與ASN152、ALA151、ASP150等具有范德華力，其苯環(huán)與MET146間存在硫-π鍵作用（圖6B）;蘆丁能夠與JNK蛋白的ASN194、MET149、ASN152氨基酸殘基形成氫鍵，與ILE70、CYS154形成疏水鍵，與LYS93、LEU206、VAL78等具有范德華力（圖6C）。與PKC蛋白分子對(duì)接能量打分值絕對(duì)值最高的成分為槲皮苷（分子對(duì)接能量打分值為-4.9 kcal/mol），該成分能夠與PKC蛋白的ALA291、ASP292、THR155氨基酸殘基形成氫鍵，與HIS154形成疏水鍵，與DSN-1、ALA293、GLU156等具有范德華力（圖6D）。

4 討論

IR是很多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，并與肥胖癥、高血壓、心血管及動(dòng)脈粥樣硬化等代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[3]。肝臟作為胰島素作用的主要靶器官，是IR發(fā)生的主要部位[13]。在相關(guān)研究中，因表面具有高親和力的胰島素受體，HepG2細(xì)胞常被用以誘導(dǎo)建立IR模型[14]。在模型誘導(dǎo)方面，高糖、高胰島素、高脂（軟脂酸）單獨(dú)使用或聯(lián)合使用是常用的誘導(dǎo)方法[14-15]。本研究采用PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞復(fù)制IR模型，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，50、75、100 μmol/L的PA對(duì)細(xì)胞增殖雖有一定的抑制作用，但這種作用在24 h內(nèi)并不明顯;同時(shí)，PA可顯著降低細(xì)胞的葡萄糖消耗量，表明使用PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞可成功復(fù)制IR模型。

JNK是絲裂原激活蛋白激酶家族成員，其編碼基因有3種形式，即JNK1、JNK2和JNK3[16]。JNK蛋白是重要的信號(hào)分子，在IRS和PI3K信號(hào)通路中具有重要的作用，且上述通路及其相關(guān)蛋白在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中有關(guān)鍵作用[17]。研究表明，很多激酶可使IRS的絲氨酸磷酸化，其中就包括JNK和PKC[18]。JNK的作用機(jī)制是通過(guò)提高IRS-1和IRS-2的水平來(lái)抑制JNK活性，從而改善胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和胰島素敏感性，進(jìn)而發(fā)揮IR抑制作用[19]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)量均顯著降低;與模型組比較，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組以及二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中IRS-1、JNK蛋白的表達(dá)量均顯著升高。與正常組比較，模型組細(xì)胞中PKC蛋白的表達(dá)量顯著升高;與模型組比較，TFB低、中、高質(zhì)量濃度組以及二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中PKC蛋白的表達(dá)量均顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，PA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IR模型經(jīng)不同濃度的TFB干預(yù)后，隨TFB濃度的升高，其對(duì)細(xì)胞中IRS-1、JNK、PKC蛋白表達(dá)的調(diào)控作用并無(wú)明顯的量效關(guān)系，筆者推測(cè)這可能與TFB對(duì)模型細(xì)胞作用的敏感性以及細(xì)胞的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

分子對(duì)接是研究小分子配體與靶蛋白大分子之間相互結(jié)合作用及性能的手段之一，在藥物研發(fā)中具有重要的價(jià)值[20]。為了進(jìn)一步探究TFB的主要活性成分與IRS-1、JNK、PKC蛋白之間的相互作用，本研究利用了分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，海生菊苷、蘆丁和槲皮苷與上述蛋白的對(duì)接結(jié)合性能較好。組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是機(jī)體IR發(fā)生的重要機(jī)制之一，可通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來(lái)改善IR[21]。有研究指出，海生菊苷作為黃酮類化合物，具有抗氧化活性和抗炎作用[22-23]。因此，海生菊苷在改善IR方面具有潛在價(jià)值。有研究表明，蘆丁同樣可增強(qiáng)肝臟組織中過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛的含量，降低糖尿病模型小鼠血清中白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1和腫瘤壞死因子α的水平，減輕其抗氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮降血糖和改善IR的作用[24]。槲皮苷具有一定的降血糖作用，據(jù)湯小平等[25]的報(bào)道，槲皮苷可促進(jìn)糖尿病模型大鼠的胰島素分泌，并改善其IR。

綜上所述，TFB對(duì)HepG2細(xì)胞IR有顯著的改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)IRS、JNK、PKC蛋白的表達(dá)有關(guān);海生菊苷、蘆丁和槲皮苷可能是改善IR的潛在活性成分。

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（收稿日期：2021-12-03 修回日期：2022-02-18）

（編輯：曾海蓉）