唐毓瑋　李佳慧　毛立彥　黃秋偉　龍凌云　於艷萍　蘇群

摘? 要：睡蓮屬（）植物是我國(guó)新興的水生花卉，其中重瓣型睡蓮的花態(tài)豐滿艷麗，一直倍受睡蓮愛(ài)好者、育種者的喜愛(ài)和關(guān)注，在水生園林景觀中的應(yīng)用日漸廣泛，但在育種的過(guò)程中，育種者經(jīng)常遇到雜交不結(jié)實(shí)的現(xiàn)象，導(dǎo)致重瓣型睡蓮品種難以培育。為探索重瓣睡蓮難以結(jié)實(shí)的原因，以重瓣睡蓮中較具代表性的品種‘泰國(guó)王’為實(shí)驗(yàn)組，以育性較好的品種‘公牛眼’為對(duì)照組，利用石蠟切片技術(shù)對(duì)其授粉后不同時(shí)期的子房進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)比較，采用掃描電鏡進(jìn)一步觀察樣本的柱頭和胚珠，通過(guò)RNA-seq測(cè)序分析發(fā)育與敗育子房的基因表達(dá)差異。結(jié)果表明：2個(gè)睡蓮品種的柱頭表面均分布著多細(xì)胞單列乳突，細(xì)胞間的連接處形成一圈圈凹槽，乳突數(shù)量龐大、排列緊密，配合自身的結(jié)構(gòu)能更容易捕獲外來(lái)的花粉?！Ｑ邸诜??d后子房中大部分胚珠發(fā)育成紅色種子，10?d后子房膨大成果實(shí)，種皮由紅色轉(zhuǎn)黑色，形成成熟的種子;重瓣睡蓮‘泰國(guó)王’授粉7?d后無(wú)種子形成，子房中有部分胚珠發(fā)育，其表皮變?yōu)榧t色，形態(tài)特征與‘公牛眼’授粉4 d后的紅色胚珠相似，由此推測(cè)少量胚珠可能完成了受精，但無(wú)法進(jìn)一步發(fā)育，10 d后子房完全敗育。顯微結(jié)構(gòu)觀察可知，授粉7?d后2個(gè)品種的胚珠發(fā)育產(chǎn)生明顯差異，‘公牛眼’的胚珠明顯增大，合子開(kāi)始分裂形成胚，而‘泰國(guó)王’胚珠內(nèi)珠心萎縮，胚珠逐步敗育消解，授粉10 d后，‘公牛眼’胚珠的珠被增厚形成種皮，胚開(kāi)始發(fā)育，進(jìn)一步向種子形態(tài)轉(zhuǎn)變。由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可知，差異基因顯著富集在光合作用——天線蛋白、光合作用、卟啉和葉綠素代謝、核糖體、淀粉和蔗糖代謝等通路，這些通路可能是影響睡蓮子房發(fā)育的關(guān)鍵途徑，推測(cè)‘泰國(guó)王’子房敗育可能是因?yàn)樽陨砉夂献饔檬艿揭种?，進(jìn)而影響了蔗糖、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生成。

關(guān)鍵詞：睡蓮;雜交授粉;子房發(fā)育;胚珠;轉(zhuǎn)錄組中圖分類號(hào)：S682.32????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Differences in Ovary Development Between ‘Bull’s Eye’ and ‘King of Siam’ after Pollination

TANG YuweiLI JiahuiMAO LiyanHUANG QiuweiLONG LingyunYU YanpingSU Qun

1. Guangxi Subtropical Crop Research Institute， Nanning， Guangxi 530001， China; 2. Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

（water lily） is an aquatic flower that has been introduced in recent years in our country. In particular， double petal water lily are very popular and full of love and attention by water lily lovers and breeders. And it has been increasingly widely used in the field of aquatic garden landscapes. But in the process of breeding， breeders often encounter the situation of failed hybridization. This makes it hard for breeders to breed double flower. In order to study on the reason that double petal water lily is difficult to set fruit， we selected the more representative cultivar ‘King of Siam’ from double petal water lily as the experimental group， and the better fertile cultivar ‘Bull’s Eye’ as the control group. Firstly， the microstructure of ovaries at different stages after pollination was compared by paraffin section technique. Secondly， the stigmas and ovules were further observed by scanning electron microscope. Finally， the differences of gene expression between developing and abortive ovary were analyzed by RNA-Seq. The results showed that multicellular uniserial papillae were distributed on the stigma surface of the two water lily varieties， and a circle of grooves were formed at the junction between single cells. The number of papillae was large and closely arranged. We think this structure can more easily capture foreign pollen. Meanwhile， after 7 days of . ‘Bull’s Eye’ pollination， most of the ovules developed into red seeds， 10 days later， the ovary expanded into fruit， and the seed coat changed from red to black to form mature seeds. On the other hand， after 7 days of pollination， no seeds were formed in . ‘King of Siam’. However， some ovules in its ovary develop， and its epidermis turns red. The morphological characteristics are similar to the red ovules after 4 days of . ‘Bull’s Eye’ pollination. Therefore， we speculate that a small number of ovules may have completed fertilization， but can not develop further. Than， the ovary was completely aborted after 10 days. Microstructural observation showed that there were significant differences in ovule development between the two varieties after 7 days of pollination. The ovules of . ‘Bull’s Eye’ increased significantly， and the zygotes began to form embryos， while the nucellus in the ovules of . ‘King of Siam’ shrank and the ovules gradually disappeared. After 10 days of pollination， the embryo of . ‘Bull’s Eye’ began to develop and further changed to seed morphology. In additional， the enrichment analysis of differential genes showed that photosynthesis antenna protein， photosynthesis， porphyrin and chlorophyll metabolism， ribosome， starch and sucrose metabolism may be the key pathways affecting the development of waterlily ovary. Consequently， we speculate that the abortion of the ovary of . ‘King of Siam’ may be due to the inhibition of its own photosynthesis， which affects the production of nutrients such as sucrose and starch.

; cross pollination; ovary development; ovule; transcriptome

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.04.019

授粉是種子植物生殖過(guò)程中的重要階段，授粉成功的子房會(huì)進(jìn)一步發(fā)育成果實(shí)，而個(gè)體間不親和的授粉會(huì)影響花粉與雌蕊的識(shí)別、受精以及胚珠的發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致子房敗育無(wú)法結(jié)實(shí)。

睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（）植物的通稱，花色豐富，形態(tài)多樣，在水生園林景觀中應(yīng)用廣泛。國(guó)內(nèi)育種研究始于1999年，育種目標(biāo)以花色特異性為主。截止2019年，我國(guó)已培育成新品種205個(gè)，其中國(guó)內(nèi)鑒定18個(gè)、國(guó)際登陸187個(gè)。重瓣型睡蓮的花態(tài)豐滿艷麗，一直倍受睡蓮愛(ài)好者、育種者的喜愛(ài)和關(guān)注，但在育種的過(guò)程中，育種者經(jīng)常遇到雜交不結(jié)實(shí)的現(xiàn)象，限制了重瓣型熱帶睡蓮的雜交育種研究。

‘泰國(guó)王’是重瓣型熱帶睡蓮中較具有代表性的品種，本課題組前期進(jìn)行了雜交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)‘泰國(guó)王’授粉以后常出現(xiàn)假膨大的現(xiàn)象，子房略微膨大后衰敗，難以結(jié)實(shí)。本研究選擇睡蓮‘泰國(guó)王’品種和育性較好的‘公牛眼’品種為材料，采用組織學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等手段研究其授粉后子房發(fā)育的差異，探討重瓣型睡蓮授粉后子房敗育的成因，以期為睡蓮的雜交育種提供理論基礎(chǔ)。

?材料與方法

?材料

實(shí)驗(yàn)材料為栽培多年的熱帶睡蓮品種‘公牛眼’和‘泰國(guó)王’，種植于廣西壯族自治區(qū)南寧市興寧區(qū)亞熱帶作物研究所睡蓮種質(zhì)資源圃（108°38￠E，22°87￠N），實(shí)驗(yàn)地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，‘泰國(guó)王’的雄蕊完全瓣化，無(wú)法產(chǎn)生花粉，因此不能進(jìn)行自交授粉，僅能作為母本材料進(jìn)行雜交，經(jīng)人工雜交授粉后難以結(jié)實(shí)，而‘公牛眼’自交結(jié)實(shí)率較高。

方法

1.2.1? 人工授粉? 選擇健康的‘泰國(guó)王’和‘公牛眼’品種植株，以‘公牛眼’為父本，‘泰國(guó)王’和‘公牛眼’分別作為母本，采用睡蓮的免去雄人工雜交技術(shù)進(jìn)行授粉。

1.2.2? 授粉后子房發(fā)育的組織學(xué)觀察? 收集授粉后6 h、4 d、7 d和10 d的子房，分別命名為6HAP、4DAP、7DAP和10DAP，用FAA固定液對(duì)樣本進(jìn)行固定，采用二甲苯和乙醇進(jìn)行梯度脫水干燥后用常規(guī)石蠟法包埋。用PAS+萘酚黃S試劑進(jìn)行染色，將切片置于顯微鏡（Zeiss Primostar 3）下觀察拍照記錄。

1.2.3? 柱頭和胚珠的掃描電鏡觀察? 立即采集授粉后的柱頭以及采集授粉后7?d的子房，迅速投入電鏡固定液，轉(zhuǎn)移至4℃保存。將樣本依次于不同梯度酒精脫水后，用臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥，最后將樣本噴金做導(dǎo)電處理，在掃描電鏡下觀察拍照。

1.2.4? RNA的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序? 授粉7 d后分別剪下母本的子房，‘公牛眼’樣本為子房發(fā)育組（ovary development， OD），‘泰國(guó)王’樣本為子房敗育組（ovary abortion， OA），立即放入液氮中速凍，在轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中–80℃保存，用于RNA提取。每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共6份材料。用TRIzol試劑盒法（invitrogen， CA， USA），對(duì)子房的RNA進(jìn)行分離和純化，檢測(cè)RNA的純度與完整性。樣品RNA合格后，委托聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司構(gòu)建cDNA文庫(kù)，使用illumina Novaseq6000 （LC Bio Technology CO.， Ltd. Hangzhou， China）平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.5? 生物信息學(xué)分析? 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后得到的原始數(shù)據(jù)Raw reads，使用cutadapt軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去除接頭處理，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行去除低質(zhì)量序列和重復(fù)序列后得到Valid reads。具體數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟如下：（1）去除帶接頭（adaptor）的reads;（2）去除含有N（N表示無(wú)法確定堿基信息）的比率大于5%的reads;（3）去除低質(zhì)量reads （質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個(gè)read的20%以上）;（4）統(tǒng)計(jì)原始測(cè)序量、有效測(cè)序量、Q、Q、GC含量。使用ballgown包進(jìn)行FPKM定量，F(xiàn)PKM表示在每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù)。使用R包edgeR對(duì)樣本之間進(jìn)行顯著差異分析，將差異倍數(shù)FC>2倍或FC<0.5倍且<0.05的基因定義為差異基因，并對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.2.6? qRT-PCR驗(yàn)證? 依據(jù)富集結(jié)果篩選出差異表達(dá)的基因，從中篩選4個(gè)設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)參照，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析，引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系為10?μL：2×SYBR Green Supermix 5 μL，F(xiàn)orward primer與Reverse primer各0.5?μL，cDNA模板1?μL，ddHO 3?μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用2方法計(jì)算各個(gè)樣品的基因相對(duì)表達(dá)量。

結(jié)果與分析

?‘公牛眼’與‘泰國(guó)王’品種子房發(fā)育的形態(tài)差異

‘公牛眼’具有較好的育性，如圖1所示，授粉4?d后（4DAP）的子房略微膨大，靠近柱頭處的胚珠最先發(fā)育，形成紅色的表皮，這些可能是最先成功受精的胚珠。授粉7?d后（7DAP）子房中的大部分胚珠發(fā)育成為紅色的種子，授粉10?d后（10DAP）子房膨大呈果實(shí)（果實(shí)橫徑約3?cm），種皮由紅色轉(zhuǎn)為黑色，形成成熟的種子?！﹪?guó)王’育性較差，難以結(jié)實(shí)，授粉后4?d（4DAP）的子房略微膨大，7?d后（7DAP）柱頭表面開(kāi)始褐變，子房中有部分胚珠發(fā)育，其表皮變?yōu)榧t色，形態(tài)特征與‘公牛眼’4DAP的紅色胚珠相似?！﹪?guó)王’6HAP和4DAP的子房大小與同期‘公牛眼’的無(wú)明顯差異，直到授粉7?d后子房產(chǎn)生明顯的形態(tài)差異，‘泰國(guó)王’子房中無(wú)種子形成，10DAP的花朵完全腐爛。

?‘公牛眼’與‘泰國(guó)王’品種子房發(fā)育的組織學(xué)觀察

如圖2所示，睡蓮的胚珠在子房壁上的排列無(wú)明顯規(guī)律。授粉6 h的‘公牛眼’胚珠與‘泰國(guó)王’的胚珠發(fā)育無(wú)明顯差異。授粉后4?d，‘公牛眼’的胚珠發(fā)育成為長(zhǎng)卵圓形，其珠心的面積也隨之增加，而‘泰國(guó)王’胚珠的珠心開(kāi)始萎縮。授粉后7?d，2個(gè)品種的胚珠發(fā)生了明顯的差異，‘公牛眼’的胚珠明顯增大，此時(shí)的珠心充滿整個(gè)胚珠內(nèi)部，與珠被緊緊貼合，合子開(kāi)始分裂形成胚，而‘泰國(guó)王’胚珠的珠心繼續(xù)萎縮呈“十”或“丫”字型，胚珠敗育消解。10?d后，‘公牛眼’胚珠的珠被增厚形成種皮，珠心萎縮，胚開(kāi)始

授粉后立即采集的柱頭經(jīng)電鏡掃描發(fā)現(xiàn)（圖3），‘公牛眼’與‘泰國(guó)王’柱頭表面的顯微結(jié)構(gòu)相似，柱頭上均分布著大量的乳突，每個(gè)乳突由一單列的單細(xì)胞組成，基部的細(xì)胞體積較大，頂部的細(xì)胞體積較小，頂部第一個(gè)細(xì)胞的表面略微凹陷。乳突上一列單細(xì)胞之間的連接處形成了一圈圈的凹槽，花粉易附著在凹槽處。乳突數(shù)量龐大、排列緊密，配合自身的結(jié)構(gòu)能更容易捕獲外來(lái)的花粉。

如圖4所示，‘公牛眼’授粉7?d后，子房中正常發(fā)育的胚珠膨大成為種子，呈卵圓形，懸掛于子房壁上，珠被增厚初步發(fā)育成種皮，表面均勻分布著條紋，條紋的方向與胚珠的長(zhǎng)軸平行。胚珠與珠柄連接處，存在一個(gè)冠狀組織蓋著胚珠的頂端。而在‘泰國(guó)王’的子房中，胚珠的發(fā)育程度參差不齊，有的呈卵圓形，有的較為狹長(zhǎng)，也有呈近似圓形的，體積大小不一。

?‘公牛眼’與‘泰國(guó)王’品種子房的轉(zhuǎn)錄組分析

2.3.1? 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及基因表達(dá)量分析? 經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得282?800?654條原始序列（raw reads），去除低質(zhì)量序列和重復(fù)序列后得到有效序列（valid reads）277?620?180條。從表2

可知，有效序列所占比例均大于97%，質(zhì)量值不小于20的堿基所占比例均大于99.98%，質(zhì)量值不小于30的堿基所占比例均大于97%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的48%～49%，說(shuō)明6個(gè)樣品的測(cè)序質(zhì)量很高，可進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)分析。

將兩組樣本的基因表達(dá)量差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于2或FC小于0.5，且<0.05的基因定義為子房敗育組（OA組）與子房發(fā)育組（OD組）的差異基因。從結(jié)果中可以看出，共有6033個(gè)差異基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因3104個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有2929個(gè)（圖5）。

2.3.2? 差異基因GO富集分析? Gene Ontology（簡(jiǎn)稱GO）基因功能分類是國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)的分類體系之一，GO總共有3個(gè)ontology（本體），分別描述基因的分子功能（molecular function）、所處的細(xì)胞位置（cellular component）、參與的生物過(guò)程（biological process）?！﹪?guó)王’和‘公牛眼’被授粉以后，對(duì)子房差異表達(dá)基因（OA vs OD）進(jìn)行GO功能分類，可以分為生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)大類，3416個(gè)小類，圖6分別展示的是生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能中基因數(shù)量前25、15、10的小類。在生物過(guò)程中，差異基因參與數(shù)量排名前五的是生物過(guò)程（biological process）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與DNA模板化（regulation of transcription， DNA-templated）、轉(zhuǎn)錄與DNA模板化（transcription， DNA-templated）、氧化還原過(guò)程（oxidation-reduction process）、蛋白質(zhì)磷酸化（protein phosphorylation），基因數(shù)量分別是656、359、300、248、192個(gè)。在細(xì)胞組分中，差異基因參與數(shù)量排名前五的是細(xì)胞核（nucleus）、葉綠體（chloroplast）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、膜的組成部分（integral component of membrane）、質(zhì)膜（plasma membrane），基因數(shù)量分別為1362、800、769、755、737個(gè)。在分子功能中，差異基因參與數(shù)量排名前五的是分子功能（molecular function）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（DNA-binding transcription factor activity）、ATP結(jié)合（ATP binding）、DNA結(jié)合（DNA binding），基因數(shù)量分別為648、585、334、325、297個(gè)。

如圖7所示，在處理組OA和對(duì)照組OD中，差異基因GO富集顯著性排在前五的分類是葉綠體類囊體膜（chloroplast thylakoid membrane， rich factor = 0.45）、葉綠體（chloroplast， rich factor =0.33）、葉綠體包膜（chloroplast envelope， rich factor=0.40）、光合作用與光系統(tǒng)中的光捕獲（photosynthesis， light harvesting in photosystem I， rich factor=0.78）、葉綠素結(jié)合（chlorophyll binding， rich factor=0.71）。差異基因富集顯著的GO類目均與光合作用息息相關(guān)。

2.3.3? 差異基因KEGG富集分析? KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）全稱是京都基因和基因組百科全書(shū)，是基因組破譯方面的公共數(shù)據(jù)庫(kù)。在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于Pathway的分析有助于更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。如圖8所示，在處理組OA和對(duì)照組OD中，差異基因富集顯著性-value排在前五的KEGG pathway分別為光合作用-天線蛋白（photosynthesis-antenna proteins， rich factor=0.77）、光合作用（photosynthesis， rich factor=0.50）、角質(zhì)，軟木和蠟的生物合成（cutin， suberine and wax biosynthesis，rich factor=0.49）、核糖體（ribosome， rich factor=0.37）、卟啉和葉綠素代謝（porphyrin and chlorophyll metabolism， rich factor=0.48）。在顯著富集的pathway（≤0.05）中，差異基因數(shù)量最多的3條pathway為核糖體（ribosome）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）、苯丙烷類生物合成（phenylpropanoid biosynthesis），差異基因的數(shù)量分別為122、111和94個(gè)。在參與光合作用-天線蛋白、光合作用途徑相關(guān)的差異基因中，OA組絕大多數(shù)基因的表達(dá)量下調(diào)，僅LOC116246649、LOC116263852、LOC116266250、LOC116260662這4個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)（圖9），可見(jiàn)OA樣本的光合作用受到抑制。

相關(guān)基因的表達(dá)分析

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，PRPL1、L4、L21、L35對(duì)擬南芥的胚珠發(fā)育至關(guān)重要，依據(jù)差異基因KEGG富集分析結(jié)果，選擇相關(guān)基因LOC116253844、LOC116260094、LOC116249120、LOC116266588進(jìn)行驗(yàn)證（表3）。在OA組中，相關(guān)基因的表達(dá)量均較低，qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組的基本一致（圖10）。

討論

花粉與柱頭間的識(shí)別作用是確保親和花粉萌發(fā)、完成受精并保持后代遺傳穩(wěn)定性的重要環(huán)節(jié)，睡蓮的柱頭呈盤(pán)狀，成熟后能分泌大量富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的液體，為花粉的水合萌發(fā)提供了必要的基質(zhì)，也在花粉與柱頭的相互識(shí)別過(guò)程中起著重要作用。從花朵盛開(kāi)與閉合的時(shí)間上分類，可將睡蓮分為夜間開(kāi)花和白晝開(kāi)花兩大生態(tài)類型，夜間開(kāi)花的熱帶型睡蓮，如印度紅睡蓮、埃及白睡蓮Nymphaea rubra等柱頭表面分布著濃密的乳突組織，且每個(gè)乳突由一單列的多個(gè)細(xì)胞組成，屬于多細(xì)胞單列乳突的濕柱頭類型。本研究中，對(duì)白天開(kāi)花的熱帶型睡蓮‘公牛眼’和‘泰國(guó)王’品種的柱頭表面進(jìn)行電鏡觀察，得到了較一致的結(jié)果，柱頭表面分布著濃密的多細(xì)胞單列乳突，形似“葫蘆狀”，許多花粉很容易附著于多個(gè)細(xì)胞的連接處。芡實(shí)、萍蓬草等植物的水生植物柱頭上僅僅隆起單個(gè)乳突，柱頭結(jié)構(gòu)可能為原始類型，而睡蓮屬的多細(xì)胞單列乳突的柱頭可能為進(jìn)化類型，本文認(rèn)為后者能更容易附著外來(lái)花粉。

通過(guò)對(duì)‘公牛眼’和‘泰國(guó)王’子房的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，結(jié)實(shí)率低的‘泰國(guó)王’子房中有少量胚珠發(fā)育成熟，其表型與‘公牛眼’紅色胚珠相似，由此推測(cè)少量胚珠可能完成了受精，但‘泰國(guó)王’的子房最終敗育腐爛，受精的胚珠無(wú)法進(jìn)一步發(fā)育為成熟的種子。DENG等在菊花雜交中發(fā)現(xiàn)大約有75%的胚珠能完成受精，但最終只有17.2%的胚珠形成成熟的胚胎，高比例的胚胎敗育是種子產(chǎn)量低的主要原因。胚珠受精后形成胚胎，由于營(yíng)養(yǎng)供給不足等原因，很容易發(fā)生胚胎和內(nèi)外胚乳組織發(fā)育異常、細(xì)胞核降解等情況，導(dǎo)致胚胎敗育。睡蓮子房中的胚珠多達(dá)上千粒，對(duì)于少量成功受精的胚珠，幼胚拯救是目前常用的技術(shù)方法。

本研究中，‘泰國(guó)王’和‘公牛眼’授粉后7?d的子房表型和子房?jī)?nèi)部的胚珠發(fā)育均發(fā)生了較大差異，因此選擇授粉后7?d的子房進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建了發(fā)育組（OD）和敗育組（OA）睡蓮子房cDNA文庫(kù)。

光合作用是植物重要的生理過(guò)程，對(duì)許多作物早期的生殖發(fā)育也起到重要的作用。榛子發(fā)育子房中光合作用相關(guān)的差異表達(dá)蛋白均顯著上調(diào)表達(dá)，表明光合作用對(duì)子房的發(fā)育有所促進(jìn)。光合作用對(duì)番茄果實(shí)內(nèi)種子的發(fā)育也發(fā)揮了重要作用，LYTOVCHENKO等發(fā)現(xiàn)，葉綠素合成受到抑制的轉(zhuǎn)基因番茄無(wú)法形成健康的種子。PATTISON等也證實(shí)在番茄果實(shí)早期發(fā)育時(shí)，大量與光合作用相關(guān)的基因在番茄胎盤(pán)和隔膜中表達(dá)，同時(shí)通過(guò)淀粉染色發(fā)現(xiàn)淀粉顆粒主要集中在胎盤(pán)和隔膜中。GAO等發(fā)現(xiàn)，光合作用相關(guān)基因的啟動(dòng)與擬南芥胚胎發(fā)育早期有關(guān)，貯藏、能量相關(guān)蛋白的激活與胚胎后期發(fā)育相關(guān)。光合產(chǎn)物主要以蔗糖和淀粉的形式存在，蔗糖和淀粉的有效利用對(duì)于配子體發(fā)育、受精以及子代和母體的協(xié)調(diào)發(fā)育至關(guān)重要。在玉米子房中，蔗糖為子房壁和花梗中的淀粉積累提供碳源，并且被花梗中的細(xì)胞轉(zhuǎn)化酶（CWIN）和珠心組織中的液泡轉(zhuǎn)化酶（VIN）水解，產(chǎn)生高濃度的葡萄糖流入胚囊，促進(jìn)胚珠的發(fā)育。本研究中差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在光合作用-天線蛋白、光合作用、卟啉和葉綠素代謝、核糖體、淀粉和蔗糖代謝等通路上顯著富集，表明這些通路可能是影響睡蓮子房發(fā)育的重要途徑，‘泰國(guó)王’子房的敗育可能是因?yàn)樽陨砉夂献饔檬艿揭种?，進(jìn)而影響了蔗糖、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生成。

核糖體蛋白PRPS20、L1、L4、L27和L35是維持核糖體活性所必需的，這在擬南芥胚胎發(fā)育從球形向心形階段的過(guò)渡中變得至關(guān)重要，缺乏這些PRP蛋白會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂模式的改變，擬南芥胚胎發(fā)育到心形階段之前就會(huì)停止。YIN等發(fā)現(xiàn)，葉綠體核糖體蛋白L21基因也是擬南芥胚胎發(fā)生所必需的。本研究選擇了4個(gè)與PRPL1、L4、L21和L35蛋白相關(guān)的基因進(jìn)行驗(yàn)證工作，4個(gè)基因在敗育子房中均顯著下調(diào)，由此可見(jiàn)，這些蛋白對(duì)睡蓮胚的發(fā)育可能也有重要的調(diào)控作用。

本研究采用形態(tài)學(xué)方法確定了子房敗育的關(guān)鍵時(shí)期，進(jìn)一步利用RNA-seq測(cè)序分析初步探討導(dǎo)致睡蓮子房敗育的可能原因，但僅僅從基因表達(dá)層面仍然不能充分闡明睡蓮子房敗育的機(jī)理，后續(xù)研究可采用多組學(xué)聯(lián)合分析，挖掘并驗(yàn)證影響子房發(fā)育的關(guān)鍵基因，以系統(tǒng)闡明睡蓮子房敗育的機(jī)制。

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