冀威文，周健，謝逸菲，張寶喜，楊世穎，呂揚(yáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

藥物共晶是由藥物活性成分(active pharmaceutical ingredient，API)和共晶形成物(cocrystal former，CCF)以氫鍵或其他非共價(jià)鍵結(jié)合形成的固態(tài)晶體[1]。與固體藥物的其他形態(tài)一樣(多晶型、鹽、水合物或溶劑化物)，共晶的形成能有效改善藥物的理化性質(zhì)、生物利用度、穩(wěn)定性和加工性能[1-2]。此外，藥物共晶還能產(chǎn)生藥理協(xié)同或互補(bǔ)作用，這也為共晶藥物的研發(fā)賦予了更大的前景與潛力。

確證共晶形成的關(guān)鍵是證實(shí)API與CCF分子間形成了非共價(jià)相互作用(氫鍵、π-π共軛作用等)，最準(zhǔn)確的技術(shù)手段是單晶X射線衍射法，但該方法前提是必須獲得適合衍射實(shí)驗(yàn)用的單晶體，且對(duì)晶體的尺寸、結(jié)晶度和完整度都有較高要求，因此，對(duì)于不易結(jié)晶的共晶物質(zhì)成為制約其確證表征的難題[3]。紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)和拉曼光譜(Raman)等光譜技術(shù)由于能夠探知官能團(tuán)的分子作用力變化，在藥物共晶研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。兩種光譜技術(shù)原理不同，形成有力互補(bǔ)，同時(shí)兩種光譜技術(shù)還具有對(duì)樣品無(wú)損傷、測(cè)試簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)[4]。目前，紅外光譜和拉曼光譜均屬于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部9015藥品晶型研究及晶型質(zhì)量控制指導(dǎo)原則中收載的用于晶型與共晶研究的檢測(cè)分析技術(shù)方法。傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)是依據(jù)分子內(nèi)部原子間相互振動(dòng)以及分子轉(zhuǎn)動(dòng)等信息來(lái)推測(cè)被測(cè)物分子結(jié)構(gòu)的一類(lèi)分析方法[5]，已被各國(guó)藥典收載用于藥物晶型的檢測(cè)分析。張慧麗等[6]用固體研磨的方法制備由吡拉西坦和3-羥基苯甲酸作為原料藥的藥物共晶體，紅外光譜、拉曼光譜和太赫茲光譜(THz)表征結(jié)果均表明共晶體的振動(dòng)模式與原料藥有顯著區(qū)別；拉曼光譜則由分子極化率變化產(chǎn)生[7]，在紅外光譜中難以反映的振動(dòng)在拉曼光譜中很強(qiáng)，故紅外光譜和拉曼光譜常常聯(lián)合應(yīng)用于晶型樣品的定性分析[8]。王琪琪等[9]研究發(fā)現(xiàn)拉曼光譜技術(shù)可以有效鑒別吡嗪酰胺、2，5-雙羥基苯甲酸及其共晶體，并證明共晶之間存在的相互作用和其內(nèi)部晶格振動(dòng)改變導(dǎo)致一系列圖譜的峰數(shù)量或峰裂分、峰位置以及峰強(qiáng)度或峰形拓?fù)涞确矫娈a(chǎn)生了變化。

柚皮素屬二氫黃酮類(lèi)化合物，因其具有抗炎[10]、抗腫瘤[11]、抗焦慮[12]、降血脂[13]以及抗纖維化[14]等作用，被廣泛關(guān)注并應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域；卡馬西平屬二苯并氮雜類(lèi)抗癲癇藥，臨床上被應(yīng)用于緩解耳鳴或三叉神經(jīng)痛，預(yù)防或治療躁狂癥或抑郁癥[15]。二者若能形成共晶，不僅可能改善溶解性，還有可能產(chǎn)生藥理協(xié)同作用。2019年LEE等[16]獲得了柚皮素與卡馬西平共晶，并采用單晶X射線衍射法、粉末X射線衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)、差示掃描量熱法、熱重分析法對(duì)該共晶進(jìn)行了表征，但未開(kāi)展柚皮素與卡馬西平共晶物的光譜分析研究。

筆者采用紅外光譜和拉曼光譜系統(tǒng)分析了柚皮素與卡馬西平共晶物、柚皮素、卡馬西平三者之間的光譜特征與區(qū)別差異，重點(diǎn)對(duì)柚皮素與卡馬西平共晶物的分子間作用力進(jìn)行研究，從不同角度探究其共晶的形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器 D/max2550粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；Horiba HR evolution高分辨拉曼光譜儀 (法國(guó)HORIBA公司)；Spectrum 400型傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)PerkinElmer公司)。

1.2試藥 柚皮素(陜西惠科植物開(kāi)發(fā)有限公司，含量：98.0%，批號(hào)：20190703)；卡馬西平(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，含量：100.3%，批號(hào)：20190329)；乙酸乙酯(福晨化學(xué)時(shí)間有限公司，AR級(jí)，批號(hào)：20190804)。

1.3共晶樣品制備 按照摩爾比1：1分別稱(chēng)取柚皮素、卡馬西平的原料藥13.6，11.8 mg，置于晶體生長(zhǎng)管中，加入乙酸乙酯200 μL，放入轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器400 r·min-1，攪拌48 h，之后將其放入40 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥12 h，即得柚皮素與卡馬西平共晶，對(duì)所得樣品進(jìn)行PXRD分析，將PXRD實(shí)驗(yàn)圖譜與理論圖譜進(jìn)行比對(duì)，確證共晶物的形成。

1.4共晶樣品表征 PXRD測(cè)試條件為：Cu 靶，電壓40 kV，電流40 mA，測(cè)試角度范圍3°～40°，取樣品適量分別進(jìn)行PXRD分析；紅外光譜分析采用傅里葉變換紅外光譜儀，儀器分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)16次，壓力值80 Pa；拉曼光譜分析采用拉曼光譜儀，使用激光光源波長(zhǎng)為633 nm，光柵600 gr·mm-1，累積時(shí)間3 s，累計(jì)次數(shù)3次。

2 結(jié)果

2.1柚皮素與卡馬西平共晶的確證分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶的粉末圖譜見(jiàn)圖1。對(duì)比可見(jiàn)，共晶與API和CCF粉末衍射圖譜中特征峰發(fā)生明顯改變，峰位以及峰形完全不同。共晶化合物在2θ=5.46°，6.80°，16.52°，18.24°，24.42°出現(xiàn)了新的衍射峰，柚皮素11.52°，15.84°和卡馬西平10.10°，15.39°的特征峰消失。PXRD圖譜結(jié)果提示，柚皮素和卡馬西平之間形成了新的共晶物。共晶物的實(shí)驗(yàn)PXRD圖譜與已獲得單晶的理論P(yáng)XRD圖譜比對(duì)一致，證明獲得的實(shí)驗(yàn)樣品為晶型純度較高的柚皮素與卡馬西平共晶物。

圖1 理論共晶(A)、實(shí)驗(yàn)共晶(B)、卡馬西平(C)和柚皮素(D)的PXRD圖譜 Fig.1 Powder X-ray diffraction patterns of theoretical cocrystal (A)，experimental cocrystal (B)，carbamazepine (C) and naringin (D)

2.2柚皮素與卡馬西平共晶的紅外光譜分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶物的紅外光譜疊合圖見(jiàn)圖2。對(duì)比三者的紅外特征峰可發(fā)現(xiàn)，共晶的各個(gè)吸收峰都產(chǎn)生了不同程度的位移現(xiàn)象，本文主要針對(duì)波數(shù)在3500～3000 cm-1的氫原子的伸縮振動(dòng)和波數(shù)在1700～700 cm-1的羰基的伸縮振動(dòng)和氫原子彎曲振動(dòng)進(jìn)行研究，氫鍵的形成可使分子中的X-H鍵(X=C、N、O)的振動(dòng)頻率改變，由于分子的締合，使電子云密度平均化，從而使氫原子的伸縮振動(dòng)頻率降低且峰變寬，對(duì)于氫原子的彎曲振動(dòng)，則會(huì)產(chǎn)生相反的效果。

圖2 共晶(A)、卡馬西平(B)和柚皮素(C)的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of cocrystal (A)，carbamazepine (B) and naringin (C)

卡馬西平紅外光譜中歸屬為N-H伸縮振動(dòng)峰位于3464 cm-1處，在共晶中該特征吸收峰向低頻方向位移至3420 cm-1處，圖譜中卡馬西平歸屬為N-H彎曲振動(dòng)峰位于1593 cm-1處，在共晶中的特征吸收峰向高頻方向移至1646 cm-1處，且卡馬西平在1677，1604 cm-1的νC=O-R、νC=O伸縮振動(dòng)峰在共晶中的特征吸收峰向1675 cm-1處移動(dòng)。另外，卡馬西平的γN-H吸收峰原本在762 cm-1處，因氫鍵的作用向高頻段806 cm-1處移動(dòng)，說(shuō)明卡馬西平的C=O和-NH2共同參與了共晶的形成。柚皮素紅外光譜中歸屬為O-H伸縮振動(dòng)峰位于3267 cm-1處，由于共晶中氫鍵的作用使其特征吸收峰向低頻方向位移至3199 cm-1，且圖譜中柚皮素歸屬為O-H彎曲振動(dòng)峰位于1246，1153 cm-1處，在共晶中的特征吸收峰向高頻方向移至1421cm-1處，說(shuō)明參與形成氫鍵的基團(tuán)應(yīng)該是-OH?？R西平和柚皮素中都存在羰基的伸縮振動(dòng)峰，但分析發(fā)現(xiàn)只有卡馬西平的νC=O峰由于氫鍵影響從1675 cm-1向低頻1677 cm-1移動(dòng)，共晶中歸屬為NAR的νC=O峰則與其本身的峰位置基本一致，表明柚皮素的C=O鍵中的振動(dòng)峰從1599 cm-1向低頻1600 cm-1移動(dòng)，沒(méi)有明顯參與共晶氫鍵的形成(表1)。綜上所述，由紅外吸收光譜推測(cè)分析可知，柚皮素和卡馬西平之間由于 OH…O、NH…O相互作用，形成共晶。

表1 柚皮素、卡馬西平和柚皮素與卡馬西平共晶的紅外光譜特征 Tab.1 Infrared spectral characteristics of naringin，carbamazepine and their cocrystal cm-1

2.3柚皮素與卡馬西平共晶的拉曼光譜分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶物的拉曼光譜見(jiàn)圖3。對(duì)照可以發(fā)現(xiàn)，柚皮素與卡馬西平共晶分子的拉曼特征峰相較原料藥的拉曼特征峰有了明顯的拉曼位移，原料藥的一些特征峰出現(xiàn)了減弱乃至消失的變化。對(duì)比共晶，值得關(guān)注的是1000～800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的變化，此范圍被定義為芳環(huán)的骨架振動(dòng)、CH變形和環(huán)變形波段[17]，柚皮素原料藥的拉曼特征峰為712.19 cm-1，卡馬西平原料藥的拉曼特征峰為698.22 和723.20 cm-1，成共晶后特征峰發(fā)現(xiàn)該處并沒(méi)有明顯的拉曼信號(hào)，這表明共晶中的苯環(huán)周?chē)赡艽嬖谌绂?π堆積的弱相互作用[18]。拉曼圖譜的1800～1400 cm-1波數(shù)范圍歸屬為羰基和酰胺基團(tuán)吸收，柚皮素原料藥的νC=O振動(dòng)峰在1588.01 和1618.79 cm-1處，卡馬西平原料藥的酰胺譜帶有1564.78 cm-1(δCN)、1600.02 cm-1(δNH)和1622.53 cm-1(νC=O)處，在共晶中的特征吸收峰由于氫鍵的形成向低頻方向移至1561.62，1597.51 和1619.42 cm-1?？傮w來(lái)說(shuō)拉曼光譜在對(duì)比內(nèi)部結(jié)構(gòu)和分子振動(dòng)方面更側(cè)重于非極性基團(tuán)的分析，特別是苯環(huán)振動(dòng)區(qū)有明顯變化，從而更加全面地探索了柚皮素與卡馬西平共晶的形成機(jī)制。

圖3 共晶(A)、卡馬西平(B)、柚皮素(C)的拉曼圖譜 Fig.3 Raman spectra of cocrystal (A)，Carbamazepine (B) and Naringin (C)

根據(jù)柚皮素與卡馬西平共晶的單晶X射線衍射分析結(jié)果[16]，卡馬西平分子的酰胺基團(tuán)扮演著供體和受體角色，它與兩個(gè)柚皮素分子形成兩種不同的氫鍵，柚皮素間苯二酚基團(tuán)與兩個(gè)卡馬西平分子的-NH2形成氫鍵，與本文得出紅外圖譜中共晶對(duì)比柚皮素的-OH特征峰和CBZ的-NH2特征峰產(chǎn)生偏移，拉曼圖譜中共晶對(duì)比原料藥苯環(huán)振動(dòng)區(qū)和酰胺譜帶變化的結(jié)果一致，表明兩種光譜有鑒別分析和闡明氫鍵形成機(jī)制的能力。

3 討論

柚皮素分子結(jié)構(gòu)為黃酮母核，在5位、7位和4′位含有3個(gè)酚羥基，4位羰基常與5位酚羥基形成分子內(nèi)氫鍵，其與7位、4′位酚羥基均是形成超分子化合物的活性基團(tuán)。從柚皮素目前已報(bào)道的共晶物[16，19-22]來(lái)看，柚皮素可通過(guò)7位酚羥基、4位羰基和苯環(huán)上4′位酚羥基與含有酰胺、脲、胺、吡啶或羰基的CCF形成氫鍵，氫鍵是超分子化學(xué)的主要作用力之一?？R西平是兩個(gè)苯環(huán)并氮雜的酰胺類(lèi)化合物，既充當(dāng)氫鍵受體又能充當(dāng)氫鍵供體。不同的官能團(tuán)和化學(xué)鍵的紅外與拉曼頻率具有其特征，這些官能團(tuán)和化學(xué)鍵的特征頻率在共晶形成的過(guò)程中由于分子間的作用力(主要表現(xiàn)為氫鍵的作用)的變化，常常也會(huì)發(fā)生不同程度的偏移[8，23]。紅外光譜與拉曼光譜均屬于振動(dòng)光譜，紅外光譜源于分子偶極距變化，對(duì)分子中的極性基團(tuán)常常具有較強(qiáng)的吸收；而拉曼光譜則由分子極化率變化產(chǎn)生，對(duì)分子中的非極性基團(tuán)具有更好的特征性，兩種光譜相互補(bǔ)充，從不同角度展示了共晶物分子結(jié)構(gòu)的振動(dòng)信息及分子作用力的變化，為探求共晶形成機(jī)制提供了有效的技術(shù)手段。

筆者采用紅外光譜和拉曼光譜相結(jié)合的分析方法，對(duì)懸浮液法制備所得的柚皮素與卡馬西平共晶進(jìn)行表征，并對(duì)不同物相體系中分子的特征峰振動(dòng)模式進(jìn)行歸屬。紅外光譜分析結(jié)果表明，柚皮素與卡馬西平共晶中特征基團(tuán)的紅外吸收峰，如-OH伸縮振動(dòng)峰和-C-N伸縮振動(dòng)峰等，較柚皮素和卡馬西平而言均發(fā)生了較大波數(shù)的峰位偏移，同時(shí)伴隨著峰寬和峰強(qiáng)度的變化；拉曼光譜分析結(jié)果也顯示柚皮素和卡馬西平共晶中，二者分子之間存在氫鍵、π-π堆積等相互作用力，光譜分析的結(jié)果與單晶X射線衍射分析結(jié)果一致，從而佐證了共晶物兩種組分間的分子作用方式以及共晶形成機(jī)制?？梢?jiàn)，對(duì)于難以獲得單晶結(jié)構(gòu)的共晶物，使用紅外光譜與拉曼光譜相結(jié)合的方法可以進(jìn)行共晶分子作用力的分析，并能夠顯示出一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。在藥物共晶研究過(guò)程中，通過(guò)多種不同原理的分析技術(shù)，可以從不同角度進(jìn)行表征分析，為闡明共晶形成機(jī)制與特點(diǎn)提供較全面的、多維度的科學(xué)依據(jù)。