燕柳艷，生立嵩，3，宋俊科，楊德智，張麗，呂揚，王守寶，杜冠華

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050；3.山東省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究所中藥制劑研究室，濟南 250014)

共晶是指2種或2種以上不同分子通過非共價相互作用力而處于同一晶格內(nèi)的固體存在形式，既可以是藥物-藥物的組合，也可以是藥物-化學(xué)小分子的組合，共晶技術(shù)是改善藥物理化性質(zhì)、提高成藥性的有效手段[1]。藥物形成共晶后化學(xué)結(jié)構(gòu)不受影響，但理化性質(zhì)得到改善[2-3]。藥物共晶作為一種改善藥物成藥性的有效手段已引起廣大藥學(xué)研究者的關(guān)注[4-6]。藥物共晶的性質(zhì)與藥學(xué)研究不斷有新穎和深入的發(fā)現(xiàn)，熊果酸-乙醇共晶[7]以及加入十二烷基硫酸鈉灌胃給藥后熊果酸在大鼠體內(nèi)的生物利用度顯著提高。在抗菌藥物共晶中[2]，磺胺噻唑與苯巴比妥酸共晶可大大提高抗菌活性，使前者活性提高2倍以上。ARAUJO等[8]報道了氟苯咪唑的多個共晶，通過共晶改善了氟苯咪唑的溶解度，并因此提高了其體內(nèi)血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)和吸收速率。因此，作為醫(yī)藥研究領(lǐng)域與藥物晶體學(xué)工程研究的新興交叉學(xué)科，藥物共晶研究具有相當(dāng)廣闊的前景。

木犀草素是一種四羥基黃酮類化合物，存在于自然界多種植物當(dāng)中，是一種廣泛存在且具有藥用價值的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有多種藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤[9-15]、抗氧化、抗炎、保護神經(jīng)系統(tǒng)等[10-11]。作為典型的黃酮類化合物，木犀草素有多個酚羥基基團作為氫鍵供體，有較好的形成共晶條件，因此將其與哌嗪進行共晶研究，旨在探討提高木犀草素生物利用度的方法，以提高木犀草素的成藥性。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。 大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼養(yǎng)室溫度(25±2) ℃，相對濕度(60±5)%，光暗周期同晝夜周期。

1.2藥品與試劑 木犀草素由陜西惠科植物開發(fā)有限公司生產(chǎn)(批號：20121016，含量≥96.0%)；哌嗪由北京偶聯(lián)科技有限公司生產(chǎn)(批號：20170226，含量≥95.0%)；木犀草素與哌嗪共晶及同比例混合物均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物晶型研究中心晶型藥物研究北京市重點實驗室自制。

1.3實驗儀器 Rigaku Smartlab 粉末X 射線衍射儀(日本Rigaku 公司)；Mettler Toledo DSC 差示掃描量熱儀(瑞士Mettler Toledo 公司)；Five Easy 型pH 計(瑞士Mettler Toledo 公司)；Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；XS 105 Dual Range 型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；Agilent 1200系列液相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(G1379B在線脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1329A 自動進樣器，G1315DDAD檢測器及系統(tǒng)控制器，G1316A柱溫箱，6110單四級桿質(zhì)譜儀，ESI離子源，Agilent公司，美國)；Allegra TMX-22R全自動高速冷凍離心機(Beckman公司，美國)；Vortex-Genie 2 漩渦混勻器(上海凡勁儀器設(shè)備有限公司)；Organomation N-EVAP 系列氮吹儀(Organomation公司，美國)；固體灌胃器(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所國家藥物篩選中心研制)；Eppendorf 移液器(Eppendorf 公司，德國)等。

1.4粉末X射線衍射(powder X-ray diffraction，PXRD)條件 CuKα 輻射，石墨單色器，管壓40 kV，管流150 mA，2θ 掃描范圍3°～40°，掃描速度8°·min-1，步長0.02°，發(fā)散狹縫DS=1°，接收狹縫為RS=0.15 mm，防散射狹縫為SS=1°。

1.5差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)熱分析條件 樣品量3～10 mg，精密稱定。以空鋁坩堝作為參比，氮氣(N2)氣氛 50 mL·min-1，掃描溫度范圍：30～350 ℃，升溫速率：10 ℃·min-1。

1.6樣品制備方法 共晶制備方法：精密稱取木犀草素286.2 mg，哌嗪172.3 mg(摩爾比1：2)混合均勻，加入乙酸乙酯0.5 mL，輕輕研磨直至溶劑揮干，即得。物理混合物制備方法：按摩爾比1：2精密稱取木犀草素和哌嗪，混合均勻，即得。

1.7色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱Agilent SB-C18，柱溫30 ℃。流動相，梯度洗脫：0～10 min，乙腈：0.1%甲酸=25：75(V/V)；10～14 min，乙腈：0.1%甲酸=80：20(V/V)；14～17 min，乙腈：0.1%甲酸=25：75(V/V)，流速0.3 m L·min-1，進樣量：10 μL，測定時間：17 min。質(zhì)譜信號：ESI源(負(fù)離子檢測模式)，用于定量分析的離子荷質(zhì)比為269.10與285.00(木犀草素)，增益系數(shù)為2.0，干燥氣流為10.0 L·min-1，噴霧室電壓為241.3 kPa，干燥器溫度為 350 ℃。

1.8血漿樣品的采集與處理 取雄性SD大鼠，隨機分組，每組3只，動物自由飲水，禁食12 h后，根據(jù)設(shè)計于上午9：00按相同劑量固體灌胃給予木犀草素哌嗪共晶以及同比例物理混合物。給藥5，15，30，45 min，1，1.5，2，3，6，9，12 h，眼齜內(nèi)靜脈叢取血約0.4 mL，至肝素化抗凝管，4 ℃、5000 r·min-1離心10 min(r=6 cm)。精密吸取肝素抗凝血漿100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入乙酸乙酯1.2 mL萃取，充分震蕩5 min，離心(13 000 r·min-1，r=6 cm，10 min)。取上層溶液100 μL于離心管中，常溫下以N2吹干。加入乙腈100 μL復(fù)溶，震蕩3 min，離心(13 000 r·min-1，r=6 cm，5 min)，取上層溶液50 μL于內(nèi)襯管中，進樣10 μL。

2 結(jié)果

2.1木犀草素與哌嗪共晶的表征

2.1.1PXRD分析 PXRD分析法可用于不同晶型物質(zhì)鑒別，是木犀草素與哌嗪共晶的的有效分析方法，共晶和單一哌嗪、木犀草素的PXRD圖譜在衍射峰數(shù)量、衍射峰位置、衍射峰強度、衍射峰拓?fù)鋱D形等方面均存在明顯差異，表明木犀草素與哌嗪共晶和單一哌嗪與木犀草素既不相同也不等同，證明了共晶形成，圖譜見圖1。

A.哌嗪；B.木犀草素；C.木犀草素與哌嗪共晶。圖1 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的PXRD圖譜 A.piperazine；B.luteolin；C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.1 PXRD patterns of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.1.2DSC分析 DSC法是一種熱分析法。該方法測量的是在程序控制溫度下，測量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度的關(guān)系。由圖2可知，哌嗪、木犀草素及共晶的吸熱峰分別為112.7，335.3，236.8 ℃，木犀草素和哌嗪熔融峰較尖銳，而共晶在相應(yīng)溫度下熔融峰完全消失，說明晶型發(fā)生改變。

A.哌嗪；B.木犀草素；C.木犀草素與哌嗪共晶。圖2 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的DSC圖譜 A.piperazine；B.luteolin；C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.2 DSC curves of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.1.3紅外光譜分析 采用紅外光譜法對木犀草素、哌嗪及共晶進行表征，其紅外吸收光譜如圖3所示。分析結(jié)果表明，在3500，1250 cm-1附近，共晶與單一木犀草素、哌嗪的紅外振動光譜存在明顯差異。

A.哌嗪； B.木犀草素； C.木犀草素與哌嗪共晶。圖3 哌嗪、木犀草素及兩者共晶的ATR-FTIR圖譜 A.piperazine； B.luteolin； C.luteolin and piperazine cocrystal.Fig.3 ATR-FTIR patterns of piperazine，luteolin and their cocrystal

2.2溶解性 為了驗證晶型狀態(tài)與晶型溶解性質(zhì)的關(guān)系，對木犀草素、哌嗪及共晶進行溶解性質(zhì)評價。參照溶解度測定方法[16]測定。采用高效液相色譜法，利用樣品的色譜峰面積數(shù)據(jù)對樣品溶解的濃度進行計算，以時間為橫坐標(biāo)，溶劑濃度為縱坐標(biāo)分別繪制溶解度曲線，溶解性數(shù)據(jù)見圖4。比較后發(fā)現(xiàn)，共晶可改善木犀草素的溶解性，在0.5%十二烷基硫酸鈉溶出介質(zhì)中，共晶的溶出度較物理混合物提高39%，溶出度最大達到83.1%。

A.水；B.0.5%十二烷基硫酸鈉溶液。圖4 木犀草素與哌嗪共晶、物理混合物及單一木犀草素在2種溶出介質(zhì)中的溶出曲線圖 A.water；B.0.5% sodium dodecyl sulfate solution.Fig.4 Dissolution curves of luteolin and piperazine cocrystal，physical mixture and luteolin in two dissolution media

2.3專屬性 按照“1.7”項下色譜條件進行實驗，木犀草素的保留時間為7.0 min，在空白血漿相應(yīng)位置處無吸收峰，說明該方法具有專屬性。結(jié)果見圖5。

A.空白血漿；B.空白血漿+共晶樣品； C.大鼠口服共晶5 min后血漿樣品。圖5 血漿樣品的LC-MS圖 A. blank plasma；B.blank plasma mixed with cocrystal；C.rat plasma which were taken 5 min after oral cocrystal.Fig.5 LC-MS chromatograms of plasma samples

2.4藥動學(xué)結(jié)果

2.4.1血藥濃度-時間曲線 共晶和物理混合物口服后在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線見圖6。共晶各個時間點血藥濃度均高于物理混合物，共晶的血藥濃度-時間曲線在100 min左右出現(xiàn)峰值，物理混合物的血藥濃度-時間曲線在350 min左右出現(xiàn)峰值，說明共晶較物理混合物達峰時間早，且血藥濃度高。說明共晶吸收速度快并且生物利用度高。

圖6 共晶及物理混合物血藥濃度-時間曲線±s，n=3)Fig.6 Mean plasma concentration-time curves of cocrystal and physical ±s，n=3)

2.4.2共晶及物理混合物在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù) 木犀草素與哌嗪共晶以及同比例物理混合物的藥

代參數(shù)如表1所示，共晶的達峰時間(tmax)明顯小于物理混合物，血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)大于物理混合物(P<0.05)，說明共晶可使木犀草素更快達到合適的血藥濃度，提高木犀草素的生物利用度。其他代謝參數(shù)與物理混合物也存在差異，如共晶在體內(nèi)滯留時間短于物理混合物。

表1 大鼠灌胃給藥后非房室模型藥動學(xué)參數(shù) Tab.1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of rats after intragastric administration ±s，n=3

3 討論

藥物共晶是在不改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提下，理化性質(zhì)得到改善的一種強有力的方法。木犀草素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等良好的藥理活性，但是成藥性差，最重要的原因之一就是溶解度等理化性質(zhì)差、生物利用度差，最終影響在體吸收過程，這是影響藥理活性的關(guān)鍵，藥物在體吸收濃度直接影響藥物的有效性和安全性，因此，尋找提高生物利用度的方法尤其重要。近年來，對于溶解性的改善方面的研究很多，主要是將藥物做成包合物[17]，結(jié)構(gòu)修飾做成前藥[18]。本文通過共晶的方式明顯改善了木犀草素的溶解性差的問題。

木犀草素多個羥基基團為其形成共晶創(chuàng)造了良好的條件，本研究采用化學(xué)小分子哌嗪進行共晶結(jié)合，制備后通過不同方法進行表征，發(fā)現(xiàn)PXRD、紅外光譜分析與DSC均能有效鑒別共晶與物理混合物。通過溶解性實驗觀察到在0.5%十二烷基硫酸鈉溶劑系統(tǒng)中，共晶溶解度較物理混合物有重要提高，這對生物利用度的提高有重要意義。

同時，大鼠初步體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，與物理混合物相比，共晶固體口服給藥在大鼠體內(nèi)的峰濃度大于物理混合物，且達峰時間明顯縮短，證明共晶能迅速發(fā)揮治療作用，具有更好的臨床應(yīng)用前景。

藥物共晶研究對于新藥的開發(fā)以及現(xiàn)有藥物的優(yōu)化都十分重要。木犀草素是一種黃酮類化合物，哌嗪是一種化學(xué)小分子，一種生物活性較強的物質(zhì)與一種并無明確藥效作用的物質(zhì)結(jié)合，其藥理作用是否會進一步發(fā)生改變，還有待深入研究發(fā)掘。