林小玲，柯維強(qiáng)，唐文軍，閆其星

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570311

肝癌為常見惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中發(fā)病率排名第5，病死率第2[1]。我國肝癌發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2]。肝癌早期較為隱匿，診斷率較低，大多患者確診時(shí)已為晚期。由于肝癌具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)等特點(diǎn)，往往導(dǎo)致預(yù)后不良，給患者帶來沉重負(fù)擔(dān)[3]?；熥鳛楦伟┲委煹闹匾侄危捎行б种瓢┘?xì)胞增殖?；熕幬锟梢酝ㄟ^干擾細(xì)胞DNA合成與代謝、抑制細(xì)胞分裂等方式，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生毒性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[4]。而癌細(xì)胞多藥耐藥性導(dǎo)致化療藥物在臨床使用上的效用受限。因此，解決細(xì)胞耐藥性在肝癌臨床治療中尤為重要。消瘤膠囊主要由黃芪、白芍、郁金等中藥組成。研究表明，黃芪和白芍均可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞化療敏感性[5-6]。因此，本研究探討消瘤膠囊對肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu的化療敏感性。

1 材料

1.1 細(xì)胞細(xì)胞株Bel/Fu(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：19-0615-012)。

1.2 藥物與試劑消瘤膠囊(江蘇省中醫(yī)藥研究院自制，組方：海藻15 g，斑蝥30 g，黃芪15 g，郁金10 g，黨參15 g，丹參20 g，夏枯草15 g，白芍10 g，白花蛇舌草30 g，三棱13 g，仙鶴草15 g，土鱉蟲10 g，批號：190524)；5-氟尿嘧啶注射液(南通精華制藥股份有限公司，批號：190413)。細(xì)胞完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司，貨號：GI014256)；四唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司，批號：20190623)；二甲基亞砜(美國Sigma公司，貨號：T102146)；40 ng·L-1多聚甲醛(南京高和化工有限公司，貨號：G146138)；磷酸鹽緩沖液(PBS)(上海實(shí)驗(yàn)試劑公司，貨號：PGE3002)；熒光淬滅劑、熒光預(yù)混試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：236159、315698)；TdT反應(yīng)液、dNTP、ddH2O均購自[寶生物(大連)科技有限公司，批號：20190412、20190523、20190511]；原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測試劑盒(美國AAT Bioquest公司，批號：190821A)；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國QIAGEN公司，批號：190416、191024)；引物合成委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司；細(xì)胞裂解液(北京百奧萊博科技有限公司，貨號：C236105224)；谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶-π(glutathione S-transferase-π，GST-π)、p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)、β-actin 一抗及二抗(HRP)(美國Abcam公司，批號：20190221、20190420、20190618、20190316)。

1.3 儀器5417R型離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；HERAcell 240i型細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；CX43型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；YKY-1200型熒光倒置顯微鏡(上海永科光學(xué)儀器有限公司)；Infinite M100 Pro型酶標(biāo)儀(美國TECAN公司)；LineGene 9600 Plus型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(日本Ferrotec公司)；JY-SCZ2型電泳槽(北京六一儀器廠)；E-Gel Power Snap型凝膠電泳儀(美國Thermo公司)；170-3940型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；Innova S41i型搖床(美國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌耐藥Bel/Fu細(xì)胞，將其置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)接種于6孔板中，并隨機(jī)分為4組：空白對照組、5-氟尿嘧啶組(12.5 mg·L-1)、消瘤膠囊組(25 g·L-1)、聯(lián)合用藥組(12.5 mg·L-15-氟尿嘧啶+25 g·L-1消瘤膠囊)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。各組培養(yǎng)基中加入相應(yīng)濃度的藥物，空白對照組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。

2.2 觀察細(xì)胞形態(tài)給藥結(jié)束后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞狀態(tài)。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率將細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)，加入0.5% MTT反應(yīng)液，將細(xì)胞置于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，于搖床孵育 10 min 后，使用酶標(biāo)儀在570 nm處讀出各樣本孔光吸收值(OD)。

細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%

2.4 檢測細(xì)胞凋亡率給藥結(jié)束后，通過TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。收集細(xì)胞，將細(xì)胞涂片后自然晾干，在40 ng·L-1多聚甲醛溶液中浸泡固定 1 h，PBS漂洗后，將樣本浸入3%H2O2中封閉 30 min，PBS漂洗后，將樣本浸入含有1% Triton-X-100的PBS溶液中通透30 min，PBS漂洗后，向樣品上滴加50 μL TdT反應(yīng)液，避光孵育1 h，PBS漂洗后，加入50 μL染色液，避光孵育30 min，PBS漂洗后，使用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，PBS漂洗后，滴加熒光淬滅劑封片并在熒光顯微鏡下觀察。每個(gè)樣本隨機(jī)挑選3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)和視野中總細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞凋亡率(%)=(陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

2.5 RT-PCR法檢測細(xì)胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平給藥結(jié)束后，收集細(xì)胞至離心管中，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI GeneBank中查找GST-π、p-gp 和β-actin mRNA序列設(shè)計(jì)出上下游引物。GST-π上游引物：5′-TAGACTCTTAGATCAGCTAGA-3′，下游引物：5′-GATGACCTATAGCCTAGTAC-3′，產(chǎn)物長度131 bp；p-gp上游引物：5′-TAGCTGCAACTAGCCGATACA-3′，下游引物：5′-CAATCGTAGCTAGGCCTAGA-3′，產(chǎn)物長度 106 bp；β-actin上游引物：5′-CTTAGCTGCATCGATGCTCT-3′，下游引物：5′-GCTAATACGCTAGCTAACGA-3′，產(chǎn)物長度114 bp。反應(yīng)體系：cDNA0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，熒光預(yù)混試劑0.5 μL，dNTP 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL。設(shè)置退火溫度57 ℃，40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，按照2-△△Ct計(jì)算出目的基因的相對表達(dá)量。

2.6 Western Blot法檢測細(xì)胞GST-π、p-gp、gp蛋白表達(dá)給藥結(jié)束后，收集細(xì)胞至離心管中，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃搖床孵育過夜，10 000×g4 ℃離心 10 min，上清即為細(xì)胞總蛋白，加上樣緩沖液，沸水中煮5 min。蛋白上樣，進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，使用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶于搖床上室溫封閉2 h，PBST清洗3次，加一抗4 ℃孵育過夜，PBST清洗3次，加二抗溫孵育2 h，曝光。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 對人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu形態(tài)學(xué)的影響空白對照組細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞多表現(xiàn)為梭形、多角形；5-氟尿嘧啶組細(xì)胞形態(tài)正常，偶見死亡懸浮狀態(tài)圓形細(xì)胞；消瘤膠囊組細(xì)胞生長抑制，部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡懸??；聯(lián)合用藥組細(xì)胞生長抑制嚴(yán)重，培養(yǎng)基中存在大量死亡懸浮細(xì)胞。見圖1。

圖1 光鏡下觀察人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu(×200)

3.2 對細(xì)胞增殖抑制率的影響與空白對照組比較，5-氟尿嘧啶組、消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與5-氟尿嘧啶組比較，消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與消瘤膠囊組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率極顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率

3.3 對細(xì)胞凋亡率的影響與空白對照組比較，5-氟尿嘧啶組、消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與5-氟尿嘧啶組比較，消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與消瘤膠囊組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P<0.01)。見圖2、表2。

圖2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡(×100)

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較

3.4 對細(xì)胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平的影響與空白對照組比較，5-氟尿嘧啶組、消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-πmRNA、p-gpmRNA 水平顯著降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平顯著降低(P<0.05)；與消瘤膠囊組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-πmRNA、p-gpmRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞GST-π mRNA、p-gp mRNA水平比較

3.5 對細(xì)胞GST-π、p-gp、gp蛋白表達(dá)的影響與空白對照組比較，5-氟尿嘧啶組、消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-π蛋白表達(dá)、p-gp/gp水平顯著降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，消瘤膠囊組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-π蛋白表達(dá)、p-gp/gp水平顯著降低(P<0.05)；消瘤膠囊組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞GST-π蛋白表達(dá)、p-gp/gp水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組細(xì)胞GST-π、p-gp蛋白表達(dá)

表4 各組細(xì)胞GST-π、p-gp蛋白表達(dá)比較

4 討論

肝癌是常見高病死率惡性腫瘤，治療常使用手術(shù)切除和化療等方法[7]。5-氟尿嘧啶是臨床常見化療藥物之一，對乳腺癌、食道癌、胃癌等均有療效，也是治療肝癌的最佳藥物之一[8]，可通過抑制DNA合成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于肝癌細(xì)胞易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致5-氟尿嘧啶無法有效清除患者體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞，引起癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良現(xiàn)象，最終導(dǎo)致治療失敗[9]。研究顯示，5-氟尿嘧啶雖然有持續(xù)的抗腫瘤活性，但其活性低，癌細(xì)胞對該藥物的耐藥率高[10-11]。因此，如何提高癌細(xì)胞對化療藥物敏感性，成為目前研究的熱點(diǎn)[12-14]。消瘤膠囊為復(fù)方中藥，主要由黃芪、白芍、郁金、海藻、土鱉蟲等組成。研究表明，消瘤膠囊對肝癌細(xì)胞有抑制作用[15]。但消瘤膠囊是否可提高耐藥細(xì)胞化療敏感性尚未見報(bào)道。因此，本研究使用人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu探討消瘤膠囊提高耐藥細(xì)胞化療敏感性的作用。

肝癌在中醫(yī)上屬于“積聚”“癥瘕”“鼓脹”“暴癥”等范疇[16]。治療肝癌可通過補(bǔ)氣健脾、培補(bǔ)肝腎、祛瘀解毒、扶正固本等配合辨證論治[17]。消瘤膠囊中的黃芪可補(bǔ)氣止汗、消腫利尿；白芍可柔肝止痛、養(yǎng)血斂陰；郁金可活血止痛、行氣解郁；海藻可軟堅(jiān)散結(jié)、利水消腫；土鱉蟲可破血逐瘀；仙鶴草可補(bǔ)虛強(qiáng)壯、止痢解毒；僵蠶可化痰解散、平肝息風(fēng)，諸藥合用可發(fā)揮祛邪扶正功效[18]。本研究結(jié)果顯示，消瘤膠囊可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，此外，消瘤膠囊與5-氟尿嘧啶聯(lián)合用藥效果均優(yōu)于單獨(dú)用藥療效，提示消瘤膠囊可抑制肝癌耐藥細(xì)胞株增殖、促進(jìn)其凋亡，可能與黃芪、白芍、郁金均可提高肝癌細(xì)胞化療敏感性有關(guān)[19-21]。

GST-π屬于細(xì)胞解毒系統(tǒng)中引起腫瘤細(xì)胞耐藥的基因之一，具有轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒作用[22]。GST-π可與親脂性藥物結(jié)合，增加其水溶性，促進(jìn)其代謝，導(dǎo)致藥物被降解或通過尿液排出，引起細(xì)胞耐藥[23]。研究顯示，在肝癌多藥耐藥細(xì)胞株中GST-π高表達(dá)[24]。GST-π可通過還原活性氧、滅活親電子化合物等方式參與DNA損傷修復(fù)，最終抑制細(xì)胞凋亡。GST-π表達(dá)降低可提高癌細(xì)胞化療敏感性，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[25]。p-gp屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是引起癌細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制之一，廣泛存在于具有排泄和分泌功能的細(xì)胞中，減輕有害外源物質(zhì)對細(xì)胞的損害，對細(xì)胞有防御的作用[26]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞可通過 p-gp 將化療藥物排出細(xì)胞外，避免細(xì)胞受到化療藥物的損害，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐藥[27]。癌細(xì)胞耐藥和細(xì)胞凋亡抑制關(guān)系密切，研究表明，p-gp還可通過抑制促凋亡基因Caspase-3，抑制細(xì)胞凋亡[28]。本研究結(jié)果顯示，消瘤膠囊可降低人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu中 GST-π、p-gp蛋白表達(dá)，與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用時(shí)，效果優(yōu)于單獨(dú)使用效果。報(bào)道指出，人結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株HCT-116/L-OHP中GST-π、p-gp 均高表達(dá)，給予不同濃度的姜黃素均可降低其表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]；研究顯示，降低結(jié)直腸癌化療耐藥癌細(xì)胞株 GST-π、p-gp表達(dá)，可增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性[30]，提示通過抑制 GST-π、p-gp表達(dá)可增強(qiáng)人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu對5-氟尿嘧啶的化療敏感性。由此可知，消瘤膠囊可能是通過該途徑發(fā)揮增強(qiáng)人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu的化療敏感性的作用。

綜上所述，消瘤膠囊可提高人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu的化療敏感性，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于化療耐藥作用機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。