仇雯霞，謝小慧，陳欣欣，王宗玉，陳闖△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學，南寧 530200；3.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南寧 530021）

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率目前仍位居高位[1]。臨床研究表明，中醫(yī)藥對肝癌防治有獨特的優(yōu)勢[2-4]，但大多數(shù)方藥作用機制不明確，阻礙了中醫(yī)藥的推廣應(yīng)用。蛭巖消積方是廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院的院內(nèi)制劑（備案號：桂藥制備字M20220001000），組方包括巖黃連、水蛭、白花蛇舌草、黨參、柴胡、莪術(shù)、絞股藍、薏苡仁。研究表明，蛭巖消積方能減輕肝癌患者的臨床癥狀，提高患者的生活質(zhì)量，但蛭巖消積方的抗肝癌機制尚未明確。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預測蛭巖消積方治療肝癌的作用靶點及通路，并進行體外實驗對相關(guān)的分子機制進行初步驗證，為蛭巖消積方的抗肝癌機制研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞 人肝癌細胞HepG2由廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（含青—鏈霉素100 U/mL），置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2主要試劑FBS、DMEM、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青—鏈霉素混合液、姬姆薩、4%多聚甲醛、二甲基亞砜（DMSO）、PBS購自北京索萊寶公司；Matrigel基底膜基質(zhì)購自美國Corning公司；CCK8檢測試劑盒購自日本東仁公司；細胞周期試劑盒購自杭州聯(lián)科生物；兔抗PI3K、AKT、mTOR、磷酸化（p-）PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A購自博奧森；二抗購自碧云天。

1.3蛭巖消積方水提物的制備 蛭巖消積方從廣西醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院藥房采購。蛭巖消積方加15倍水，煎煮1 h后，用400目濾布過濾，濃縮成膏，凍干機干燥成粉，臨用時用培養(yǎng)基溶解，0.22μm微孔濾器過濾除菌。

1.4 CCK8法檢測細胞增殖 常規(guī)培養(yǎng)細胞，收集對數(shù)生長期細胞，按5×103個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板；待細胞貼壁后，加入不同濃度（3 200μg/mL、1 600μg/mL、800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL和25μg/mL）蛭巖消積方水提物，對照組加入等量培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h；加入CCK8溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。計算半數(shù)抑制濃度（IC50），選取IC50附近低、中、高濃度繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。計算細胞增殖抑制率，即（1-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。

1.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 收集細胞，分別加入低、中、高濃度蛭巖消積方水提物，培養(yǎng)48 h；調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，取200 μL無血清DMEM細胞懸液接種于小室，24孔板下室中加入600μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，姬姆薩染液室溫染色30 min，清洗風干，光鏡下觀察記錄膜背面遷移的細胞數(shù)。侵襲實驗將Transwell小室膜底部用Matrigel稀釋膠包被、水化，處理方法同遷移實驗。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞周期 收集低、中、高濃度蛭巖消積方處理后的細胞，用0.25%胰酶消化，4℃下離心5 min，棄上清液；加入1 mL DNA Staining solution和10μL Permeabilization solution，渦旋振蕩10 s混勻；室溫避光孵育30 min，選擇最低上樣速度，用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blotting法檢測細胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入一抗PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、CDK2、CyclinA、p-CHK1、Cdc25A（均1∶1 000）4℃孵育過夜，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光顯色液曝光、顯影。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8蛭巖消積方肝癌治療靶點的獲取 本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）、Batman-TCM數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php）以及文獻檢索[5]收集蛭巖消積方組成藥物的活性成分及作用靶點。在TCMSP中以口服生物利用度（OB）≥20%、類藥性（DL）≥0.18為篩選標準，在Batman-TCM中以Score cut off≥20，校正P值＜0.05為篩選標準，得到有效的活性成分及靶點。將獲得的靶點蛋白名導入到Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，獲取標準基因名，即為蛭巖消積方的所有靶點。以“hepatocellular carcinoma”及“Liver cancer”為關(guān)鍵詞，從GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、OncoDB.HCC（http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm）中查詢肝癌相關(guān)基因，將所有得到的基因合并后去除重復，即為肝癌相關(guān)的疾病基因。將獲得的疾病靶點與獲得的蛭巖消積方靶點取交集即可得到蛭巖消積方治療肝癌的潛在作用靶點。

1.9蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點和蛋白—蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蛭巖消積方治療肝癌的潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。選擇物種為“homo sapiens”，將交互得分最高置信度設(shè)置為≥0.9，隱藏游離靶點，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，得到靶蛋白之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將相互作用信息導入Cytoscape3.8.2軟件中。利用CytoNCA功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，計算各節(jié)點的度中心度（DC）、中間性中心性（BC）、緊密性中心性（CC）、特征向量中心性（EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（NC）和局部平均連通性（LAC）。利用R語言進行篩選，同時滿足大于各因素中位值的條件，得出核心網(wǎng)絡(luò)。

1.10蛭巖消積方治療肝癌靶點的GO功能分析和KEGG通路富集分析 基于Metascape（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）及R語言（version 3.6.3）中的ggplot2、clusterProfiler、AnnotationHub、org.Hs.eg.db、DOSE、ggpurb程序包對蛭巖消積方治療肝癌的靶點進行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析，并對富集分析的結(jié)果進行可視化。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1蛭巖消積方治療肝癌的靶點 依據(jù)篩選條件，去除無靶點對應(yīng)和重復項后得到93種有效活性成分，其中白花蛇舌草有8個化合物，柴胡有16個化合物，黨參有22個化合物，莪術(shù)有2個化合物，絞股藍有19個化合物，水蛭有15個化合物，薏苡仁有7個化合物，巖黃連有12個化合物，重復化合物8種。查詢上述93種有效活性成分對應(yīng)的靶蛋白，將得到的靶蛋白輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類，共得到399個經(jīng)人工注釋的人類基因，通過數(shù)據(jù)庫檢索肝癌的相關(guān)作用靶點有17 034個（圖1），兩者取交集得到蛭巖消積方作用于肝癌的靶點381個（圖2）。

圖1 4個數(shù)據(jù)庫的基因并集

圖2 藥物與疾病靶點的交集基因

2.2關(guān)鍵靶點的獲得及PPI網(wǎng)絡(luò)圖 首次篩選的閾值為DC≥21、EC≥0.017 619、LAC≥9、BC≥178.963 4、CC≥0.231 436、NC≥10.177 12，得到106個節(jié)點，7 454條邊的網(wǎng)絡(luò)圖；第2次篩選閾值為DC≥75、EC≥0.091 881、LAC≥36.357 14、BC≥810.798 2、CC≥0.252 513、NC≥48.678 17，得到30個節(jié)點，3 282條邊的網(wǎng)絡(luò)圖。經(jīng)過2次篩選后得到核心網(wǎng)絡(luò)（圖3），表1所示的作用靶點均為PPI網(wǎng)絡(luò)中度值較高且受到蛭巖消積方中藥物活性成分調(diào)控的靶點蛋白，為蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶基因。

表1 蛭巖消積方治療肝癌的關(guān)鍵靶點

圖3 關(guān)鍵靶點的篩選過程

2.3蛭巖消積方治療肝癌靶點的GO及KEGG分析GO富集包括3個模塊，分別為生物學過程（BP）、細胞組成（CC）和分子功能（MF）。主要涉及癌癥通路、細胞對有機環(huán)化合物的反應(yīng)、細胞對氧水平的反應(yīng)、前列腺癌、離子遷移的調(diào)節(jié)、IL-4和IL-13通路、對無機物的反應(yīng)、光動力療法誘導NF-κB生存信號、炎癥反應(yīng)、體液水平的調(diào)節(jié)等（圖4）。KEGG通路富集分析中，取校正過的P值最小的前30條通路。蛭巖消積方治療肝癌的靶蛋白主要富集在PI3K/AKT、乙肝、丙肝、前列腺癌、AGE-RAGE、IL-17、TNF等信號通路（圖5）。

圖4 蛭巖消積方治療肝癌靶點的GO富集分析

圖5 蛭巖消積方治療肝癌靶點的GO富集分析

2.4蛭巖消積方水提物抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲 蛭巖消積方水提物作用于HepG2細胞48 h的IC50為1 499μg/mL，故選擇800μg/mL、1 600μg/mL、2 400μg/mL作為蛭巖消積方水提物低、中、高劑量處理HepG2細胞72 h。

隨著蛭巖消積方水提物濃度的增加和作用時間的延長，HepG2細胞增殖活性逐漸降低；隨著蛭巖消積方水提物濃度的增加，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)逐漸減少，見圖6、表2。

表2 各組遷移和侵襲細胞數(shù)比較 ，n=3

表2 各組遷移和侵襲細胞數(shù)比較 ，n=3

與對照組比較，*P＜0.05。

圖6 蛭巖消積方水提物對HepG2細胞增殖、侵襲和遷移的影響

2.5蛭巖消積方水提物對細胞周期的影響 與對照組比較，蛭巖消積方水提物中、高劑量組G1期細胞所占比例減少，S期細胞所占比例增加，見圖7。

圖7 蛭巖消積方水提物對細胞周期的影響

2.6各組細胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達比較 與對照組比較，蛭巖消積方水提物中、高劑量組CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表達量及p-AKT/AKT比值、p-PI3K/PI3K比值降低，p-CHK1蛋白表達量升高；各組p-mTOR/mTOR比值比較，差異無統(tǒng)計學意義，見圖8、表3。

圖8 Western blotting蛋白電泳圖

表3 各組細胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達比較 ，n=3

表3 各組細胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達比較 ，n=3

與對照組比較，*P＜0.05。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蛭巖消積方水提物以濃度依賴的方式抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學KEGG富集結(jié)果可知，PI3K/AKT通路是蛭巖消積方作用于肝癌的相關(guān)重要通路之一，且組方藥物有效成分的靶點均參與PI3K/AKT通路。PI3K與AKT組成的信號通路與多種生物信號調(diào)節(jié)有關(guān)，其作用包括抑制細胞凋亡，促進細胞增殖，促進血管生成，同時還與肝癌細胞的遷移和侵襲密不可分，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-9]。mTOR是PI3K/AKT信號通路的主要下游靶點，是一個關(guān)鍵的細胞代謝調(diào)節(jié)因子。本研究中，蛭巖消積方中、高劑量組PI3K、AKT的磷酸化水平顯著下降，但mTOR磷酸化水平無明顯變化，推測蛭巖消積方水提物可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路抑制HepG2細胞增殖。中藥復方具有多靶點、多途徑的作用特點，且磷酸化和降解之間的相互關(guān)系是復雜的，因此仍需進一步的研究。

細胞增殖失控是癌細胞的一個基本特征，而這種失控是由細胞周期調(diào)控紊亂引起的[10]。CDK2是CDK家族中的重要成員，為PI3K/AKT通路的下游蛋白，可與CyclinE和CyclinA相互結(jié)合，啟動DNA合成，促進細胞分裂，加快細胞周期[11]。Cdc25A與CDK2相互促進，在多種腫瘤中呈高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的惡性程度和預后有關(guān)[12-13]。研究表明，調(diào)控Cdc25A降解可阻滯細胞周期，活化的CHK1通過磷酸化Cdc25A的第82位絲氨酸，促進Cdc25A的泛素化降解，最終導致G1/S期阻滯[14-15]。本研究中，蛭巖消積方水提物下調(diào)CDK2、Cdc25A、CyclinA蛋白表達，同時上調(diào)p-CHK1蛋白表達；細胞周期實驗顯示，該藥可將肝癌細胞阻滯在S期，從而抑制細胞增殖。

綜上所述，蛭巖消積方水提物可能通過阻斷PI3K/AKT信號通路抑制HepG2細胞增殖、侵襲和遷移。本組今后將開展蛭巖消積方作用于肝癌小鼠的體內(nèi)研究，以期為蛭巖消積方在肝癌臨床治療中的應(yīng)用提供更多的實驗依據(jù)。