趙志廉，陸玲玲，郭曼，菅鳳國，付振鵬，劉明海

(1.山東省昌邑市婦幼保健院 病理科，山東 昌邑 261300；2.山東省昌邑市婦幼保健院 婦產(chǎn)科，山東 昌邑 261300;3.山東省昌邑市婦幼保健院 超聲科，山東 昌邑 261300;4.山東省昌邑市婦幼保健院 外科，山東 昌邑 261300;5.山東省濰坊市中醫(yī)院 病理科，山東 昌邑 261300)

隨著科學(xué)的發(fā)展，我們在癌癥研究領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)展，但是乳腺癌仍然是一個重要的影響女性健康的問題，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究需要攻克的難題。在全球，乳腺癌是影響女性身心健康的最常見的癌癥，其發(fā)病率和死亡率預(yù)計在未來幾年將顯著增加。目前的研究顯示，在45 歲以下的年輕女性中，乳腺癌是癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因。乳腺癌在年輕女性患者人群中尤其具有復(fù)雜的生物學(xué)特征。對于絕經(jīng)期前的育齡期女性，乳腺癌會帶來更高的風(fēng)險，因?yàn)樗ǔ８咔忠u性和復(fù)發(fā)行為，預(yù)后會更差。與年長者乳腺癌病人相比，育齡期女性患者的TNM 分期更晚，腫瘤更具侵襲性，并且具有比較特殊的分子表型。然而現(xiàn)有的診斷和治療方法未將育齡期女性這一特殊人群單獨(dú)劃分。我們更要加強(qiáng)宣傳教育，加大育齡期女性對乳腺癌的重視，做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，提高育齡期女性乳腺癌患者的生存質(zhì)量。近幾年更多的研究針對育齡期女性的乳腺癌的分子標(biāo)記物和發(fā)病機(jī)制。

腫瘤壞死因子-α- 誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一組蛋白,又稱TIPE。 該家族有TNFAIP8，TIPE1(TNFAIP8L1)，TIPE2(TNFAIP8L2)和 TIPE3(TNFAIP8L3)。TIPE2 定位于人1 號染色體(1q21.2-1q21.3)。人TIPE2 可以表達(dá)于多種非免疫細(xì)胞中，提示TIPE2 不僅參與免疫調(diào)節(jié),維持機(jī)體的免疫平衡，TIPE2 在一些腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中還可能作為抑癌基因。最近研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、食管癌等腫瘤組織中的表達(dá)明顯降低。并且與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為呈負(fù)相關(guān),提示TIPE2 抑制了這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種分子量約為45kda 的同二聚糖蛋白。VEGF 在血管的生成過程中作用重大，與血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的兩種VEGF 受體(VEGF受體1 和VEGF 受體2)結(jié)合。在正常人體發(fā)育中，VEGF 在胚胎發(fā)育過程中參與了血管的生成，并參與成人傷口愈合的過程。文獻(xiàn)報道VEGF 是腫瘤血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)，它在腫瘤中的表達(dá)受癌基因、多種生長因子及缺氧等因素的上調(diào)。研究顯示VEGF 在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌等腫瘤組織中表達(dá)顯著升高，并且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VEGF 在癌癥中的發(fā)生發(fā)展不只是參與腫瘤新生血管的形成，還有其特定的生物學(xué)作用。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)的方法評估TIPE2，VEGF在育齡期女性乳腺癌組織中的表達(dá)異常情況，研究其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級等臨床病理因素的關(guān)系，并探討TIPE2 與VEGF 的相關(guān)性。為臨床研究育齡期女性乳腺癌的發(fā)展提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

選取昌邑市婦幼保健院病理科2012年1月至2017年12月術(shù)前未行任何治療的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本110 例作為實(shí)驗(yàn)組，均為育齡期女性(15～49)，年齡21～49 歲，平均年齡37 歲。術(shù)后病理診斷均為浸潤性導(dǎo)管癌，臨床病理資料完整，同時隨機(jī)選取40 例實(shí)驗(yàn)組的距離癌旁1 cm 的正常乳腺組織作為實(shí)驗(yàn)對照組。

1.2 方法

免疫組織化學(xué) 所有標(biāo)本用中性福爾馬林固定。TIPE2、VEGF、Platelet endothelial cell adhesion molecule-1(PECAM-1/CD31)兔抗人多克隆抗體(工作濃度1:50)，均買自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。即用型ER、PR、HER-2、Ki-67 抗體為福建邁新生物技術(shù)有限公司。所有乳腺癌蠟塊標(biāo)本經(jīng)兩位病理醫(yī)師確診。常規(guī)石蠟4 um 切片，免疫組織化學(xué)采用SP 法，實(shí)驗(yàn)組及對照組用相同的實(shí)驗(yàn)條件和方法，用PBS 液替代一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué) 根據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會ASCO 分級分別 對TIPE2、VEGF、CD31、ER、PR、HER-2、Ki-67進(jìn)行結(jié)果的判讀。TIPE2、VEGF、 CD31 陽性：在細(xì)胞漿見棕黃色顆粒，HER-2 陽性：在細(xì)胞膜見棕黃色顆粒,ER、PR、HER-2、Ki-67 陽性：在細(xì)胞核見棕黃色顆粒。染色陽性的腫瘤細(xì)胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計為0、1、2、3、4 分。腫瘤細(xì)胞著色強(qiáng)度分別標(biāo)記-、+、++、+++，分別計為0、1、2、3 分。將這兩個數(shù)值相乘，＜8 分判定為低表達(dá)，≥8 分判定為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理，所占的百分比用n(%)表示，實(shí)驗(yàn)組、對照組的差異采用檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)，并采用Logrank 生存曲線分析和Spearman 相關(guān)性分析，＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TlPE2、VEGF 在乳腺癌組織中的表達(dá)

TIPE2 在乳腺癌組織中表達(dá)降低，在正常乳腺組織中強(qiáng)表達(dá)。VEGF 在乳腺癌組織中表達(dá)升高，在正常乳腺組織中表達(dá)較低(圖1)。

圖1 正常乳腺組織及乳腺癌免疫組化表達(dá)(HE×400)(①正常乳腺組織TlPE2 高表達(dá) ②高級別乳腺癌TlPE2 低表達(dá) ③正常乳腺組織VEGF 低表達(dá)④高級別乳腺癌VEGF高表達(dá) ⑤乳腺癌Ki-67 高表達(dá))

2.2 TlPE2、VEGF 與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

TIPE2 在乳腺癌中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.005)。TIPE2 低表達(dá)與腫瘤TNM 分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.031)、組織學(xué)分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.010)、Ki67 指數(shù)高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.010)臨床病理參數(shù)相關(guān)，但與ER、PR、HER2 的表達(dá)、腫瘤大小、年齡無關(guān)，見表1。

VEGF 在乳腺癌中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.005)。VEGF 高表達(dá)與腫瘤TNM 分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.012)、組織學(xué)分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.030)、Ki-67 指數(shù)高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.003)相關(guān)，但與ER、PR、HER-2 的表達(dá)、腫瘤大小、年齡無關(guān)，見表1。

表1 乳腺癌組織中TlPE2、VEGF的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 TlPE2、VEGF 之間的相關(guān)性分析及與血管形成的關(guān)系

TIPE2 的表達(dá)與VEGF 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(r ＝-0.271，＝0.002)，而且TIPE2 低表達(dá)的患者提示預(yù)后不良，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(=0.028)(圖2)，同時發(fā)現(xiàn)TIPE2 低表達(dá)且VEGF 高表達(dá)的乳腺癌組織中血管形成較密集(用CD31 顯示血管內(nèi)皮)(圖3，表2)。

圖2 TlPE2 與VEGF 相關(guān)性及預(yù)后 ①TlPE2 與VEGF 表達(dá)的相關(guān)性(P ＝0.002)②乳腺癌TlPE2 低表達(dá)且VEGF 高表達(dá)患者生存曲線。

圖3 血管形成密度的對比(CD31 標(biāo)記血管內(nèi)皮)①血管形成疏松區(qū)②血管形成密集區(qū)

表2 乳腺癌組織中TlPE2低表達(dá)且VEGF高表達(dá)與血管形成的關(guān)系

3 討論

育齡期女性因?yàn)槠浼に厮郊皺C(jī)體代謝因素，在癌癥人群中屬于特殊的群體。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的日益更新，對于癌癥的過早診斷和治療顯著提高了乳腺癌患者的預(yù)后，但是乳腺癌仍然是育齡期女性癌癥導(dǎo)致死亡的首要因素。

TIPE2 是2002年發(fā)現(xiàn)的一種基因，TIPE2 參與免疫反應(yīng)，負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答。該基因編碼的蛋白由6 個反向平行α 螺旋組成，受到抗原刺激時可以激活免疫反應(yīng)，通過抑制T 細(xì)胞受體(TCR)和Toll 樣受體(TLR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對炎癥和免疫內(nèi)環(huán)境的負(fù)性調(diào)節(jié)，維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)。近幾年文獻(xiàn)指出TIPE2 也與惡性腫瘤密切相關(guān)。TIPE2 通過抑制AKT 和 IκBα 磷酸化的過程負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。此外，TIPE2 抑制非小細(xì)胞肺癌發(fā)展，并通過抑制PI3K/Akt 通路參與抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在乳腺癌的相關(guān)報道中發(fā)現(xiàn)TIPE2 通過抑制AKT 和P38 通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法研究乳腺癌組織中TIPE2的表達(dá)變化情況，數(shù)據(jù)顯示TIPE2 在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯降低，并且TIPE2 的低表達(dá)與乳腺癌的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)和TNM 分期等惡性生物學(xué)行為相關(guān)，這與前述文獻(xiàn)報道結(jié)果相吻合。并且我們的數(shù)據(jù)顯示TIPE2 低表達(dá)的育齡期女性患者預(yù)后明顯不良。我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TIPE2 可作為評估乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。

VEGF 是一種重要的生長因子，它促進(jìn)血管的生成，并且對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)有絲分裂和抗凋亡的作用，可增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移等，它積極參與調(diào)節(jié)正常和病理的血管生成過程。在惡性腫瘤的生長過程中新生血管的形成對腫瘤細(xì)胞的生長微環(huán)境至關(guān)重要。在許多惡性腫瘤中存在VEGF 表達(dá)增多的現(xiàn)象，VEGF 參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。對于VEGF 在腫瘤中的作用機(jī)制，近幾年也有一些深入的研究。文獻(xiàn)指出，VEGF在腫瘤生長過程中不只是參與促進(jìn)新生血管的形成，還有特定的生物學(xué)意義。

Li 等在非小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TIPE2 通過抑制Rac 通路降低VEGF 的作用從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。并且有文獻(xiàn)報道TIPE2 有抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的能力。我們在實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)TIPE2 在乳腺癌組織中的顯著比周圍正常乳腺組織呈現(xiàn)低表達(dá)，并且TIPE2 的低表達(dá)與乳腺癌的組織分級、TNM 分期、Ki-67 指數(shù)高等乳腺癌的惡性行為相關(guān)，TIPE2 低表達(dá)的育齡期女性乳腺癌患者的預(yù)后不良。同時，數(shù)據(jù)顯示VEGF 在乳腺癌中呈高表達(dá)，TIPE2 與VEGF 的表達(dá)負(fù)相關(guān)，同時存在VEGF 高表達(dá)并TIPE2 低表達(dá)的乳腺癌組織中，血管形成的密度明顯高于其他的病例組。因此認(rèn)為，TIPE2 在乳腺癌中與VEGF 起協(xié)同作用。我們可以推斷TIPE2 通過VEGF 參與的腫瘤血管形成過程作用于乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，這為以后乳腺癌的機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)支持。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，深入分子化學(xué)研究探討乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制成為臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中課題研究的重點(diǎn)。乳腺癌現(xiàn)有的診療技術(shù)中對于乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是目前治療的難點(diǎn)。隨著越來越精細(xì)的精準(zhǔn)個體化治療，我們期待于尋找新的用于乳腺癌臨床治療的基因靶點(diǎn)。通過以上分析發(fā)現(xiàn)，TIPE2 可能作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。

綜上所述，我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在育齡期女性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的發(fā)生發(fā)展中，TIPE2 的低表達(dá)與多種臨床病理參數(shù)相關(guān)，并且可以作為評估育齡期女性乳腺癌患者臨床預(yù)后的指標(biāo)。TIPE2 和VEGF 的表達(dá)可以一定程度反映乳腺癌的病情發(fā)展。TIPE2 可能成為一個重要的靶分子，通過經(jīng)VEGF 參與的血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長參與乳腺癌的發(fā)展。但由于我們的研究條件有限。接下來的研究方向是通過更復(fù)雜的體外實(shí)驗(yàn)明確TIPE2 在乳腺癌的作用機(jī)制，構(gòu)建TIPE2 參與影響腫瘤血管形成的完整通路，有利于進(jìn)一步指導(dǎo)育齡期女性乳腺癌的臨床評估和治療。