袁小筍，張蕾，馬慧利，薛永飛，李長(zhǎng)生，張敬偉，任中海，張騰飛

乳腺癌作為女性高發(fā)惡性腫瘤，盡管病人早期發(fā)現(xiàn)率不斷提高，且診療手段的不斷進(jìn)步，但病人遠(yuǎn)期預(yù)后仍然改善有限［1］，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是導(dǎo)致病人死亡的主要因素［2］。因此，深入探討與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的機(jī)制或敏感基因?qū)χ笇?dǎo)病人臨床診療及改善預(yù)后意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一種長(zhǎng)度在200 nt以上且缺乏編譯蛋白功能的RNA，以往被認(rèn)為是一種“垃圾基因”，隨著研究深入，其在表觀遺傳修飾及基因轉(zhuǎn)錄和翻譯中的調(diào)控作用越來越受到重視［3］，已被發(fā)現(xiàn)參與了多種疾病發(fā)生過程［4］，同時(shí)與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［5］，肝癌高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）是最早在肝癌中發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA［6］，近年來發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌［7］、淋巴瘤［8］等多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，但其在乳腺癌組織表達(dá)如何鮮有報(bào)道。本研究分析乳腺癌組織中HULC 表達(dá)，探討其在不同臨床病理指標(biāo)間表達(dá)差異性，以及與預(yù)后的相關(guān)性，以期為乳腺癌機(jī)制研究及臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2013 年5 月至2015 年5 月在南陽市中心醫(yī)院乳腺科行手術(shù)治療且資料完整的乳腺癌病人112例，入選病人均為女性，術(shù)前未接受放化療，術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)。年齡（56.58±11.52）歲，范圍為26～75 歲。病理學(xué)類型：浸潤性導(dǎo)管癌88 例，其他類型24 例；腫瘤直徑：＞2 cm 62 例，≤2 cm 50 例；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)31 例，Ⅱ級(jí)46 例，Ⅲ級(jí)35例；按照第七版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期24 例，Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期36 例；發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41 例，根

據(jù)雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）和Ki-67 檢查結(jié)果進(jìn)行分子分型：Luminal A 型33 例，Luminal B 型29 例，HER-2過表達(dá)型21 例，三陰性（TNBC）型29 例。所有病人于手術(shù)中留取乳腺癌及距離腫瘤邊緣＞5 cm 正常乳腺組織，快速置于液氮中，-80 ℃保存。病人或其近親屬均行知情同意。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 術(shù)檢測(cè)乳腺癌和正常乳腺組織中HULC 表達(dá)取組織，剪碎、研磨，加入細(xì)胞裂解液，按總RNA 提取試劑盒（Trizol 法，購自上海百研生物科技有限公司）說明提取總RNA，并利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國Thermo 公司）獲得cDNA，使用美國ABI 公司生產(chǎn)的7500 熒光定量PCR儀按SYBR green RT-PCR 反應(yīng)試劑盒（購自美國Thermo 公司）擴(kuò)增引物。引物序列：HULC：正向引物為5’-ACTCTGAAGTAAAGGCCGGA-3’，反向引物為5’-TGCCAGGAAACTTCTTGCTTG-3’，GAPDH：正向引物為5’-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3’，反向引物為5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反應(yīng)條件：95 ℃2 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，連續(xù)38 次循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算HULC 表達(dá)量。

1.2.2 病例隨訪 112 例病人均于術(shù)后1 天開始隨訪，中途無失訪，隨訪形式包括住院期間查房、出院后門診復(fù)查、病歷追蹤等，隨訪截止日期2020 年5月31 日，所有病人隨訪滿5 年，以死亡作為終點(diǎn)事件，記錄病人生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 21.0 軟件分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響乳腺癌病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌和正常乳腺組織中HULC 表達(dá)乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量為（2.27±0.18），高于正常乳腺組織的（1.02±0.08），差異有統(tǒng)計(jì)意義（t=67.38，P＜0.001）。

2.2 不同臨床病理指標(biāo)的乳腺癌組織中HULC 表達(dá)不同年齡、病理學(xué)類型、腫瘤直徑、是否絕經(jīng)、分子分型、PR 和HER-2 的乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同組織學(xué)分級(jí)、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER 和Ki-67 的乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同臨床病理指標(biāo)的乳腺癌組織中HULC表達(dá)/±s

表1 不同臨床病理指標(biāo)的乳腺癌組織中HULC表達(dá)/±s

注：ER為雌激素受體，PR為孕激素受體，HER-2為人類表皮生長(zhǎng)因子受體2。

指標(biāo)年齡≥57歲＜57歲病理學(xué)類型浸潤性導(dǎo)管癌其他類型腫瘤長(zhǎng)徑＞2 cm≤2 cm絕經(jīng)是否組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否分子分型Luminal A型Luminal B型HER-2過表達(dá)型TNBC型ER陽性陰性PR陽性陰性HER-2陽性陰性Ki-67≥20%＜20%例數(shù)66 46 88 24 62 50 67 45 77 35 76 36 41 71 33 29 21 29 67 45 43 69 65 47 67 45 HULC表達(dá)量2.26±0.18 2.29±0.19 2.29±0.18 2.23±0.16 2.28±0.17 2.26±0.19 2.25±0.17 2.30±0.19 2.24±0.17 2.34±0.18 2.23±0.16 2.36±0.19 2.36±0.18 2.22±0.16 2.27±0.17 2.26±0.18 2.22±0.15 2.32±0.21 2.31±0.16 2.22±0.20 2.31±0.17 2.25±0.18 2.29±0.17 2.25±0.19 2.24±0.17 2.32±0.18 t值0.73 1.50 0.51 1.45 2.70 3.51 4.16 1.13 2.56 1.55 1.38 2.44 P值0.466 0.135 0.609 0.149 0.008 0.001＜0.001 0.342 0.012 0.124 0.169 0.016

2.3 乳腺癌組織中HULC 表達(dá)對(duì)生存時(shí)間的影響 112例病人隨訪時(shí)間2～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間44 個(gè)月。以乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量的P25值為界值［9］，將病人分為低表達(dá)組（n=29）和高表達(dá)組（n=83），生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組病人平均生存時(shí)間（52.72±3.06）個(gè)月，5 年生存率為82.76%，高表達(dá)組病人則分別為（35.51±2.25）個(gè)月和36.14%，Log-Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.16，P＜0.001）。

2.4 乳腺癌病人預(yù)后影響因素分析 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，HULC 表達(dá)是影響乳腺癌病人預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素［HR=5.249（95%CI：1.965～14.024），P＜0.05］，見表2。

表2 乳腺癌病人預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

3 討論

乳腺癌作為威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)且發(fā)病年齡年輕化［10］，雖然現(xiàn)有的綜合性及個(gè)體化治療手段不斷進(jìn)步，但乳腺癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移，特別是發(fā)生腦、肺、骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是導(dǎo)致病人治療失敗及死亡的主要影響因素［11］。但目前，有關(guān)乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制及作用基因尚未完全研究清楚。有研究指出，lncRNA 表達(dá)失調(diào)參與了惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程［12］。且乳腺癌病人存在lncRNA 表達(dá)異常［13-14］。HULC 作為一種位于人染色體6p24.3 上的lncRNA，主要位于細(xì)胞質(zhì)，可通過結(jié)合核糖體而在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用［15］。有研究指出［16］，HULC 在HBV 相關(guān)肝癌表達(dá)量升高，可作為早期診斷潛在標(biāo)志。葉華等［17］指出，HULC 參與了膽管細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展。王鵬等［18］則指出，HULC 調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量高于正常乳腺組織，說明HULC 在乳腺癌組織中呈高表達(dá)。且進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量升高，說明HULC 表達(dá)與乳腺癌惡性進(jìn)程指標(biāo)有關(guān)，可能參與了乳腺癌惡性進(jìn)行，同時(shí)，本研究顯示，ER 陽性和Ki-67＜20%的腺癌組織中HULC 表達(dá)量升高，進(jìn)一步說明HULC 可能通過調(diào)控ER 活化劑參與細(xì)胞增殖而在乳腺癌進(jìn)程中發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制有待開展相關(guān)研究予以明確。

Ding等［19］通過對(duì)各種癌癥病人HULC 的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行薈萃分析和系統(tǒng)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，lncRNA HULC 可作為癌癥預(yù)后和轉(zhuǎn)移的新分子標(biāo)記。本研究Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，HULC 低表達(dá)組病人平均生存時(shí)間和5 年生存率均高于高表達(dá)組，說明乳腺癌病人組織中HULC 高表達(dá)可能與其不良預(yù)后有關(guān)。行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，HULC表達(dá)是影響乳腺癌病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，進(jìn)一步說明HULC 表達(dá)可能是影響病人預(yù)后的因素，可能是評(píng)估病人預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，乳腺癌組織中HULC 表達(dá)量升高，可能發(fā)揮類似癌基因的作用而參與了乳腺癌進(jìn)展，且是影響病人預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，有望成為評(píng)估病人預(yù)后的潛在標(biāo)志物。