楊海榮，豐樹菊，杜鵬琳

人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要致病因素，也是宮頸疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素之一，HPV 與宿主DNA 相結(jié)合對基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，從而導致宿主細胞發(fā)生惡性增殖，由宮頸炎開始，經(jīng)過不典型增生，發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），最終演變?yōu)閷m頸癌［1］。宮頸癌是嚴重危害婦女健康的第二位惡性腫瘤，病人比例達到8%［2］，但HPV 感染引起的宮頸上皮癌變的分子機制尚未明確，近年來DNA 甲基化的研究備受關注。CIN 作為宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，是一組可進展成為宮頸癌的癌前病變統(tǒng)稱，在宮頸包括子宮頸上皮非典型增生至原位癌一系列癌前病變的連續(xù)過程［3］。為降低宮頸癌的發(fā)生率及死亡率，改善預后效果，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早治療尤為關鍵。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化DNA序列中胞嘧啶的5’碳原子發(fā)生甲基化修飾并成為5’-甲基胞嘧啶，從而進一步影響DNA 轉(zhuǎn)錄過程［4］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）是機體內(nèi)細胞中最豐富的的甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠維持甲基化作用［5］。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）是DNMTs 中的另一重要成員，在新形成甲基化時發(fā)揮關鍵作用［6］。高曉斌等［7］研究表明，DNMT1、DNMT3a 具有協(xié)同作用，均可作為結(jié)直腸癌早期診斷的潛在生物學指標。但目前DNMT1、DNMT3a 并未在宮頸癌診斷中應用，且有關宮頸癌及癌前病變中DNMT1、DNMT3a 表達的研究較少，本實驗探究了宮頸癌及癌前病變病人血清DNMT1、DNMT3a 表達情況及與HPV 感染的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017 年9 月至2019 年9 月于焦煤集團中央醫(yī)院收治住院的宮頸癌及癌前病變病人128 例作為觀察組，年齡（40.33±7.96）歲，其中宮頸癌58 例為宮頸癌組，宮頸癌前病變70 例為癌前病變組。選取同期入院體檢的正常女性志愿者50 例作為對照組，年齡（39.89±8.32）歲。將宮頸癌組病人按FIGO 分期：Ⅰ期組24 例，Ⅱ期組21 例，Ⅲ期組13 例。將宮頸癌前病變病人根據(jù)組織病理學檢測明確臨床分級，分為CIN Ⅰ級組26 例，Ⅱ級組23 例，Ⅲ級組21 例。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

納入標準：（1）宮頸癌病人均經(jīng)宮頸活檢病理或術后病理檢查確診；（2）CIN 診斷標準參照中國抗癌協(xié)會制定的相關標準，即行陰道鏡下多點活檢且病理學檢查結(jié)果診斷為CIN；（3）所有受試者年齡均≥20 歲，臨床病理資料完整；（4）所有受試者及近親屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：（1）存在其他部位原發(fā)性惡性腫瘤，且向?qū)m頸內(nèi)轉(zhuǎn)移者；（2）合并嚴重糖尿病、高血脂及自身免疫性疾病者；（3）合并嚴重精神系統(tǒng)疾病者；（4）合并嚴重心肝腎功能不全者。

1.2 主要試劑與儀器 DNMT1、DNMT3a ELISA 試劑盒（上海一研生物科技有限公司，貨號EY-elisa4035、EY-elisa4034）、酶標儀（Wellscan MK3）、高速冷凍離心機（日立公司，TG-16WS）。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本的采集與保存所有受試者均于清晨空腹抽取靜脈血5 mL，置于干燥管內(nèi)，37 ℃水浴30 min，以3 000 r/min 離心3 min，分離上層血清，置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清DNMT1、DNMT3a水平采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對血清DNMT1、DNMT3a 水平進行檢測。試劑盒由上海一研生物科技有限公司提供，操作步驟嚴格按照試劑盒

說明書進行。

1.3.3 HPV 感染檢測采用第二代雜交捕獲法（hybrid capture Ⅱ，HC-Ⅱ）檢測HPV-DNA，在收集的受試者宮頸分泌物及組織樣本中加入裂解液使DNA雙鏈分解為單鏈，加入RNA 探針與DNA 單鏈結(jié)合為RNA-DNA 雜交體，采用特異性抗體將RNA-DNA雜交體固定于微孔壁上，將該雜交體與有堿性磷酸酶的多個第二抗體結(jié)合，是信號放大，最后堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光，利用光的強弱對含量進行判斷，從而判斷HPV 感染情況。若可見DNA 負荷量≥1.0 ng/L［相對發(fā)光度單位（RLU）/陽性定標閾值（CO）≥1.0］即為陽性，反之為陰性。高危HPV 包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。

1.3.4 病理切片觀察取宮頸癌病人手術切除癌組織樣本及癌前病變病人活檢組織樣本制成液基細胞學標本，進行HE 染色。分別觀察宮頸癌及癌前病變病人病理切片形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學方法利用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用±s進行描述，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析的方法，多組之間多重比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組與癌前病變組病理切片形態(tài)比較宮頸癌前病變病人組織邊界較清晰，鏡下示腫瘤細胞密度低，細胞有輕度異型性。宮頸癌組織細胞鏡下示細胞核異型性較明顯，腫瘤細胞密度高。

2.2 各組血清DNMT1、DNMT3a 表達水平比較與對照組相比，宮頸癌前病變組與宮頸癌組病人血清DNMT1、DNMT3a水平均顯著升高（P＜0.05），與宮頸癌前病變組相比，宮頸癌組病人血清DNMT1、DNMT3a水平顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組受試者血清DNMT1、DNMT3a表達水平/（μg/L，±s）

表1 各組受試者血清DNMT1、DNMT3a表達水平/（μg/L，±s）

注：DNMT1 為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a 為DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a。①與對照組比較，P＜0.05。②與宮頸癌前病變組比較，P＜0.05。

組別對照組宮頸癌前病變組宮頸癌組F值P值例數(shù)50 70 58 DNMT1 13.03±2.65 26.78±5.84①44.72±9.36①②311.95＜0.001 DNMT3a 346.12±67.34 415.03±82.56①607.48±125.19①②113.17＜0.001

2.3 血清DNMT1、DNMT3a 水平與臨床病理的相關性血清DNMT1、DNMT3a水平與宮頸癌病人FIGO 分期、CIN 分級、HPV 危險程度均相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）表達水平與臨床病理相關性/（μg/L，±s）

表2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DNMT3a）表達水平與臨床病理相關性/（μg/L，±s）

項目FIGO分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期CIN分級Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級HPV感染類型高危型普通型例數(shù)24 21 13 26 23 21 75 26 DNMT1 40.60±6.02 45.92±6.33 50.38±5.10 19.47±4.34 27.15±5.11 35.43±6.28 42.16±6.30 25.57±5.24 F值12.06 54.13（12.05）P值＜0.001＜0.001＜0.001 DNMT3a 551.34±81.22 621.54±70.32 688.41±65.79 367.65±71.91 420.97±69.23 467.18±57.38 569.36±103.99 405.24±76.37 F值14.99 12.96（7.38）P值＜0.001＜0.001＜0.001

2.4 血清DNMT1、DNMT3a 水平對宮頸癌的診斷價值以血清DNMT1、DNMT3a 單個指標檢驗值及二者聯(lián)合預測概率值為檢驗變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，血清DNMT1、DNMT3a 診斷宮頸癌的AUC分別為0.918（95%CI：0.866～0.969）、0.875（95%CI：0.815～0.934），截斷值分別為36.049 μg/L、563.431μg/L，特異性分別為92.9%、94.3%，敏感度分別為82.8%、70.7%；二者聯(lián)合診斷宮頸癌的AUC 為0.960（95%CI：0.919～0.999），特異性為94.3%，敏感度為91.4%。見圖1。

圖1 血清DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a（DN MT3a）水平診斷宮頸癌的ROC曲線

2.5 各組HPV 感染情況比較宮頸癌組HPV 陽性率最高為100.00%，宮頸癌前病變組HPV 陽性率為61.43%，對照組HPV 陽性率為6.00%，三組HPV 感染情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=98.11，P＜0.05），見表3。

表3 各組HPV感染情況比較

2.6 HPV 感染與未感染病人血清DNMT1、DNMT3a 表達水平比較 HPV 感染組血清DNMT1、DNMT3a 水平高于HPV 未感染組；HPV 感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a 水平高于HPV 未感染組，均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4，5。

表4 HPV感染組與未感染組DNMT1、DNMT3a表達水平比較/（μg/L，±s）

表4 HPV感染組與未感染組DNMT1、DNMT3a表達水平比較/（μg/L，±s）

注：DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a。

組別HPV感染組HPV未感染組t值P值例數(shù)101 27 DNMT1 37.89±12.67 23.76±7.83 5.51＜0.001 DNMT3a 527.11±119.06 409.18±56.19 4.99＜0.001

表5 HPV感染組與未感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a表達水平比較/（μg/L，±s）

表5 HPV感染組與未感染組健康女性血清DNMT1、DNMT3a表達水平比較/（μg/L，±s）

注：DNMT1為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，DNMT3a為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a。

組別HPV感染組HPV未感染組t值P值例數(shù)3 47 DNMT1 16.84±4.21 9.42±1.87 6.16＜0.001 DNMT3a 364.28±70.22 291.14±52.61 2.30＜0.001

3 討論

宮頸癌是婦科生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是一種在多因素共同作用下發(fā)生的多步驟、漫長的病變過程，在全球范圍每年新發(fā)病例50 萬以上，隨檢出率及治療手段的不斷進步，死亡率有所改善，但仍無法令人滿意［8］。臨床中發(fā)現(xiàn)宮頸癌的發(fā)展是一個漸變過程，病程較長，CIN 病變是宮頸癌前期病癥，在癌前病變向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化的過程中，多種基因改變導致的細胞增殖及分化異常，是細胞凋亡和增殖間的平衡狀態(tài)被打破，從而導致細胞非正常生理狀態(tài)增殖，形成宮頸惡性瘤變，給病人的生命健康帶來嚴重威脅［9］。HPV 被認為是宮頸癌及癌前病變的重要致病因素，有研究表明，85%～95%的宮頸癌病人癌組織中能夠檢出HPV［10］。HPV 是一種DNA 病毒，其通過黏膜入侵靶細胞，將DNA 整合到宿主染色體，破壞宿主細胞的正常細胞周期，進而形成癌組織［11］。近年來，大量研究表明，表觀遺傳學的異常與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關，特別是DNA 甲基化在宮頸癌中起重要作用［12］。在DNA 甲基化過程中，DNMT 的表達水平與功能的改變是導致異常DNA 甲基化模式的因素之一［13］。目前對HPV 感染與甲基轉(zhuǎn)移酶是否存在相關性研究較少，本實驗探討了宮頸癌及癌前病變病人血清DNMT1、DNMT3a表達水平及與HPV感染的關系。

DNMT1 是最早發(fā)現(xiàn)的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，定位于19p13.3-p13.2，其cDNA 全長5 434 bp，由1 495 個氨基酸組成［14］。DNMT1 是作用于半甲基化DNA 的維持甲基化轉(zhuǎn)移酶，其對新合成的DNA 單鏈進行甲基化修飾，并將甲基化陰性傳遞給子代細胞［15］。DNMT1 的主要功能是保證新合成的DNA 具有高度保真性，并且維持甲基化轉(zhuǎn)移酶的功能，DNA 甲基化通過DNMT 催化作用，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶核苷酸的嘧啶環(huán)第5 位碳原子甲基化，形成CpG 島，正常細胞DNMT1 過表達可能導致CpG 島超甲基化，從而促進細胞轉(zhuǎn)化［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，DNMT1 高表達可能通過調(diào)控CDC25B 來發(fā)揮致癌作用［17］。DNMT3a 是一種催化DNA 甲基化的關鍵酶，通過調(diào)控多種基因表達參與了腫瘤細胞的凋亡過程，其在原始胚胎形成中具有重要作用，主要功能是催化DNA 甲基化的新生位點［18］。有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3a在胃癌、外陰鱗狀細胞癌及胰腺癌等多種腫瘤細胞中呈高表達［19］。在卵巢癌中，下調(diào)DNMT3a 增強了miR-182 表達誘導細胞凋亡，miR-101 通過靶向調(diào)控DNMT3a，抑制人卵巢癌細胞生長與侵襲［20］。羅舒等［21］研究結(jié)果顯示，DNMT1在宮頸癌組織中高表達，且對不良預后有重要預測作用。Sun等［22］研究中發(fā)現(xiàn)，miR-182可通過抑制DNMT3a的表達誘導宮頸癌細胞凋亡。雖已有研究表明DNMT1、DNMT3a 與宮頸癌及其預后有密切聯(lián)系，但二者與宮頸癌及癌前病變病人HPV 感染的相關性研究較少。本實驗結(jié)果顯示，宮頸癌及癌前病變組病人血清DNMT1、DNMT3a 表達水平顯著高于對照組，宮頸癌病人血清DNMT1、DNMT3a 表達水平顯著高于癌前病變組，提示血清DNMT1、DNMT3a 參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，宮頸癌的的發(fā)生與抑癌基因異常的甲基化狀態(tài)有關。血清DNMT1、DNMT3a 表達水平與宮頸癌病人FIGO 分級、癌前病變病人CIN 分期、HPV 感染危險程度相關，提示高表達的DNMT1、DNMT3a 介導的DNA 甲基化過程能夠抑制促凋亡分子的表達，與宮頸癌及癌前病變的嚴重程度密切相關，高危HPV與DNA整合后使DNA 發(fā)生更復雜的基因表達異常，通過基因表達的改變來影響細胞的生物學特征。此外，本研究中血清DNMT1、DNMT3a 對宮頸癌均有一定的診斷價值，特異性分別為92.9%、94.3%，敏感度分別為82.8%、70.7%，且二者聯(lián)合后診斷敏感度為91.4%，有明顯提升。HPV 感染情況結(jié)果顯示，宮頸癌病人HPV 陽性率為100.00%，宮頸癌前病變組HPV 陽性率為61.43%，對照組HPV 陽性率為6.00%，三組HPV 感染情況比較結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義。提示HPV 感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關。不同HPV 感染情況病人血清DNMT1、DNMT3a 表達水平比較顯示，HPV 感染組病人及健康女性血清DNMT1、DNMT3a 水平顯著高于未感染組，提示DNMT1、DNMT3a 與HPV 感染密切相關，HPV 感染與DNA 異常甲基化存在聯(lián)系，HPV 病毒有可能通過與DNMT 結(jié)合，促使DNMT 與DNA 和腺苷氨酸結(jié)合，進而使某些抑癌基因表達沉默，導致宮頸癌的發(fā)生。有研究報道，大多數(shù)HPV 感染可通過自身免疫清除，僅少數(shù)病人感染持續(xù)，并最終發(fā)展為宮頸癌前病變甚至宮頸癌。

綜上所述，宮頸癌及癌前病變病人血清中DNMT1、DNMT3a 表達水平顯著升高，CIN 病人HPV 感染率顯著低于宮頸癌病人，HPV 感染病人血清中DNMT1、DNMT3a 呈高表達，血清DNMT1、DNMT3a水平與宮頸癌、CIN 病人的嚴重程度、HPV 感染類型有關，宮頸癌及CIN 病人HPV 感染與甲基轉(zhuǎn)移酶催化的甲基化反應有關。