王新征，侯永強(qiáng)，汲權(quán)威

甲狀腺結(jié)節(jié)是一種常見的甲狀腺病，甲狀腺上的結(jié)節(jié)可能是結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺瘤、甲狀腺癌等病因，未明確性質(zhì)前統(tǒng)稱為甲狀腺結(jié)節(jié)［1］。因術(shù)前甲狀腺結(jié)節(jié)確診較為困難，造成國(guó)內(nèi)外對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)存在普遍過(guò)度治療［2］。早期發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤并進(jìn)行良惡性區(qū)分，對(duì)臨床后期治療和預(yù)后評(píng)估有至關(guān)重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類長(zhǎng)度大于200 核苷酸的非編碼RNA的總稱，LncRNA雖不編碼蛋白質(zhì)，但可通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。研究表明，LncRNA-尿路上皮癌相關(guān)分子1（lncRNA urothelial carcinoma associated 1，LncRNA UCA1）在胃癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并發(fā)揮致癌基因的作用［4-5］，然而關(guān)于LncRNA UCA1 在甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)鑒別診斷中的研究較少。本研究通過(guò)檢測(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)病人術(shù)前血清LncRNA UCA1 水平，初步探討LncRNA UCA1 水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價(jià)值，以期為甲狀腺癌的早期干預(yù)和預(yù)后評(píng)估提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018 年1 月至2020 年1 月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院治療的甲狀腺乳頭狀癌病人48 例（甲狀腺乳頭狀癌組）和甲狀腺良性結(jié)節(jié)病人32例（良性結(jié)節(jié)組）為研究對(duì)象（均為術(shù)后病理確診），兩組病人均無(wú)臨床癥狀，由病人偶爾或體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)。同期選取甲狀腺功能正常的49 例健康體檢人群為健康對(duì)照組。三組性別、年齡、單發(fā)或多發(fā)、結(jié)節(jié)大小比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性結(jié)節(jié)及健康對(duì)照一般資料結(jié)果比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人符合甲狀腺乳頭狀癌及甲狀腺良性結(jié)節(jié)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，并經(jīng)超聲、病理活檢確診；②病歷資料完整者；③既往無(wú)頸部手術(shù)史；④既往無(wú)惡性腫瘤史，且未接受放化療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有慢性炎癥性疾病、急性感染性疾病者；②伴有肝炎、腎病、糖尿病、結(jié)核病等其他內(nèi)科疾病者；③精神異常者；④嚴(yán)重的肝腎功能不全者；⑤妊娠或哺乳期婦女。本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（倫理批號(hào)20171209），所有受試對(duì)象均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究?jī)?nèi)容并自愿參加，同時(shí)簽署手術(shù)知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天漠科技開發(fā)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；miScript SYBR? Green Mix，購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司。qRT-PCR儀（型號(hào)7500），購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存抽取健康體檢者體檢時(shí)及兩組病人術(shù)前清晨空腹靜脈血樣5 mL，3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測(cè)血清中LncRNA UCA1 水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法檢測(cè)三組受試者血清中LncRNA UCA1表達(dá)水平。采用RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用qRTPCR儀對(duì)LncRNA UCA1及其內(nèi)參GAPDH基因進(jìn)行擴(kuò)增。qRT-PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA（50 ng/μL）2 μL，miScript SYBR?Green Mix 10 μL，上下游引物（10 μM）各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。LncRNA UCA1 及內(nèi)參GAPDH 基因的引物序列見表2，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清中LncRNA UCA1 相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特性曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）分析血清中LncRNA UCA1 水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照組、良性結(jié)節(jié)組及甲狀腺乳頭狀癌組血清LncRNA UCA1 水平比較甲狀腺乳頭狀癌組LncRNA UCA1 水平高于健康對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)組，良性結(jié)節(jié)組LncRNA UCA1 水平高于健康對(duì)照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 健康對(duì)照組、良性結(jié)節(jié)組及甲狀腺乳頭狀癌組血清LncRNA UCA1水平比較/±s

表3 健康對(duì)照組、良性結(jié)節(jié)組及甲狀腺乳頭狀癌組血清LncRNA UCA1水平比較/±s

注：①與健康對(duì)照組比較，P＜0.05。②與良性結(jié)節(jié)組比較，P＜0.05。

組別健康對(duì)照組良性結(jié)節(jié)組甲狀腺乳頭狀癌組F值P值例數(shù)49 32 48 LncRNA UCA1 1.00±0.24 1.48±0.30①2.13±0.49①②116.40 0.000

2.2 血清LncRNA UCA1 水平對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的鑒別診斷價(jià)值以血清LncRNA UCA1 水平為檢驗(yàn)變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，血清LncRNA UCA1 水平診斷甲狀腺良性結(jié)節(jié)的曲線下面積（AUC）為0.899（95%CI：0.835～0.963），截?cái)嘀禐?.194，特異度為81.6%，靈敏度為81.3%；血清LncRNA UCA1 水平診斷甲狀腺乳頭狀癌的AUC 為0.891（95%CI：0.817～0.966），截?cái)嘀禐?.837，特異度為96.9%，靈敏度為77.1%。見圖1，2。

圖1 血清LncRNA UCA1水平對(duì)甲狀腺良性結(jié)節(jié)診斷的ROC曲線

2.3 LncRNA UCA1 表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理特征的關(guān)系根據(jù)甲狀腺乳頭狀癌病人血清LncRNA UCA1水平平均值（2.13），24例高于平均值病人為L(zhǎng)ncRNA UCA1 高表達(dá)組，24 例低于平均值病人為L(zhǎng)ncRNA UCA1 低表達(dá)組。兩組年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LncRNA UCA1 高表達(dá)組多發(fā)病灶、腫瘤大?。?0 mm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期的病人比例高于LncRNA UCA1 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

圖2 血清LncRNA UCA1水平對(duì)甲狀腺癌診斷的ROC曲線

表4 LncRNA UCA1表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌病人臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

3 討論

甲狀腺結(jié)節(jié)屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)最為常見的疾病，在不同的地區(qū)其發(fā)病率有較大差別［7］。但臨床上甲狀腺腺瘤或結(jié)節(jié)性甲狀腺腫與甲狀腺癌有時(shí)不易鑒別，造成甲狀腺癌臨床確診困難，存在較高的誤診和漏診情況，以至于導(dǎo)致病人治療不及時(shí)、預(yù)后較差、平均存活時(shí)間較短等情況發(fā)生［9］。因此，臨床上急需有效的高特異度、靈敏度的生物標(biāo)志物，用于早期鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性，改善預(yù)后。

LncRNA 是由RNA 聚合酶Ⅱ?qū)ζ溥M(jìn)行轉(zhuǎn)錄、聚腺苷酸化和剪接而成的RNA，LncRNA 的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后均存在非常重要的關(guān)聯(lián)，是腫瘤預(yù)防、治療、預(yù)后的突破口［10-11］。LncRNA 可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)、影響蛋白在細(xì)胞中的定位等多種方式在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用［12］。LncRNA UCA1 提取自人膀胱移行癌細(xì)胞株，廣泛參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。宋小青等［13］研究表明，LncRNA UCA1 的異常高表達(dá)與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征及病人預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果中，甲狀腺乳頭狀癌組LncRNA UCA1水平高于健康對(duì)照組和良性結(jié)節(jié)組，與Liu 等［14］研究結(jié)果中LncRNA UCA1 的表達(dá)趨勢(shì)一致。提示LncRNA UCA1的高表達(dá)可能與甲狀腺結(jié)節(jié)由良性發(fā)展為惡性有重要聯(lián)系，推測(cè)其可能機(jī)制為：LncRNA UCA1 作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA，其高表達(dá)可負(fù)性調(diào)節(jié)下游與甲狀腺癌相關(guān)的miRNA 的表達(dá)水平，消除miRNA 對(duì)靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)源性抑制作用，從而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而加重病人病情，使病人由甲狀腺良性結(jié)節(jié)發(fā)展為甲狀腺乳頭狀癌。本研究結(jié)果中，血清LncRNA UCA1水平診斷甲狀腺良性結(jié)節(jié)及甲狀腺乳頭狀癌的AUC 分別為0.899、0.891，截?cái)嘀捣謩e為1.194、1.837，特異度分別為81.6%、96.9%，靈敏度分別為81.3%、77.1%。提示血清LncRNA UCA1 的表達(dá)水平可對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性有一定的鑒別診斷價(jià)值，且其診斷特異性較高，當(dāng)LncRNA UCA1 水平大于1.194 且小于時(shí)1.837，甲狀腺結(jié)節(jié)病人為良性的可能性更高，當(dāng)LncRNA UCA1水平大于1.837 時(shí)，甲狀腺結(jié)節(jié)為甲狀腺癌的概率更大，對(duì)臨床診斷有一定的參考作用。此外，本研究中LncRNA UCA1高表達(dá)病人多發(fā)病灶、腫瘤大?。?0 mm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的病人比例高于LncRNA UCA1 低表達(dá)病人。進(jìn)一步提示LncRNA UCA1的高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，臨床中密切監(jiān)測(cè)LncRNA UCA1水平變化，可能對(duì)甲狀腺乳頭狀癌臨床后期治療和預(yù)后評(píng)估有重要意義。

綜上所述，血清LncRNA UCA1在甲狀腺乳頭狀癌病人血清中呈高表達(dá)，且對(duì)鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性有一定的價(jià)值，同時(shí)與甲狀腺癌的臨床病理特征有一定的相關(guān)性。本研究為鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性提供了新的思路和方向，同時(shí)為甲狀腺癌的早期干預(yù)及治療提供了一定的理論依據(jù)。但作為回顧性研究，本研究樣本數(shù)量有限，且樣本受區(qū)域限制，因此后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步深入研究其具體作用機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值。