■楊小軍 楊 欣 孔祥峰 蘇 勇 曾祥芳 劉作華 王佳堃 姚軍虎*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；2.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095；4.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193；5.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；6.浙江大學動物科學學院，浙江 杭州 310058）

消化道不僅是營養(yǎng)物質消化吸收的場所，也是重要的免疫器官。消化道健康標志物的研究、標準的建立對于評估畜禽機體健康尤為重要。對于畜禽而言，消化道內(nèi)強有力的消化吸收、完整的物理屏障、特異性的化學屏障、穩(wěn)定的微生物區(qū)系和適度的黏膜免疫可以有效地幫助宿主調(diào)控采食、營養(yǎng)利用、機體健康及繁殖生理，因此，以上5個方面可作為“畜禽消化道健康五環(huán)檢驗標準”。其中，腸道黏膜免疫主要包括分散在腸道黏膜上皮和固有層的免疫細胞（腸上皮細胞、腸上皮內(nèi)淋巴細胞、固有層淋巴細胞等）、免疫分子（如各類細胞因子和分泌型免疫球蛋白等）以及腸道相關淋巴組織（派爾集合淋巴結、腸細胞淋巴結）（見圖1）[1]。它們之間相互獨立，又相互聯(lián)系，共同維持腸道黏膜的免疫功能。

圖1 腸道黏膜免疫系統(tǒng)的結構

由免疫細胞和腸道相關淋巴組織參與構成機體免疫防御的第一道防線，當腸道黏膜受到抗原刺激后，其黏膜內(nèi)的免疫細胞和淋巴組織產(chǎn)生免疫應答并分泌細胞因子、免疫球蛋白，以抵御腸道內(nèi)的細菌、病毒及其他有害物質的入侵[2]。其中，分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，sIgA）和細胞因子是目前研究最多的指標。當機體遭受侵入性微生物攻擊時，sIgA 類抗體可以識別并中和黏膜上皮內(nèi)的病原體、毒素等有害物質、調(diào)控腸道黏膜適應性反應，而細胞因子可以發(fā)揮調(diào)控機體固有免疫、適應性免疫、血細胞生成、細胞生長以及損傷組織修復等生理功能[3-4]。目前，大多數(shù)腸道黏膜免疫指標在人類和小鼠模型上研究得較為深入，而能否作為定量評估畜禽消化道健康的生物標記物還有待研究。文章旨在基于Meta 分析評估腸道黏膜免疫中sIgA 和細胞因子在畜禽病理狀態(tài)下作為生物標記物的可行性，為畜禽消化道健康檢驗標準提供黏膜免疫方面的參考意見和技術指導。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索

通過知網(wǎng)、Science Direct、PubMed、Web of Sci?ence等數(shù)據(jù)庫，搜索從建庫至2021年5月發(fā)表的研究性文獻。以腸道黏膜免疫（intestinal mucosal immuni?ty）、肉雞（broiler）、蛋雞（hen）、豬（pig）、牛（cattle）、羊（sheep）相應的中英文作為檢索詞。

1.2 文獻篩選

1.2.1 納入標準

篩選隨機對照試驗設計，處理為益生或應激；腸道黏膜免疫指標含有sIgA 濃度、細胞因子表達量、免疫細胞數(shù)量，單位一致或可換算一致；數(shù)據(jù)包括“平均值±標準差（SD）或標準誤（SE）”，如SD 未提供，可用公式計算。

式中：n——樣本量。

1.2.2 排除標準

排除會議記錄、文獻綜述；排除未呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的SD或SE的文獻；排除試驗方法不明確、缺乏對照組、無腸道黏膜免疫相關指標以及與同類文章差異過大的文獻。

1.3 統(tǒng)計分析

通過RevMan 5.3軟件進行數(shù)據(jù)分析，效應量為連續(xù)性變量資料，P<0.05表示差異顯著。若P≥0.05，I2<50%，表明無異質性，進行固定效應模型分析；若P<0.05，I2≥50%，表明存在顯著的異質性，利用隨機效應模型分析異質性來源[5]。另外，漏斗圖用于評估發(fā)表偏倚。

2 結果與分析

2.1 檢索結果

數(shù)據(jù)庫中共搜索到784篇文獻，剔除數(shù)據(jù)庫交叉重復文獻、按照納入和排除標準共篩選出138 篇文獻，其中sIgA 44篇，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）55篇，白細胞介素1β（IL-1β）52 篇，白細胞介素10（IL-10）46 篇，白細胞介素6（IL-6）41 篇，γ干擾素（IFN-γ）35 篇，白細胞介素4（IL-4）8 篇，白細胞介素2（IL-2）6 篇。腸道黏膜免疫其他相關指標檢索到的文獻不符合Meta分析的標準。

2.2 Meta分析結果

2.2.1 分泌型免疫球蛋白與腸道健康（見表1、表2）

從表1 中的效應值可以發(fā)現(xiàn)豬在病理狀態(tài)下顯著降低腸道內(nèi)sIgA濃度（P<0.05），平均可降低2.89個單位；肉雞腸道內(nèi)sIgA的濃度在健康和病理狀態(tài)下未發(fā)生顯著變化，但肉雞在病理狀態(tài)下存在降低腸道sIgA濃度的趨勢，平均可降低0.18個單位。表明動物在病理狀態(tài)下，腸道sIgA濃度有明顯的下降趨勢。基于此，我們進一步確定了動物腸道sIgA濃度的健康范圍（見表2）。

表1 sIgA的Meta分析

表2 sIgA的健康范圍

2.2.2 細胞因子與腸道健康（見表3、圖2～圖6）

圖2 豬病理狀態(tài)下腸道TNF-α表達量的Meta分析

圖3 肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-1β表達量的Meta分析

圖4 肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-10表達量的Meta分析

圖5 肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-6表達量的Meta分析

圖6 蛋雞病理狀態(tài)下腸道IFN-γ表達量的Meta分析

表3 細胞因子基因表達量的Meta分析

由表3可知，與對照組相比，試驗組動物（益生或應激處理）腸道細胞因子的水平發(fā)生明顯的變化，總體趨勢是動物病理狀態(tài)下促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ的水平明顯增加，而抗炎因子IL-10的水平明顯降低。益生組動物出現(xiàn)相反的趨勢，其中，豬病理狀態(tài)下腸道TNF-α表達量分析結果不存在研究間異質性（I2=17.0%，P=0.28），故采用固定效應模型合并效應量（見圖2）。結果顯示，合并效應量在無效線右側，且不與無效線相交，表明豬病理狀態(tài)下顯著增加了腸道的TNF-α表達量（P<0.05），平均可增加1.49個單位。肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-1β表達量分析結果存在研究間異質性（I2=51.0%，P=0.02），故采用隨機效應模型合并效應量（見圖3）。結果顯示，合并效應量在無效線右側，且不與無效線相交，表明肉雞病理狀態(tài)下顯著增加了腸道IL-1β表達量（P<0.05），平均可增加1.93 個單位。肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-10表達量分析結果同樣存在研究間異質性（I2=88.0%，P<0.01），故采用隨機效應模型合并效應量（見圖4）。結果顯示，合并效應量在無效線右側，但與無效線相交，表明肉雞病理狀態(tài)下降低腸道IL-10 表達量（P=0.73），平均可減少0.22 個單位。肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-6 表達量分析結果存在研究間異質性（I2=85.0%，P<0.01），故采用隨機效應模型合并效應量（見圖5）。結果顯示，合并效應量在無效線右側，且不與無效線相交，表明肉雞病理狀態(tài)下顯著增加腸道IL-6表達量（P<0.05），平均可增加1.55個單位。另外，蛋雞病理狀態(tài)下腸道IFN-γ表達量分析結果存在研究間異質性（I2=93.0%，P<0.01），故采用隨機效應模型合并效應量（見圖6）。結果顯示，合并效應量在無效線右側，且不與無效線相交，表明蛋雞病理狀態(tài)下顯著增加了腸道IFN-γ（P<0.05），平均可增加5.56個單位。

2.3 發(fā)表偏倚（見圖7）

圖7 畜禽病理狀態(tài)下腸道黏膜免疫95%置信區(qū)間

漏斗圖分析結果表明（見圖7），豬病理狀態(tài)下腸道TNF-α的相對表達量、肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-1β和IL-10 的相對表達量的大部分研究均集中在漏斗圖上部且向中間集中，對稱性較好，僅有少量研究分布于漏斗圖外，說明研究的樣本量大、具有代表性，且試驗精度高、數(shù)據(jù)準確。而豬病理狀態(tài)下腸道sIgA濃度、肉雞病理狀態(tài)下腸道IL-6 以及蛋雞病理狀態(tài)下腸道IFN-γ的相對表達量的大部分研究集中在漏斗圖的中上部，但對稱性差，且有部分研究分布在漏斗圖下部或外部，說明存在少量發(fā)表偏倚。

3 討論

畜禽消化道健康在宿主行為調(diào)控、營養(yǎng)物質代謝調(diào)控及抵抗病原微生物等方面發(fā)揮著重要作用[6-7]。作為“畜禽消化道健康定量評估五環(huán)檢驗標準”之一的黏膜免疫系統(tǒng)是腸道接觸外來抗原，最初形成免疫應答的部位，是執(zhí)行局部非特異性免疫功能的場所，對于維持腸道健康起著重要作用。在目前有關腸道黏膜免疫的研究中，由于試驗設計、試驗對象和試驗條件等多方面因素導致各個研究結果并不完全一致。匯集大量獨立相關研究文獻的傳統(tǒng)文獻綜述（非Meta分析）可能會因為作者的主觀性、研究方向、研究興趣和認識程度的不同得出差異性結論。為了打破傳統(tǒng)敘述性文獻綜述只能進行定性分析的瓶頸，Meta分析應運而生，并在基礎醫(yī)學、生態(tài)環(huán)境、公共衛(wèi)生等多個領域得到了廣泛的應用[8]。Meta分析能夠系統(tǒng)提煉現(xiàn)有文獻的研究數(shù)據(jù)，并對原始數(shù)據(jù)進行二次整合，從而得到大數(shù)據(jù)視角下定量的研究結論[9]。本研究通過Meta分析對不同物種（豬、牛、羊、肉雞、蛋雞）在不同狀態(tài)下腸道黏膜免疫相關指標變化趨勢的研究進行匯總，以期提供一個科學合理的腸道黏膜免疫評價體系。

3.1 分泌型免疫球蛋白與腸道健康

血漿細胞分泌的sIgA 是體內(nèi)最豐富的免疫球蛋白，在腸道黏膜免疫中起著重要的作用[10]。sIgA 在腸道黏膜免疫中的作用包括免疫排斥、抗原呈遞和與腸道共體相互作用[11-14]，sIgA在維持腸道黏膜免疫、預防腸道感染方面發(fā)揮著至關重要的作用。從表1可以發(fā)現(xiàn)，豬腸道內(nèi)sIgA的濃度在健康和疾病狀態(tài)下存在顯著差異。這與先前的研究結果一致，Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 導致腸道炎癥的仔豬，其腸道內(nèi)sIgA 的濃度顯著低于健康仔豬。同樣地，產(chǎn)后發(fā)育遲緩仔豬腸道內(nèi)sIgA的濃度也顯著低于健康仔豬，并且導致腸道黏膜屏障功能惡化[16]。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，sIgA具有增強腸道黏膜免疫功能的作用。表明sIgA 的濃度一定程度上可以反映腸道黏膜免疫的功能，進而反映腸道的健康狀態(tài)。然而，肉雞腸道sIgA 的Meta 分析結果未出現(xiàn)顯著差異，但是出現(xiàn)了與豬Meta 分析結果同樣的趨勢，可能的原因是納入Meta 分析的文章較少，不足以呈現(xiàn)顯著差異。此外，由于牛、羊、蛋雞關于sIgA研究的相關文獻不符合本研究的納入標準，因此對這幾個物種腸道sIgA濃度未進行相應的Meta 分析。但是基于豬和肉雞的Meta 分析結果，不難發(fā)現(xiàn)，動物腸道內(nèi)sIgA 的濃度在其健康和疾病狀態(tài)下存在明顯區(qū)別。因此，建議未來在評估動物腸道健康時應該納入黏膜sIgA這一指標。

3.2 細胞因子與腸道健康

由腸上皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等腸道免疫細胞分泌的細胞因子，主要產(chǎn)生于天然免疫和特異性免疫的效應階段，可介導免疫應答和炎癥反應[18]。根據(jù)細胞因子的主要功能可以將其分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、生長因子以及趨化因子等。白細胞介素是一類能雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的細胞因子家族，主要參與免疫細胞的分化和激活[19]，其中的IL-2、IL-1β、IL-6屬于促炎因子，IL-4和IL-10屬于抗炎細胞因子；腫瘤壞死因子是一種促炎因子，主要分為TNF-α和TNF-β兩種類型。在腸道黏膜內(nèi)促炎因子和抗炎因子的分泌平衡是其產(chǎn)生正確免疫應答的關鍵，腸道黏膜的免疫應答主要是通過改變細胞因子的分泌來介導的，因此腸道內(nèi)細胞因子的水平可反映腸道黏膜的免疫功能[20]。細胞因子的Meta 分析結果表明，動物腸道內(nèi)細胞因子的水平在健康和疾病狀態(tài)下存在明顯的區(qū)別。這與先前的一些研究結果一致，Gong等[21]研究發(fā)現(xiàn)，感染產(chǎn)氣莢膜梭菌導致壞死性腸炎的肉雞腸道內(nèi)IL-1β、IL-6 的水平顯著高于健康肉雞。感染沙門氏菌導致腸道炎癥的肉雞腸道內(nèi)IL-1β、IL-6的水平同樣顯著高于健康肉雞[22]。亞急性瘤胃酸中毒薩能奶山羊以及感染大腸桿菌導致腸道炎癥和腹瀉的仔豬腸道內(nèi)細胞因子的水平與健康動物之間也存在顯著差異[23-24]。因此，在評估動物腸道健康狀態(tài)時，需要關注腸道內(nèi)細胞因子的水平，尤其是促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和抗炎因子IL-10的水平。

3.3 免疫細胞與腸道健康

除sIgA和細胞因子外，腸道免疫細胞在維持腸道健康方面也發(fā)揮著重要的作用。腸道內(nèi)的免疫細胞約占機體總免疫細胞的70%，其中一些可選擇性接觸、攝取、運輸外部抗原，將抗原吞噬并轉運至抗原呈遞細胞從而被清除[25]，還有一些可以分化為不同的效應細胞，介導分泌不同的細胞因子，產(chǎn)生免疫應答，修復或重塑腸道黏膜免疫屏障[26]。執(zhí)行上述免疫功能的腸道免疫細胞主要包括腸上皮細胞（intestinal epi?thelial cell, IEC）、腸上皮淋巴細胞（intraepithelial lym?phocyte, IEL）、固有層內(nèi)淋巴細胞以及微褶細胞等。其中，IEC 是一層排列在腸上皮層表面的細胞，主要由上皮細胞、潘氏細胞、杯狀細胞以及神經(jīng)內(nèi)分泌細胞組成[27]，可對抗原、毒素、病原體和腸道微生物形成防御[28]。其中上皮細胞在吸收和分泌免疫球蛋白方面起著重要作用。潘氏細胞分泌的顆粒中包含多種抗菌肽（如α-防御素、溶菌酶、血管生成因子4等），其在腸道病原菌的刺激下可脫顆粒釋放抗菌肽至腸腔，阻止外源微生物入侵，發(fā)揮抗菌作用，同時參與腸道免疫反應[29]。杯狀細胞（goblet cell, GC）在抵抗病原微生物感染、保持上皮細胞完整性以及抗原呈遞和應答方面起著重要作用[30]，且腸道GC 數(shù)量的變化在一定程度上可以反映腸道局部的免疫狀況。

位于腸上皮細胞間及基底部的IEL 是最先接觸腸腔中外病原體的免疫細胞，同時也是最先發(fā)生免疫應答的免疫細胞[31]。研究表明，大多數(shù)的IEL 含有大量具有細胞毒性活性的細胞質顆粒，他們可以表達效應細胞因子（如IFN-γ、IL-2、IL-4或IL-17等）來參與黏膜免疫應答[32]。此外，IEL 可以針對那些對自然殺傷細胞不敏感的靶細胞發(fā)揮溶解細胞活性和免疫監(jiān)視功能[33]，還可以誘導和維持對食物性抗原的免疫耐受，減少過敏反應。IEL 可在抵御受損上皮細胞的同時促進上皮細胞新生，維護腸道結構[34]。IEL 越多表明機體對于防御病原體和毒素的入侵能力越強，因此腸道IEL 的數(shù)量可反映腸道免疫防御功能是否完善和小腸黏膜免疫屏障的完整程度。

位于腸道上皮下方的固有層內(nèi)包含著眾多的免疫細胞，包括T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、粒細胞等。數(shù)量繁多的免疫細胞群，構建了腸道黏膜免疫的堅固屏障。1927年Owen等[35]學者首次使用掃描電鏡觀察到淋巴小結表面有一種特殊的細胞，表面沒有致密的微絨毛，而是短小稀疏的皺褶，故稱之為微皺褶細胞，簡稱為M細胞。M細胞主要存在于派爾氏淋巴結、孤立淋巴小結等黏膜相關淋巴組織上皮層。它能夠捕獲抗原，并將捕獲的抗原傳遞給樹突狀細胞（dendritic cell，DC），而DC 進一步將抗原呈遞給T細胞，介導適應性的免疫應答。故可認為M細胞是發(fā)動黏膜免疫的“起始部位”[36]，腸道內(nèi)M細胞的數(shù)量同樣可以反映腸道黏膜的免疫功能。

綜上所述，腸道免疫細胞在抵抗病原體的入侵、介導免疫反應、維持宿主腸道健康方面發(fā)揮著重要作用。

3.4 腸道相關淋巴組織與腸道健康

腸道相關淋巴組織由3 個不同的淋巴組織實體組成，包括派爾氏淋巴結（peyer patch, PP）、孤立淋巴濾泡（isolated lymphoid follicle, ILF）和腸系膜淋巴結（mesenteric lymph node, MLN），他們共同構成了機體最大的淋巴器官[37]，此外禽類腸道內(nèi)還存在盲腸扁桃體和法氏囊等相關免疫組織。PP是位于腸道壁上的一個凸起的淋巴組織。根據(jù)其T細胞和B細胞的分布特點，可將其劃分為濾泡區(qū)、濾泡間區(qū)和上皮下圓頂區(qū)。濾泡區(qū)靠近漿膜面，主要由B 細胞組成，可以產(chǎn)生表面IgA，它是構成sIgA 的主要成分[38]。濾泡間區(qū)主要由T 細胞組成，占PP 內(nèi)細胞數(shù)量的35%左右，此區(qū)域還分布著淋巴細胞及進出淋巴組織的通道毛細血管后微靜脈，另外這個區(qū)域內(nèi)也有許多B細胞和漿細胞[39]。上皮下圓頂區(qū)是指PP 表面的濾泡相關上皮和濾泡之間的區(qū)域，此區(qū)內(nèi)既含有T 細胞、B 細胞，還含有一種特殊的抗原轉運細胞即M細胞[40]。此外，PP內(nèi)還含有各種豐富的免疫活性細胞，故被認為是機體主要免疫應答的誘導部位[41]。MLN 是一群分布在腸系膜內(nèi)的大淋巴結，可作為淋巴細胞進入血液的中間站，其組織學結構也屬于淋巴樣組織[42]。另外，MLN是腸道相關淋巴組織的重要位置，也是免疫應答發(fā)生的重要場所，參與淋巴細胞的歸巢和再循環(huán)。ILF 主要分布于腸系膜對側的腸壁中，其結構與PP相似，有研究發(fā)現(xiàn)，將試驗動物的PP 摘除后黏膜免疫的抗原處理過程沒有被顯著的影響，可能是因為ILF 中含有與PP 相似的細胞，能夠完成黏膜免疫的抗原呈遞[43]。此外，F(xiàn)enton 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，ILF 是生發(fā)中心B 細胞致敏區(qū)域，是腸道中區(qū)域化適應性免疫應答的起始區(qū)域。總而言之，腸道相關淋巴組織是腸道免疫應答重要器官，對于腸道健康的維持發(fā)揮重要作用。

3.5 本研究的局限性

在本研究中，通過Meta分析發(fā)現(xiàn)一些指標具有一定的異質性，異質性可能主要來源于各種動物的品種、生長階段、飼養(yǎng)環(huán)境和管理技術等方面，且無法通過一個分類進行亞組分析從而降低異質性。但異質性不影響最終結果的方向和意義[45]，試驗結果在低異質性的情況下依然符合預期。TNF-α在豬腸道中體現(xiàn)的低異質性也值得關注，這表明TNF-α水平作為評估腸道健康的指標得到了多篇文獻的支撐。另外，本研究也存在一定的局限性。由于不符合Meta分析的納入標準，因此未探討腸道相關淋巴組織和免疫細胞在動物健康和病理狀態(tài)下的變化趨勢。腸道相關淋巴組織和免疫細胞作為腸道黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，也會對最后評估動物消化道健康指標的確定產(chǎn)生一定的影響。

4 結論

Meta 分析結果表明，將動物腸道內(nèi)sIgA 的濃度和細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6、IFN-γ）的相對表達量作為評估動物消化道健康的生物指標具有科學性和可行性。除此之外，腸道免疫細胞的數(shù)量也可以反映動物消化道的健康狀態(tài)。