李嵐嵐，施玉萍，劉一賢，戴利銘，蔡志英

（云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪 666100）

炭疽病是橡膠樹上的重要病害，在世界各植膠區(qū)均有發(fā)生，廣泛分布于南美洲、非洲中部，亞洲南部和東南部等地。橡膠樹炭疽病危害膠苗、幼樹和開割膠樹，侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實等多個部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實腐爛等，嚴重時引起膠樹重復落葉，導致開割時間推遲，該病在西雙版納地區(qū)膠苗苗圃中每年均有不同程度的發(fā)生［1］。

目前，橡膠樹炭疽病的防治主要以化學藥劑結(jié)合農(nóng)業(yè)措施防治為主，農(nóng)業(yè)防治措施難以大面積推廣，且只能在短期內(nèi)局部控制病情的蔓延；化學農(nóng)藥的不科學使用容易造成防效下降及抗藥性等問題，也容易引起環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等危害［1］。

已報道的防治炭疽病的生防菌種類較多，放線菌是目前次生代謝產(chǎn)物源抗生素的主要來源，其種類繁多、活性物質(zhì)代謝功能各異。放線菌產(chǎn)生的抗生素被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［2-9］，在研發(fā)新型微生物農(nóng)藥領(lǐng)域具有極大的潛力。鏈霉菌是已知放線菌中最大的族群，四環(huán)素類、氨基糖甙類、頭孢類、大環(huán)內(nèi)脂類等多種類型的抗生素有70%～80%來源于鏈霉菌，其主要生物活性表現(xiàn)為抑菌活性［10］。

采用高效、環(huán)保、安全的綜合防治措施是當今社會發(fā)展的需求，而放線菌在研發(fā)新型微生物農(nóng)藥領(lǐng)域具有極大的潛力，研究放線菌的最優(yōu)生長培養(yǎng)基和最佳生長條件具有重要意義。本研究將對實驗室篩選獲得的強拮抗放線菌進行發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化，以活菌數(shù)和抑菌率為指標篩選最優(yōu)配比，為研制新型、環(huán)境友好型的生物殺菌劑提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

土壤放線菌：鏈霉菌（DL5C），自景洪市打洛農(nóng)場五分場橡膠園的土壤中分離得到，由所在實驗室提供。

橡膠病原菌：炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），從云南省熱帶作物科學研究所增殖苗圃的感病橡膠葉片上分離得到。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）［11］：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL。

高氏1號培養(yǎng)基［11］：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g，pH 7.5。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基［11］：麥麩70%、稻殼5%、米糠10%、CaCO30.3%、料水比1∶0.8，pH 7.5。

2 方法

2.1 活化菌株及種子液制備

在高氏1號培養(yǎng)基上將保存在甘油管里的菌種進行活化。將活化后的菌種接種到150 mL種子培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min振蕩培育5 d。

2.2 碳源、氮源篩選

碳源篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基（CK）的基礎(chǔ)上，分別添加10%的玉米粉、小米粉、蔗糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉作為供試碳源進行試驗，以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。每20 g干物質(zhì)加入16 mL水拌勻裝入500 mL三角瓶并編號，121℃，滅菌20 min，冷卻后按20%的接種量接入種子液，置于恒溫培養(yǎng)箱（溫度32℃，濕度70%）中培養(yǎng)，每天振蕩2次，培養(yǎng)7 d，取樣測定活菌量及抑菌圈大小，選出最佳碳源［14-15］。

氮源篩選：在初始發(fā)酵培養(yǎng)基（CK）的基礎(chǔ)上，固定碳源（最優(yōu)碳源）10%，分別添加5%的酵母粉、硫酸銨、黃豆粉、花生粉餅、硝酸鉀和蛋白胨作為供試氮源進行試驗，以不添加氮源作為對照。其他發(fā)酵條件與碳源試驗相同，培養(yǎng)7 d，取樣測定活菌量及抑菌圈大小，選出最佳氮源［11-12］。

2.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

確定最適的碳源和氮源后，運用L9（34）正交設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（表1）。以培養(yǎng)出的放線菌活菌量和培養(yǎng)物對病原菌的抑菌率為評價指標。

表1 L9（34）正交成份配比 %

2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 種子液接種量確定

取培養(yǎng)5 d的種子液，分別以10%、15%、20%、25%、30%的接種量接到優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d，測定固體發(fā)酵物中放線菌活菌量及抑菌圈大小。

2.4.2 料水比確定

分別以料水比0.8∶1、1∶1、1∶0.8配置固體培養(yǎng)基，以最佳接種量接入培養(yǎng)5 d的種子液，培養(yǎng)7 d，測定固體發(fā)酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.3 起始p H確定

按最佳料水比，分別以起始pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0配置固體培養(yǎng)基，以最佳接種量接入種子液，培養(yǎng)7 d，測定固體發(fā)酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.4 發(fā)酵溫度確定

將種子液以最佳接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，分別以28、32、36、40℃培育，培養(yǎng)7 d，測定固體發(fā)酵物活菌量及抑菌圈大小。

2.4.5 發(fā)酵終點確定

將種子液以最佳接種量接入優(yōu)化培養(yǎng)基中，最適溫度下靜置培養(yǎng)，從發(fā)酵第五天開始取樣，每24 h取樣1次，連續(xù)取樣10 d，測定固體發(fā)酵物活菌量及抑菌圈大小，培養(yǎng)14 d后結(jié)束采樣。

2.5 評價指標

2.5.1 放線菌量測定

平板菌落計數(shù)法：稱取1 g發(fā)酵固體菌劑，加入9 mL無菌生理鹽水充分搖勻，靜置，取上清液做梯度稀釋，取100μL稀釋樣液涂布到平板上，于32℃下培養(yǎng)5 d，測定固體發(fā)酵物活菌量。

2.5.2 抑菌率測定

稱取1 g發(fā)酵固體菌劑，加入9 mL無菌生理鹽水充分搖勻，靜置，12 000 rpm，離心20 min后，取上清1 mL與約55℃的滅菌PDA混合均勻制成平板，接入直徑為5 mm的炭疽菌餅，以不加發(fā)酵液的PDA平板為對照。5 d后測量菌落直徑，計算抑菌率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/（對照菌落生長直徑-菌餅直徑）×100%［13］。

3 結(jié)果與分析

3.1 碳源確定

如表2所示：玉米粉、小米粉、蔗糖、麥芽糖、果糖和可溶性淀粉等6種試劑為供試碳源時，以可溶性淀粉、小米粉、玉米為碳源，抑菌率不存在顯著性差異，不同碳源對放線菌活菌數(shù)量和抑菌率存在一定影響。從活菌數(shù)量來看，小米粉和可溶性淀粉與其他處理之間存在顯著差異；從抑菌率看，玉米、小米粉和可溶性淀粉與其他處理之間存在顯著差異?；罹鷶?shù)量上來看，以玉米為碳源，菌量數(shù)與小米和可溶性淀粉存在差異，但是從抑菌率來看以玉米為碳源與小米粉和可溶性淀粉差異不顯著。從節(jié)約成本的角度考慮，最終確定以玉米粉作為最佳碳源。

3.2 氮源確定

如表2所示：花生粉餅為氮源時，發(fā)酵物活菌量高于其他處理組，且存在顯著差異；所有處理組的抑菌率都比較高，以花生粉餅作為氮源，抑菌率與黃豆粉和蛋白胨存在差異，但是從菌量數(shù)來看，以花生粉餅為氮源與其他處理差異極顯著。并且考慮成本因素，花生粉餅的價格要低于黃豆粉和蛋白胨，所以最終確定以花生粉餅作為最佳氮源。

表2 不同碳源和氮源對放線菌的影響

3.3 放線菌菌株DL5C固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

運用L9（34）正交設(shè)計優(yōu)化固體發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如表3所示：不同因素的不同水平對放線菌的生長存在一定影響，正交試驗中，因素A和因素D從菌落生長量來看是A1和D2為優(yōu)勢配比，從抑菌率來看是A2和D1為優(yōu)勢配比，但是由于實驗室抑菌率的測定試驗是在一個相對狹小的封閉空間內(nèi)進行的，而實際運用中是在一個廣闊開放的空間，所以我們在保證抑菌率的基礎(chǔ)上選擇產(chǎn)菌量較多的處理為培養(yǎng)基的最優(yōu)配比，故以A1和D2為最優(yōu)配比；因素B和因素C從菌落生長量和抑菌率來看都是B1和C2為最優(yōu)配比；故最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為A1B1C2D2組合（麥麩50%、玉米粉8%、花生粉餅5%、米糠10%、稻殼26.7%、CaCO30.3%)。

表3 培養(yǎng)基不同成分配比對放線菌的影響

3.4 最佳接種量測定

如表4所示：菌種接種量對放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)影響較小，不同處理組之間活菌數(shù)和抑菌率均不存在顯著性差異，不同接種量對放線菌的生長和抑菌率影響不大，從生長量和抑菌率看，所有處理組都較高，當接種量為20%時，發(fā)酵物活菌量和抑菌率均高于其他處理組，并且能夠保證接入的菌種量能更均勻的分布在發(fā)酵培養(yǎng)基上，又不過于浪費。所以確定最佳接種量為20%。

表4 培養(yǎng)基不同接種量對放線菌的影響

3.5 最佳料水比測定

如表5所示：發(fā)酵培養(yǎng)基料水比對放線菌的發(fā)酵培養(yǎng)影響較小，不同處理組之間活菌數(shù)和抑菌率均不存在顯著性差異，所以不同料水比對放線菌的生長和抑菌活性影響不大。由于實驗室抑菌率的測定試驗是在一個相對狹小的封閉空間內(nèi)進行的，而實際運用中是在一個廣闊開放的空間，所以我們在保證抑菌率的基礎(chǔ)上選擇產(chǎn)菌量較多的處理的料水比作為最佳發(fā)酵條件，所以確定最佳料水比為1∶1。

3.6 最適p H測定

如表5所示：不同pH對放線菌的生長和抑菌率有一定影響，從生長量來看，不同處理組之間差異極顯著，處理1和處理2之間差異不顯著，但是與其他處理之間差異極顯著，產(chǎn)菌量顯著高于其他處理；從抑菌率看，所有處理組的抑菌率都比較高，處理1和處理2之間差異不顯著，與其他處理之間顯著差異。當發(fā)酵培養(yǎng)基pH為5時，發(fā)酵物活菌量和抑菌率均高于其他處理組，所以確定最適pH為5。

表5 培養(yǎng)基不同料水比和ph對放線菌的影響

3.7 最適溫度測定

如表6所示：不同發(fā)酵溫度對放線菌的生長和抑菌率有一定影響，從生長量和抑菌率來看，不同處理組之間差異極顯著，發(fā)酵溫度為32℃時，發(fā)酵物活菌量和抑菌率均高于其他處理組，所以確定32℃為最適發(fā)酵溫度。

3.8 發(fā)酵終點

如表6所示：不同發(fā)酵時間對放線菌的生長和抑菌率有一定影響，從生長量來看，不同處理組之間差異極顯著，發(fā)酵10 d時，與其他處理之間存在極顯著差異；從抑菌率來看，如表所示，發(fā)酵10 d和11 d時，與其他處理之間存在極顯著差異，但是發(fā)酵10 d和發(fā)酵11 d，抑菌率上沒有顯著差異，從節(jié)省時間的角度看，以10 d為最適發(fā)酵時間。

表6 不同發(fā)酵溫度和時間對放線菌的影響

4 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明：鏈霉菌DLSC最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為麥麩50%、玉米粉8%、花生粉餅5%、米糠10%、稻殼26.7%、CaCO30.3%，最佳接種量20%；最佳發(fā)酵條件：最佳料水比1∶1，最適pH5，最適溫度32℃，最佳發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵活菌數(shù)達到2.20×1010CFU/g，抑菌率為92.22%。

研究發(fā)現(xiàn)：把發(fā)酵物浸泡在無菌水中，浸泡一段時間后取上清液過2μm微孔濾膜，用得到的液體進行指示菌抗性實驗，發(fā)現(xiàn)濾去菌體的浸泡液對橡膠樹炭疽病病原菌基本沒有抑制作用，與張園園等人的研究結(jié)果不同，白刺鏈霉菌CT205固體發(fā)酵得到的無菌發(fā)酵產(chǎn)物對病原菌有抑制作用［11］。與實驗室液體發(fā)酵得到的結(jié)果也不相同，液體發(fā)酵試驗表明：液體發(fā)酵的無菌發(fā)酵液對橡膠樹炭疽病病原菌有抑制作用。由此推測出現(xiàn)這種情況可能存在原因有：1）固體發(fā)酵和液體發(fā)酵DL5C產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，固體發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對病原菌沒有抑制作用；2）固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的水溶性不同，固體發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能不溶于水；3）固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的量不同，固體發(fā)酵產(chǎn)生的具有抑菌活性的物質(zhì)的含量比較少，不足以對病原菌產(chǎn)生抑制作用。

本研究結(jié)果可為實驗室后續(xù)的研究提供參考：1）以實驗所得的發(fā)酵培養(yǎng)基為原料進行發(fā)酵培養(yǎng)，制成生物農(nóng)藥的粗成品，進行大田橡膠樹炭疽病防治試驗，評價該發(fā)酵產(chǎn)物是否有制成生物農(nóng)藥的價值；2）以實驗所得的發(fā)酵培養(yǎng)基為研究對象，研究DL5C發(fā)酵培養(yǎng)后的儲存穩(wěn)定性和儲存時間，為后續(xù)制作生物農(nóng)藥提供數(shù)據(jù)參考。