陳建福

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化工學(xué)院，福建 漳州 363000）

雞桑（MorusaustralisPoir）是桑科桑屬落葉灌木或小喬木，其耐寒、耐旱、抗風(fēng)，是我國野生桑樹的主要品種之一，在全國大部分省區(qū)均有分布［1-2］。雞桑是藥食兩用植物，其果實(shí)、葉、根、皮等皆可入藥，具有疏散風(fēng)熱、平肝明目、涼血、清肺潤燥等功用，可用于外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、頭痛、咳嗽、咽喉腫痛等癥狀［3-4］。雞桑葉中含有大量氨基酸、黃酮、多糖、維生素和生物堿等天然有效成份［5］，其中黃酮是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗抑郁、抗氧化和抗衰老等多種生理活性功能［6-7］，但目前國內(nèi)外對雞桑葉相關(guān)有效成分的提取與應(yīng)用還比較少，其經(jīng)濟(jì)價值還需進(jìn)一步去挖掘。本研究以雞桑葉為原料，先對影響雞桑葉總黃酮提取率的工藝因素進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，再利用Box-Behnken設(shè)計對提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，最后評價了雞桑葉總黃酮的抗氧化活性，為雞桑葉總黃酮的提取與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 原料與試劑

雞桑葉采自福建省漳州市薌城區(qū)芝山公園，經(jīng)漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝專業(yè)王水琦教授鑒定為?？粕僦参镫u桑（Morus australisPoir）；乙醇，食品級，河南鑫河陽酒精有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，UV≥98%，上海金穗生物科技有限公司；其它所使用的化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-1100型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ-100TDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

配制成一定濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，后按文獻(xiàn)方法［8］，利用紫外可見分光光度計測定溶液在510 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線擬合得回歸方程y=9.930 7x-0.005 5，

1.3.2 雞桑葉總黃酮的測定

用移液槍吸取一定量的提取液，按照1.2.1方法進(jìn)行測試得吸光度，計算得總黃酮濃度，按下式換算為總黃酮提取率。

式中：b（mg/L）為總黃酮濃度；V（L）為提取液體積；m（g）為雞桑葉的質(zhì)量。

1.3.3 雞桑葉總黃酮的提取工藝

用蒸餾水將采摘的新鮮雞桑葉洗凈，取出于陽光下晾干，后置于50℃鼓風(fēng)干燥箱干燥，粉碎備用。稱取1 g雞桑葉于圓底燒瓶中，加入乙醇并裝上冷凝管，后置于按照所考察的工藝參數(shù)設(shè)定的超聲波清洗器上進(jìn)行回流，提取結(jié)束后，將提取物進(jìn)行過濾與濃縮后于容量瓶中定容，計算總黃酮的提取率。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計

單因素考察在固定其它工藝條件（其中乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間分別為70%、20mL/g、70℃和25 min）不變的情況下，分別考察乙醇濃度（60%、65%、70%、75%、80%、85%）、液料比（10、15、20、25、30、35 mL/g）、超聲溫度（40、50、60、70、80、90℃）和超聲時間（10、15、20、25、30、35 min）對雞桑葉總黃酮提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計

在對單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析后，進(jìn)一步對所考察的四個因素進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計，各因素與編碼水平見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計Tab.1 Experimental design of Box-Behnken

1.3.6 雞桑葉總黃酮的抗氧化能力

按文獻(xiàn)方法［9］對DPPH·和·OH的清除效果進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度的影響

從圖1中可知，在所考察的乙醇濃度范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時，雞桑葉總黃酮提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)橐掖紳舛容^低時，含水量高，溶劑極性大，無法溶出太多極性較小的黃酮類物質(zhì)。但乙醇濃度太高時，溶劑極性過小，雞桑葉顆粒中極性較小的脂溶性雜質(zhì)也一并溶出，并參與總黃酮的溶出競爭［10］，降低了總黃酮的提取率。因此乙醇濃度選擇為70%。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 液料比的影響

從圖2中可知，在所考察的液料比范圍內(nèi)，當(dāng)液料比達(dá)到20 mL/g時，雞桑葉總黃酮提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)橐毫媳容^小時，溶劑無法完全浸潤雞桑葉顆粒，顆粒內(nèi)的總黃酮溶出有限，但液料比過大時，會增加濃縮過程總黃酮的損失［11］，降低了總黃酮的提取率。因此液料比選擇為20 mL/g。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.3 超聲溫度的影響

從圖3中可知，在所考察的超聲溫度范圍內(nèi)，當(dāng)超聲溫度達(dá)到70℃時，雞桑葉總黃酮提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)槌暅囟容^小時，溶劑的分子熱運(yùn)動較小，溶劑與雞桑葉顆粒內(nèi)物質(zhì)的接觸與交換頻率較低，溶出的總黃酮較少，但超聲溫度過高時，部分耐熱性較差的黃酮類物質(zhì)會氧化或降解［12］，降低了總黃酮的提取率。因此超聲溫度選擇為70℃。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids

2.1.4 超聲時間的影響

從圖4中可知，在所考察的超聲時間范圍內(nèi)，當(dāng)超聲時間達(dá)到25 min時，雞桑葉總黃酮提取率達(dá)到最大，這是因?yàn)槌晻r間較短時，溶劑與雞桑葉顆粒作用時間較短，內(nèi)部的黃酮類物質(zhì)還尚未完全溶出，但超聲時間過長時，超聲波長時間的空化與熱作用導(dǎo)致了部分穩(wěn)定性較差的黃酮類物質(zhì)的降解［13］，降低了總黃酮的提取率。因此超聲時間選擇為25 min。

圖4 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型及方差分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件，以總黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，確定以乙醇濃度（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）4個因素為總黃酮提取率的影響因素，并設(shè)計響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果及方差分析分別見表2-3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.2 Response surface experiment and results

利用Design-Expert 8.05b軟件對響應(yīng)面設(shè)計的29個實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到雞桑葉總黃酮提取率（Y）與所考察工藝的二次多項(xiàng)式回歸模型為：

由Design-Expert 8.05b軟件計算確定的回歸模型方差分析表（表3）中可知P<0.000 1，表明該回歸模型極顯著；回歸模型的決定系數(shù)R2=0.938 8，表明該回歸模型具有較好的擬合度，有超過93.88%實(shí)驗(yàn)真實(shí)值可以利用該回歸模型來描述；失擬度P=0.067 8>0.05，不顯著，表明該提取工藝回歸模型的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值具有較好的擬合度，實(shí)驗(yàn)誤差??；根據(jù)F值及P值可以得到所考察的工藝條件對雞桑葉總黃酮提取率的影響順序?yàn)椋篊超聲溫度>A乙醇濃度>D超聲時間>B液料比。其中對雞桑葉總黃酮影響極顯著（P<0.01）的有乙醇濃度的一次項(xiàng)A、超聲溫度的一次項(xiàng)C，乙醇濃度的二次項(xiàng)A2、液料比的二次項(xiàng)B2、超聲溫度的二次項(xiàng)C2、超聲時間的二次項(xiàng)D2；對雞桑葉總黃酮影響不顯著（P>0.05）的有液料比的一次項(xiàng)B、超聲時間的一次項(xiàng)D，乙醇濃度和液料比的二次交互項(xiàng)AB、乙醇濃度和超聲溫度的二次交互項(xiàng)AC、乙醇濃度和超聲時間的二次交互項(xiàng)AD、液料比和超聲溫度的二次交互項(xiàng)BC、液料比和超聲時間的二次交互項(xiàng)BD、超聲溫度和超聲時間的二次交互項(xiàng)CD，說明乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間之間的一次性、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系。綜上分析，該回歸模型具有較高的擬合度和較小的誤差，準(zhǔn)確率高，可以用于雞桑葉總黃酮提取工藝的分析與預(yù)測。

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖的坡度和等高線的密集程度可以直觀地分析所考察的乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間工藝間的交互作用對響應(yīng)值的影響情況。通過對圖5中響應(yīng)面和等高線圖的比較，可以看出乙醇濃度和超聲溫度的交互作用的響應(yīng)面圖坡度最為陡，等高線分布線最為密集，說明所考察的因素中對雞桑葉總黃酮提取率的影響最為顯著的是乙醇濃度和超聲溫度的交互作用，而超聲溫度和超聲時間交互作用的響應(yīng)面曲線坡度陡峭程度次之，等高線疏密程度也次之，說明所考察的因素中對雞桑葉總黃酮提取率的影響程度次之的為超聲溫度和超聲時間的交互作用，同理，可得所考察的乙醇濃度、液料比、超聲溫度和超聲時間之間的交互作用對雞桑葉總黃酮提取率的影響順序?yàn)锳C>CD>BD>AB>BC>AD。

圖5 各工藝因素交互作用對總黃酮提取率的影響Fig.5 Interaction effect of various factors on the extraction yield of total flavonoids

2.2.3 最優(yōu)驗(yàn)證

根據(jù)表2的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并利用Design Ex?pert 8.0.5b軟件進(jìn)行分析，確定雞桑葉總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度72.81%，液料比20.86 mL/g，超聲溫度63.11℃和超聲時間24.65 min，此時通過軟件計算的雞桑葉總黃酮提取率的預(yù)測值為37.73 mg/g，由于理論預(yù)測值的操作工藝設(shè)置較為繁瑣，將工藝條件修正為乙醇濃度73%，液料比21 mL/g，超聲溫度63℃和超聲時間25 min。根據(jù)修正后的工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行平均，得到雞桑葉總黃酮的提取率為37.08 mg/g，其與理論值相對誤差為1.72%，說明該二次回歸模型擬合度好，誤差小，可靠性強(qiáng)，適用于雞桑葉總黃酮超聲輔助提取工藝的優(yōu)化。

2.3 雞桑葉總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 雞桑葉總黃酮對DPPH·的清除效果

如圖6所示，在所考察的濃度范圍內(nèi)，DPPH·清除能力隨著維生素C和雞桑葉總黃酮濃度的增加而增大，清除率與濃度存在量效關(guān)系，經(jīng)計算得到維生素C和雞桑葉總黃酮對DPPH·清除的IC50分別為49.57 mg/L和60.51 mg/L，說明雞桑葉總黃酮具有清除DPPH·的能力，且對DPPH·的清除能力要強(qiáng)于李瑞雪等［14］研究的屏邊雞桑。

圖6 維生素C和總黃酮對DPPH·的清除效果Fig.6 Scavenging effect of vitamin Cand total flavonoids on DPPH·

2.3.2 雞桑葉總黃酮對·OH的清除作用

如圖7所示，在所考察的濃度范圍內(nèi)，·OH清除能力均隨著維生素C和雞桑葉總黃酮濃度的增加而增大，清除率與濃度存在量效關(guān)系，經(jīng)計算得到維生素C和雞桑葉總黃酮對·OH清除的IC50分別為94.96 mg/L和156.05 mg/L，說明雞桑葉總黃酮具有清除·OH的能力，且對·OH的清除能力要強(qiáng)于張月等［15］研究的桑葉，雞桑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力，是一種潛在的天然抗氧化劑。

圖7 維生素C和總黃酮對·OH的清除效果Fig.7 Scavenging effect of vitamin Cand total flavonoids on·OH

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計得到雞桑葉總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇濃度73%，液料比21 mL/g，超聲溫度63℃和超聲時間25 min，得到雞桑葉總黃酮的提取率為37.08 mg/g，其與理論值相對誤差為1.72%，說明該二次回歸模型擬合度好，誤差小，可靠性強(qiáng)?？疾炝穗u桑葉總黃酮對DPPH·和·OH的清除效果，結(jié)果表明雞桑葉總黃酮對DPPH·和·OH均有一定的清除效果，且清除效果與濃度存在量效關(guān)系，其對DPPH·和·OH的清除效果的IC50分別為60.51 mg/L和156.05 mg/L，說明雞桑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力，是一種潛在的天然抗氧化劑，為雞桑葉資源的開發(fā)與利用提供了基礎(chǔ)理論與參考。