周新崇，易燦，劉進兵

(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院,湖南 邵陽,422000)

邵陽市新寧縣崀山片區(qū)是湖南省臍橙的重要產(chǎn)區(qū)。自20世紀70年代大力推廣種植臍橙以來[1]，已經(jīng)成為全國較大的臍橙生產(chǎn)區(qū)，是當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的支柱性產(chǎn)業(yè)[2]。臍橙皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)[3]，具有抗氧化、抗炎癥、降血壓、抗突變等作用[4]。目前，橘皮黃酮提取的主要方法有微波提取[5-6]、超聲提取[7-8]、微切輔助提取[9]。本試驗采用響應(yīng)面法對崀山臍橙皮總黃酮的微波提取工藝進行了優(yōu)化，并進行了抗氧化活性測定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

崀山臍橙皮粉 (采摘自湖南省邵陽市新寧縣白沙鎮(zhèn)白沙園藝場12月成熟期的崀山臍橙果，取其果皮在 60℃ 恒溫干燥至恒重，粉碎過孔徑為0.25 mm的篩)；蘆丁對照品(純度98%)(中國食品藥品檢定研究院)；Al(NO3)3(分析純) 和 NaNO3(分析純) (天津博迪化工有限公司)；氫氧化鈉(分析純)(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；無水乙醇(分析純)(重慶萬盛川東化工有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1AB烘箱(天津市泰斯儀器有限公司)；SF-130型高速中藥粉碎機(中南制藥機械廠)；ME203E型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器、SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵(鞏義市中天儀器科技有限公司)；SB-5200DT 超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(島津(上海)實驗器材有限公司)。

2 試驗方法

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

標準曲線繪制參考文獻[10-11]。精密稱取干燥蘆丁標準品5.0 mg，燒杯溶解后置于50 mL的容量瓶中，用體積分數(shù) 70% 乙醇溶液定容，搖勻，既得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的蘆丁標準溶液，室溫避光保存。再從其中準確分別吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL置于10 mL比色管中；滴加0.30 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置3 min；再滴加0.30 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6 min充分反應(yīng)；最后滴加2.00 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用體積分數(shù)70%乙醇定容至10 mL，靜置15 min；用紫外可見分光光度計測定在510 nm下的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL) 為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線。

2.2 崀山臍橙皮總黃酮提取及含量測定

準確稱取崀山臍橙皮粉0.50 g，放入三口燒瓶中，加入一定體積、一定濃度的乙醇溶液，放入微波化學(xué)反應(yīng)器中，在一定的功率和溫度條件下，微波提取一定時間，抽濾，用體積分數(shù) 70%的乙醇溶液洗滌濾渣3次，取濾液定容到50 mL容量瓶中。用移液槍準確移取5 mL待測液于10 mL比色管中，按照2.1節(jié)中標準曲線的繪制方法測定在510 nm波長下的吸光度(A),按照公式(1)計算崀山臍橙皮中黃酮提取量Y(mg/ g)[10]:

(1)

2.3 單因素試驗

單因素實驗參考文獻[6]。稱取崀山臍橙皮粉 0.50 g，在乙醇體積分數(shù) 70% 、料液比1∶20 g/mL、溫度 60 ℃、微波功率為 480 W 的條件下，提取時間為4 min，分別考察提取次數(shù)(1，2，3，4和5次)的影響，時間間隔為10 min，通過計算黃酮提取量，選擇合適的提取次數(shù)。

再分別考察提取時間(2，3，4，5和6 min)；提取溫度(40，50，60，70和80 ℃)；微波功率(320，400，480，560和640 W)；乙醇體積分數(shù)(50% ，60%，70%，80%和90%)以及料液比(1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL)對黃酮提取量的影響。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計方案

參照陳源等[12-13]的方法。在單因素的試驗基礎(chǔ)上，選取提取時間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分數(shù)(C)和料液比(D)為影響因素，以黃酮的提取量作為響應(yīng)值，利用 Design Expert 12.0 軟件，根據(jù) Box-Behnken 試驗原理，設(shè)計四因素三水平實驗方案，通過試驗及數(shù)據(jù)分析，進一步得出微波輔助法提取崀山臍橙皮中總黃酮的最優(yōu)工藝條件。試驗設(shè)計見表 1。

表1 Box-Benhnken 設(shè)計試驗因素水平及編碼Table 1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

2.5 崀山臍橙皮黃酮抗氧化活性的測定

崀山臍橙皮中總黃酮提取物對DPPH·清除能力的測定和ABTS+·清除能力的測定參照田建華等[11,14]的方法進行。

3 結(jié)果與討論

3.1 蘆丁標準曲線及回歸方程

如圖1所示，對標準曲線進行擬合，得線性回歸方程：y=7.500 09x+0.004 040 93，R2=0.999 19。結(jié)果表明：在 0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度之間線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

3.2 單因素試驗結(jié)果

由圖2(a)可知：崀山臍橙皮中黃酮提取量隨著提取次數(shù)增多，先呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，在提取到第3次后增加緩慢。考慮到時間和能源消耗，因此，微波提取的次數(shù)選擇為3次。由圖2(b)可知：黃酮提取量在2～4 min之間不斷增加，在4 min達到最大值，超過4 min后提取量不斷減少，可能是時間越長，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)發(fā)生氧化降解[15]，使其含量下降。由圖2(c)可知：改變提取溫度對崀山臍橙皮黃酮提取量的影響不顯著，在60 ℃ 時達到最大值。由圖2(d)可知：當微波功率在480 W時黃酮提取量達到最大值，超過480 W黃酮提取量不斷減少，可能原因是微波功率增大，破壞了黃酮提取物有效成分的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致含量降低。由圖2(e)可知：崀山臍橙皮黃酮提取量先隨著乙醇體積分數(shù)增大先增加，在乙醇體積分數(shù)為 70% 時達到最大值，隨后不斷減小。可能是乙醇體積分數(shù)較小時，不能完全溶解黃酮類物質(zhì)；當體積分數(shù)過大時，醇溶性的色素[16]及親脂性強的成分溶出，在溶液中競爭同乙醇-水分子結(jié)合，降低了黃酮活性成分與乙醇-水分子的結(jié)合，降低了黃酮提取量。由圖2(f)可知：崀山臍橙皮黃酮提取量隨著料液比增大而增加，料液比在 1∶40 g/mL 時達到最大值?？赡苁请S著料液比增大，溶劑的用量增加到一定程度后，黃酮活性成分基本溶出[17]，繼續(xù)增大料液比會使非黃酮類其他醇溶性雜質(zhì)析出，與活性成分共同競爭而導(dǎo)致含量下降[18]。

圖2 崀山臍橙皮黃酮提取量的單因素實驗Fig.2 Single factor experiment on extraction of flavonoids from Langshan navel orange peel

3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗及方差分析

3.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果與方差顯著性分析

由單因素試驗結(jié)果，采用Box-Benhnken 響應(yīng)面試驗原理，選取了提取時間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分數(shù)(C)和料液比(D)對提取量變化大的影響因素，以崀山臍橙皮總黃酮提取量為響應(yīng)值，設(shè)計了四因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

用 Design Expert 12.0 軟件，對表 2 中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到表 3 的回歸方程方差分析表；利用軟件對數(shù)據(jù)進行非線性回歸的二次多項式擬合，獲得崀山臍橙皮黃酮提取量對提取時間(A)、微波功率(B)、乙醇體積分數(shù)(C)和料液比(D)的二次多元回歸預(yù)測模型為：黃酮提取量Y= 2.93+0.081 7A+0.107 5B+0.280 0C-0.072 5D-0.160 0AB-0.015 0AC+0.005 0AD-0.070 0BC+0.152 5BD+0.105 0CD-0.251 2A2-0.220 0B2-0.243 8C2-0.197 5D2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知：對該模型進行顯著性分析，F(xiàn)回歸值=25.69，P<0.000 1，說明該回歸模型顯著，即各因素提取時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)、料液比與黃酮提取量之間的線性關(guān)系顯著，試驗?zāi)Ｐ涂煽?；F失擬值=1.28，P=0.4362>0.05，說明失擬不顯著，該試驗有良好的穩(wěn)定性，試驗誤差較小，該模型對試驗擬合較好[11]。能夠用來分析和預(yù)測微波輔助提取崀山臍橙皮總黃酮的最優(yōu)工藝條件。

根據(jù)表 3 的P值可知:C,A2,B2,C2,D2的偏回歸系數(shù)差異極度顯著，說明乙醇體積分數(shù)對黃酮的提取量有極度顯著的影響。A,B,D,AB,BD的偏回歸系數(shù)差異高度顯著，說明提取時間、微波功率、料液比對黃酮提取量有高度顯著的影響，CD的偏回歸系數(shù)差異顯著，說明因素之間有交互影響，對響應(yīng)值有非簡單的線性關(guān)系。

表3 響應(yīng)面試驗方差分析表Table 3 Analyses of variance for the fitted regression model

根據(jù)表3的F值可知:單因素對崀山臍橙皮黃酮提取量的影響主次順序為：乙醇體積分數(shù)、微波功率、提取時間和料液比。

3.3.2 響應(yīng)面各因素間的交互作用分析

提取時間、微波功率、乙醇體積分數(shù)和料液比交互作用對崀山臍橙黃酮提取量的響應(yīng)面圖見圖3，由圖3(a)、3(f)可以看出：等高線呈橢圓形，且從表3中看出：AB，BD的P值為差異高度顯著，說明提取時間與微波功率、微波功率與料液比之間的交互作用對黃酮提取量的影響較大。圖3(e)可以看出：等高線呈微橢圓形，且表3中方差分析CD的P值差異顯著，說明乙醇體積分數(shù)與料液比的交互作用對黃酮提取量的影響次之；其他的圖3(b)、圖3(c)、圖3(d)的等高線近圓形，坡度相對平緩，說明提取時間與乙醇濃度、提取時間與料液比、微波功率與乙醇濃度間的交互作用對崀山臍橙皮中黃酮提取量的影響較小。

3.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化的驗證

采用 Design Expert 12.0 軟件，分析得到崀山臍橙皮黃酮提取量的理論最佳值為3.02 mg/g，其對應(yīng)的最佳提取工藝條件如下：提取時間為4.11 min、微波功率為489.68 W，乙醇體積分數(shù)為 75.56 %、料液比為1∶40.13 g/mL；考慮到試驗操作的可行性，將最佳條件調(diào)整如下：提取時間為4 min、微波功率為480 W，乙醇體積分數(shù)為75%、料液比為1∶40 g/mL。在此條件下進行3次重復(fù)性試驗，得到崀山臍橙皮黃酮提取量分別為2.93，2.96和2.98 mg/g，平均值為2.96 mg/g，與理論值相對誤差為1.99%，說明該工藝優(yōu)化得到的模型工藝參數(shù)是可靠穩(wěn)定的。與王曉君等[6]的微波輔助復(fù)合酶法提取對比，酶的參與能進一步提高臍橙皮提取的黃酮含量。

3.4 崀山臍橙皮總黃酮提取物的抗氧化活性

崀山臍橙皮總黃酮提取物的DPPH·清除能力見圖4(a)。在 0～200 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增加，對 DPPH·的清除能力快速增加。與陽性對照VC相比活性稍差，VC的IC50為34.253 mg/L ，提取物黃酮IC50為133.856 mg/L。崀山臍橙皮總黃酮提取物對ABTS+·清除能力的測定見圖4(b),清除能力和陽性對照VC相當，VC的IC50為41.384 mg/L，崀山臍橙皮總黃酮提取物IC50為44.077 mg/L。

圖4 崀山臍橙皮總黃酮提取物的抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of total flavonoids extract from Langshan navel orange peel

4 結(jié)論

本研究對微波法提取崀山臍橙皮總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化。通過響應(yīng)面優(yōu)化其工藝條件，確定了微波提取崀山臍橙皮總黃酮的最優(yōu)工藝條件如下：提取時間為4 min、微波功率為480 W，乙醇體積分數(shù)為75%、料液比為1∶40 g/mL，在此條件下驗證試驗得到的黃酮提取量為2.96 mg/g，提取工藝條件條件溫和、方法簡單，具有一定的抗氧化活性。