孔麗蕊，何大海，周朝瓊，李鴻釧，吳風，羅建偉，張艷

(四川省成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都，611730)

腎臟疾病的發(fā)病率和病死率與腎損傷程度密切相關，而腎功能測量指標在腎臟疾病的診斷、監(jiān)測以及治療方面起重要作用，常用于評估腎臟疾病的風險或監(jiān)測腎損傷患者的損傷程度。生物標志物的生物學變異數(shù)據(jù)是臨床醫(yī)生判斷患者健康與否以及疾病診斷、治療、預后的重要依據(jù)。目前國內(nèi)外對腎損傷血清標志物生物學變異研究尚不全面，主要為疾病狀態(tài)下日間生物學變異[1-3]，尚沒有對健康群體短期內(nèi)生物學變異進行規(guī)范化、標準化的研究報道。本研究對31名健康志愿者采用新一代的分析方法測定24 h內(nèi)s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL的水平，并對腎損傷血清標志物24 h內(nèi)的短期生物學變異數(shù)據(jù)進行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

樣本來源于成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院2019年3月至11月31名健康志愿受試者，其中，男性17名(中位年齡30歲，范圍21～54歲)，女性14名(中位年齡33歲，范圍18～48歲)。身高、體重、血壓、心率、男女性別等構成比差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

納入標準：無慢性糖尿病、高血壓、甲狀腺腫、心腦血管等疾病，無用藥史，有穩(wěn)定的生活。所有參與者均完成問卷調(diào)查，以驗證其健康狀況并收集有關生活方式的信息，并進行相關體檢測試，以確保滿足所有納入標準[4]。對符合條件的受試者，保持采血當日正常的飲食(8：00，12：00，19：00)和正常的休息。研究方案經(jīng)成都市郫都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準，并獲得每位參與者的書面知情同意。

1.2 方法

以4 h為時間點間隔(0，4，8，12，16，20 h)，24 h內(nèi)標準化采集6份血液樣本。樣本收集歷時9個月(2019年3月至11月)。血液采集后室溫放置30 min，待全血樣本自然析出血清后，5 000 r/min離心10 min，血清移入Eppend 管，保存于-70 ℃冰箱中待檢。

所有標本在室溫下解凍，采用四川省邁克實業(yè)有限公司提供的試劑在日立7180全自動生化分析儀上統(tǒng)一測定。檢測前對分析儀按照制造商說明進行校準，參與者的所有樣品均進行2次測定。s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL采用膠乳免疫比濁法測定。s-CREA采用特異性高的肌氨酸氧化酶法測定，方法測量值可以溯源到肌酐測定的最高標準ID-MS方法，測定性能可以滿足臨床要求。內(nèi)部質(zhì)量控制使用2個水平的質(zhì)控品，CREA批號為48811/45813，由美國伯樂公司提供；β2MG，Cys C批號為68912，NGAL批號為0619021，由四川省邁克實業(yè)有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學分析

用student-t檢驗對男女組平均值的差異進行檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。用Shapiro-Wilk試驗驗證測試數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，采用Dixon WJ準則處理數(shù)據(jù)離群值，采用Mann-WhitneyU檢驗對研究變量的性別相關差異進行統(tǒng)計學分析。CVA為同一分析批中重復測定數(shù)據(jù)獲得，CVI和CVG采用具有95%置信區(qū)間的嵌套方差分析進行計算，個體指數(shù)(II)和參考變化值(RCV)的計算公式為

II=CVI/CVG。

2 結果

2.1 腎損傷血清標志物的變化

31名受試者均完成了24 h內(nèi)6次樣本收集，共186份血液樣本。經(jīng)重復測量后，有372個結果可分析。如方法部分所述，對每個分析物分別進行離群值檢測，其中28號s-β2MG被排除在外。腎損傷血清標志物24 h內(nèi)濃度呈偏態(tài)分布，血清標志物濃度變化見圖1。

圖1 不同性別的腎損傷血清標志物水平分布Fig.1 Distribution of levels of kidney injury biomarkers in men and women

2.2 不同采集時間點、不同性別腎損傷血清標志物水平比較

24 h內(nèi)不同采集時間點(0，4，8，12，16，20 h)、不同性別間腎損傷血清標志物s-CREA,s-β2MG,s-Cys C，s-NGAL水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 不同采集時間點的腎損傷血清標志物水平Table 1 Levels of kidney injury markers detected at different collection time points

2.3 24 h內(nèi)腎損傷血清標志物水平與性別的關系

24 h內(nèi)腎損傷血清標志物水平與性別進行比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 不同性別24 h內(nèi)腎損傷血清標志物水平比較Table 2 Comparison of the concentration levels of kidney injury biomarkers within 24 h between the

2.4 腎損傷標志物的BV，RCV和II

腎損傷血清標志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和II，男女之間表現(xiàn)出個體差異。見表3。

表3 24 h內(nèi)腎損傷血清標志物的Mean，CVA，CVI，CVG，RCV和IITable 3 Mean，CVA，CVI，CVG，RCV and II with 95% confidence intervals of the kidney injury biomarkers within 24 h

2.5 CVI，CVG估計值比較

本研究CVI，CVG高于EFLM和歷史生物學變異數(shù)據(jù)庫中報告的CVI，CVG估計值，見表4。

表4 生物學變異CVI，CVG估計值比較Table 4 Comparison of the CVI and CVG estimates of the biological variants

3 討論

生物學變異數(shù)據(jù)的廣泛應用，對測定血清標志物的穩(wěn)態(tài)性和質(zhì)量提出了較高的要求。歐洲臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)合會(European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,EFLM)對血清標志物不同研究組的生物學變異估計值進行薈萃分析，并不斷完善生物學變異數(shù)據(jù)關鍵評價清單(biological variation data critical appraisal checklist，BIVAC)[5]，建立了人體生物標志物的生物學變異數(shù)據(jù)庫，用于解釋臨床試驗結果和定義分析性能規(guī)范(analytical performance specifications，APS)[6-7]。本研究采用EFLM標準和最新檢測方法對受試者進行篩查分析。

本研究發(fā)現(xiàn)受試者腎損傷血清標志物24 h內(nèi)濃度呈偏態(tài)分布，不同采樣時間點間腎損傷血清標志物水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而男性和女性的水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。CVA由實驗室重復測定數(shù)據(jù)獲得，消除了批間分析變異，且確保分析變異的基質(zhì)穩(wěn)定。除s-Cys C 外，s-CREA，s-β2MG，s-NGAL的 CVA明顯小于1/2 CVI，說明日立7180生化分析儀測定方法分析變異較小，計算的RCV對連續(xù)結果的監(jiān)測是可靠的。而s-Cys C的CVA>1/2CVI，將增加RCV的假陽性結果，后期判讀結果時需特別注意。

31名受試者24 h內(nèi)腎損傷血清標志物的CVI穩(wěn)定在5%～10%，無性別方面的差異，表明機體代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)，可能與血清樣本濃度源自產(chǎn)生和清除之間的平衡有關。JONKER等[8]曾報道血清肌酐采樣間隔之間CVI無明顯差異。本研究4種血清標志物生物學變異數(shù)據(jù)CVI，CVG均高于網(wǎng)站公布數(shù)據(jù)[9]。s-CREA受腎小管分泌、肌肉質(zhì)量、年齡與性別的影響，同時，本研究采用標準化的酶法進行CREA水平測定，s-CREA結果較堿性苦味酸法測定結果普遍降低，可能會導致生物學變異數(shù)據(jù)在理論上高于標準化前研究報告的生物學變異估計數(shù)據(jù)。s-β2MG，s-Cys C采用免疫比濁法進行測定，除地域環(huán)境影響外，方法學是否影響CVI，CVG還有待進一步研究。s-CREA，s-β2MG，s-Cys C的CVG>CVI，對檢測結果進行判讀時，需要進行針對性別的CVG估算。NGAL是近年來發(fā)現(xiàn)的早期診斷腎損傷的新型生物學標志物，具有早期、快速、特異性高、敏感性高、受其他因素影響少的優(yōu)點，引起了人們的廣泛關注，被認為是“腎臟的肌鈣蛋白”，可以預測慢性腎臟病的進展，獨立于其他潛在的危險因素[10-11]。本研究中s-NGAL 的CVI和CVG分別為11.64%(10.44%～13.16%)和22.20%(17.74%～29.68%)。

個體變異性及參考值的關系可以用II表示，II=CVI/ CVG。當II>1.4時,表示該檢驗項目個體專一性低，個體間變異小于個體本身變異，任何微小的生理狀態(tài)變動就會造成指標超過參考值范圍，適用于人群篩檢。當II<0.6時,表示該檢驗指標個體專一性高，個體間變異大于個體本身變異，參考區(qū)間的參考價值有限，患者可能已經(jīng)為異常結果卻還落在正常參考值范圍之內(nèi)。本研究的所有檢測指標II均<0.6，提示腎功能指標的個體特異性較高，個體檢測值的分布只出現(xiàn)在區(qū)間范圍的一小部分，運用生物學變異來進行結果評價較為合適。所以，醫(yī)生在運用傳統(tǒng)參考區(qū)間來解釋腎功能結果時，還應該考慮到個體內(nèi)結果的波動，當個體因疾病發(fā)生了變化，其結果在數(shù)值上的差異應該大于2次測定結果的固有變異值RCV。

由于2個檢驗結果中存在生物學變異和分析變異，其結果之間的數(shù)值差值為固有變化值之和，稱為RCV[6,12-13]。在評估檢測結果的變化時，當連續(xù)檢測結果之間的差異超過RCV時，即使結果仍在參考區(qū)間內(nèi)，結果的變化仍具有臨床意義。本研究血清樣本II<0.6，經(jīng)典參考值不適用于評估它們的結果，應選擇RCV進行結果判讀。如s-CREA首次檢測為60.4 μmol/L，第2次檢測為110.4 μmol/L，根據(jù)傳統(tǒng)參考區(qū)間判斷，患者結果都在參考區(qū)間內(nèi)，實際血清水平增加了50 μmol/L(RCV為21.88%)，腎功能可能出現(xiàn)了問題。如果兩次檢測結果比較小于本實驗室的RCV值，即使超出參考值范圍，都不必立即確定該結果異常，建議數(shù)天后復查。為每個患者定義一個獨特的個性化參考區(qū)間[14]以指導其臨床治療，被證明既繁瑣又昂貴，所以，通過前后結果差異是否大于RCV來判斷可能更適合。本研究血清s-CREA,s-β2MG,s-Cys C,s-NGAL的RCV分別為21.88%，29.31%，5.32%，33.09%。

總之，本研究為腎損傷血清標志物s-CREA，s-β2MG，s-Cys C，s-NGAL提供了健康人群24 h內(nèi)的生物變異數(shù)據(jù)。CVG>CVI，個體指數(shù)II<0.6，腎損傷血清標志物根據(jù)RCV進行臨床決策更有臨床應用價值。