楊恒 錢彪 鄭麗英 王勤章 郝志強(qiáng) 王敬珅 汪淵 李永樂 譚明輝 劉志立

[摘要]目的探究納米細(xì)菌（NB）損傷人腎小管上皮細(xì)胞 HK-2并導(dǎo)致晶體滯留的機(jī)制。方法應(yīng)用腎結(jié)石患者尿液培養(yǎng)的 NB，實(shí)驗(yàn)分為5組：對(duì)照組（胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）、NB 組（NB 菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）、COM 組（一水草酸鈣， COM 懸液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）、nHAP組（納米級(jí)羥基磷灰石，nHAP、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）和四環(huán)素干擾組（TET+NB，四環(huán)素、NB 菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）。將 HK-2細(xì)胞分別與各組作用物共培養(yǎng)6、12、24 h 后，用光學(xué)顯微鏡觀察 HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;超聲粉碎細(xì)胞后檢測(cè) Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性;檢測(cè)培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量。結(jié)果 HE 結(jié)果可見，nHAP組和四環(huán)素干擾組中 HK-2細(xì)胞的損傷程度明顯低于 NB 組（P <0.05）。共同培養(yǎng)12、24 h 后， NB 組和 COM 組 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對(duì)照組，H2O2含量均高于對(duì)照組（P <0.05），nHAP組 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對(duì)照組（P <0.05），四環(huán)素干擾組 Na+-K -ATP 酶和 Ca+2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 組（P <0.05）。共同培養(yǎng)6、12、24 h 后， NB 組和 COM 組 MDA 含量均高于對(duì)照組（P <0.05），四環(huán)素干擾組 MDA 含量均低于 NB 組（P <0.05）; COM 組 LDH 含量均高于對(duì)照組（P <0.05），nHAP組、四環(huán)素干擾組 LDH 含量均低于 COM 組（P <0.05）。結(jié)論 HK-2細(xì)胞損傷的原因可能是 NB 通過誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)造成的， NB 作用時(shí)間越長(zhǎng)，損傷程度越重。四環(huán)素在一定程度上可以阻止 NB 對(duì) HK-2細(xì)胞的損傷。[關(guān)鍵詞]腎結(jié)石;納米細(xì)菌; HK-2細(xì)胞;脂質(zhì)過氧化;四環(huán)素

[中圖分類號(hào)] R692.4? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）07-0021-05

Investigation on the role of nanobacteria in the formation ofrenal calculi

YANG HengQIANbiao??? ZHENG Liying??? WANG QinzhangHAO? Zhiqiang1，2WANG? Jingshen1，2????? WANG? Yuan1，2????? LI? Yongle1，2????? TAN? Minghui1，2LIU? Zhili

1. Department of Urology， First Affiliated Hospital， School of Medcine， Shihezi University， Xinjiang， Shihezi 832000， China;2. First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Jiangxi， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of nanobacteria （NB） to damage human renal tubular epithelial HK-2 cells and lead to crystal retention. Methods The urine of patients with renal calculi was applied to culture NB. The experiment included five groups： the control group （fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the NB group （NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the COM group （calcium oxalate monohydrate， i.e.， COM suspension， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the nHAP group （nano-hydroxyapatite， i.e.， nHAP， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells） and the tetracycline （TET） interference group （TET+NB， tetracycline， NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）. HK-2 cells were co-cultured with each group of agents for 6 h， 12 h and 24 h， respectively， and then the morphological changes of HK-2 cells were observed by optical microscope. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase were detected after ultrasonic comminution to break cells. The contents of lactate dehydrogenase （LDH）， hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde （MDA） in the culture medium were detected. Results HE results showed that the damage degree of HK-2 cells in nHAP group and tetracycline interference group was significantly lower than that in NBgroup （P <0.05）.After co-culture for 12 and 24 h， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase in NB group and COM group were lower than those in control group， and the content of H2O2 was higher than that in control group （P <0.05）. The activities of Ca2+-Mg2+-ATPase in the nHAP group werelower than those in the control group （P <0.05）， and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+- ATPase in the tetracycline interference group were higher than those in the NB group （P <0.05）. After 6， 12， and 24 h of co-culture， the MDA content in the NB group and the COM group were higher than that in the control group （P <0.05）， and the MDA content in the tetracycline interference group was lower than that in the NB group （P <0.05）; the LDH content in the COM group was higher than that in the control group （P <0.05）， the LDH content in the nHAP group and the tetracycline interference group were lower than that in the COM group （P <0.05）. Conclusion The damage of HK-2 cells may be caused by NB-induced lipid peroxidation. The longer the action time of NB， the more serious the damage. Tetracycline can prevent NB from damaging HK-2 cells to a certain extent.

[Key words] Renal calculi; Nanobacteria; HK-2 cells; Lipid peroxidation; Tetracycline

腎結(jié)石在泌尿系結(jié)石中最常見，而腎結(jié)石中以草酸鈣結(jié)石最為常見[1]，在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中稱之為石淋或者砂淋。目前對(duì)于該疾病的診斷和治療已經(jīng)非常成熟，比如經(jīng)尿道輸尿管鏡激光碎石取石術(shù)、經(jīng)皮腎鏡鈥激光碎石取石術(shù)以及體外沖擊波碎石術(shù)，其中體外沖擊波碎石術(shù)相對(duì)患者來說不會(huì)造成損傷，由于術(shù)后恢復(fù)良好，許多患者傾向選擇該種方式[2];但其復(fù)發(fā)率較高，發(fā)病可表現(xiàn)為急癥，不僅導(dǎo)致患者疼痛難忍，并且增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本[3-4]。

芬蘭科學(xué)家Kajander首次在腎結(jié)石中發(fā)現(xiàn)并命名了納米細(xì)菌（nanobacteria， NB）， NB 是具有獨(dú)特的生物礦化功能致病菌，它可作為活性中心，通過自身生物礦化作用的同時(shí)，還依靠黏附血液中的鈣、磷等離子形成礦化顆粒，最終形成結(jié)石[5-6]。尿液中鈣鹽晶體形成后，會(huì)刺激腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生病理性改變，致使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和損傷，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)[7]。四環(huán)素是為數(shù)不多可以有效抑制 NB 生長(zhǎng)的藥物，易劍鋒等[8]相關(guān)研究表示，四環(huán)素對(duì)治療 NB 相關(guān)的慢性前列腺炎確有療效[9]。

有研究表明腎結(jié)石與NB 存在一定的相關(guān)性[7]，所以 NB 在腎結(jié)石形成過程中的作用及其機(jī)制的研究備受關(guān)注[10-12]。本課題旨在通過研究 NB 在腎結(jié)石形成過程中的作用及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器見表1。

1.2? NB培養(yǎng)與鑒定

NB 培養(yǎng)與鑒定方法詳見褚浩等[6]的研究。1.3 實(shí)驗(yàn)分組

選取 HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為5組： NB 組、對(duì)照組、C OM 組、nHAP組和四環(huán)素干擾組。見表2。

1.4 各組細(xì)胞HE染色觀察

分別在各時(shí)間點(diǎn)提取各組細(xì)胞，每組吸取100μl 細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞離心涂片機(jī)進(jìn)行涂片，PBS 沖洗3次，晾干;玻片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化后，使用 Harris 蘇木精1 min，然后用自來水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染色5 min;再經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測(cè)

①分別在6、12、24 h 取各組細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書分別檢測(cè) H2O2、MDA、LDH 含量;②向吸進(jìn)培養(yǎng)液的細(xì)胞中加入0.25%胰蛋白酶并反復(fù)吹打，將細(xì)胞消化，轉(zhuǎn)移至 EP 管中，分別加入 PBS 緩沖液400μl;③經(jīng)超聲粉碎機(jī)粉碎，用 ATP 酶試劑盒（樣本前處理需高速離心）比色法測(cè)定各組細(xì)胞 ATP 酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用 SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，使用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用[M（P25， P75）]表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。 P <0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組HE染色結(jié)果

NB 組部分細(xì)胞胞體膨脹增大，胞核松散，核膜模糊不清;對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)大小均一，胞核清晰，胞漿致密，未見明顯異常;COM 組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞核松散，部分核膜溶解，核仁消失;nHAP組細(xì)胞核膜較清晰，胞核更加致密;四環(huán)素干擾組大部分細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、致密，胞核清晰部分細(xì)胞出現(xiàn)胞體膨脹，胞核松散。HE 染色結(jié)果見圖1。

2.2 各組細(xì)胞損傷因子指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

NB 組和 COM 組共同培養(yǎng)12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對(duì)照組;nHAP組共同培養(yǎng)12 h 后 Na+-K+-ATP 酶活性低于對(duì)照組、高于 COM 組， Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于對(duì)照組;nHAP組共同培養(yǎng)24 h 后 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于對(duì)照組，高于 NB 組和 COM 組;四環(huán)素干擾素組共同培養(yǎng)12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見表3。

對(duì)照組12、24 h 的 H2O2含量均低于 NB 組和 COM 組，四環(huán)素干擾組12 h 及24 h 的 H2O2含量低于 NB 組; COM 組6、12、24 h 的 LDH 含量時(shí)高于對(duì)照組，nHAP組和四環(huán)素干擾組在6 h 時(shí) LDH 低于 NB 組和 COM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）; NB 組和 COM 組 MDA 含量均高于對(duì)照組，四環(huán)素干擾組顯著低于 NB 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。見表4。

3討論

腎結(jié)石形成的原因較多，目前尚不清楚[13-14]。鄧昊[15]總結(jié)腎結(jié)石形成有以下幾種假說：①血液經(jīng)腎濃縮成尿液，尿液中的鹽類可形成結(jié)晶，在人體鈣磷代謝紊亂時(shí)出現(xiàn)結(jié)石;② Randall 實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為是礦物質(zhì)結(jié)晶在腎乳頭處形成的鈣化斑塊導(dǎo)致結(jié)石形成;③部分人群未患尿結(jié)石是因?yàn)槟蛞褐写嬖谀蚰冈瑪?（UPTF1）等抑制物，當(dāng)抑制物發(fā)生異?；驕p少時(shí)可形成結(jié)石。研究者認(rèn)為原因可能為 Randall 腎乳頭鈣化斑學(xué)說和腎小管細(xì)胞損傷學(xué)說[16-17]。歸納以上結(jié)論不難看出，結(jié)石的形成來源于礦物質(zhì)結(jié)晶鈣化，并且結(jié)晶可以深入腎小管間隙進(jìn)一步破壞腎組織。腎結(jié)石中培養(yǎng)出 NB 的陽性率達(dá)90%以上，而 NB 具有獨(dú)特的生物礦化作用[18]，因此 NB 感染與腎結(jié)石存在一定相關(guān)性[19-20]。

NB 在生長(zhǎng)增殖過程中能分泌羥磷灰石類的鈣化物[5]，因此，本研究設(shè)置 COM 組（5 mmol/L）和nHAP組作為對(duì)照，探究 NB 是否可對(duì)腎小管上皮細(xì)胞 HK-2產(chǎn)生損傷，并通過設(shè)置四環(huán)素干擾組進(jìn)行驗(yàn)證。HE 染色結(jié)果顯示各組對(duì) HK-2破壞嚴(yán)重程度為 COM 組>NB 組>四環(huán)素干擾組>nHAP組>對(duì)照組，前兩組出現(xiàn)更多的胞體腫脹等現(xiàn)象， COM 組同樣表現(xiàn)核仁消失等現(xiàn)象。NB 組和nHAP組細(xì)胞膜亦可逐步解離，細(xì)胞刷狀緣排列錯(cuò)亂。可見 NB 對(duì)腎小管的損害與 COM 相關(guān)性更大，直接分泌出的羥基磷灰石需凝結(jié)形成鈣化晶體從而進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生破壞，且四環(huán)素可通過抑制 NB 減少該損害。細(xì)胞因子損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示 COM 組和 NB 組 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均降低，而 LDH 水平較高，提示 NB、COM 可損傷 HK-2的細(xì)胞膜，在 COM 組和 NB 組中有 H2O2和 MDA 水平的升高，提示 NB 在 HK-2細(xì)胞破壞過程中存在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。劉鑫等[7]研究表明大量活性氧自由基能造成腎小管上皮細(xì)胞損傷，且能增加晶體黏附力，形成惡性循環(huán)，加劇鈣化晶體沉積，形成腎結(jié)石。李軍等[21]選取60例 NB 感染的Ⅲ型前列腺炎患者平均分為四環(huán)素治療組和左氧氟沙星治療組，連續(xù)用藥1個(gè)月后，四環(huán)素治療組疼痛、排尿癥狀和生活質(zhì)量評(píng)分顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）。

綜上所述，可通過聯(lián)合 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶活性及 LDH、H2O2和 MDA 含量的改變來判斷 NB 是否損傷 HK-2細(xì)胞。同時(shí)四環(huán)素可以減弱 NB 對(duì) HK-2細(xì)胞的損害，因此四環(huán)素聯(lián)合其他藥物殺滅 NB 可能是腎結(jié)石患者的福音。

[參考文獻(xiàn)]

[1] TANG，RUIQIANG，JIANG，et al.16S rRNA genesequencing reveals altered composition of gut microbiota in individuals with kidney stones[J].Urolithiasis，2018，46（6）：503-514.

[2]張偉.經(jīng)皮腎鏡 EMS 碎石清石術(shù)對(duì)復(fù)雜性腎結(jié)石患者術(shù)后結(jié)石清除率及生活質(zhì)量的影響[J].新疆醫(yī)學(xué)，2018，48（7）：739-741，744.

[3] Yang Y，Deng Y，Wang Y.Major geogenic factorscontrolling geographical clustering of urolithiasis in China[J].Science of the Total Environment，2016，571（7）：1164-1171.

[4] Tasian GE，Kabarriti AE，Kalmus A， et al.KidneyStone Recurrence among Children and Adolescents[J]. Journal of Urology，2016，197（1）：246.

[5]馬宏亮，楊彬，張雁鋼，等.納米細(xì)菌與感染和相關(guān)鈣化性疾病研究進(jìn)展[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，48（9）：963-965.

[6]褚浩，王勤章，吳雙，等.納米細(xì)菌大鼠腎結(jié)石模型腎臟結(jié)石形成時(shí)間的動(dòng)態(tài)研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20（21）：2613-2618.

[7]劉鑫，陳潔，粟宏偉.氧自由基、炎癥反應(yīng)與腎結(jié)石形成的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2016，56（33）：111-113.

[8]易劍鋒，葉蓁蓁，王新平，等.大黃消痔栓直腸給藥聯(lián)合四環(huán)素片治療納米細(xì)菌致Ⅲ型前列腺炎臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2017，24（8）：36-40.

[9]王新平.濕熱瘀阻型Ⅲ型前列腺炎納米細(xì)菌16SrRNA檢測(cè)分析及大黃消痔栓干預(yù)治療研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2017：1-46.

[10] Nitin Abrol，Arabind Panda，Nitin Kekre，et al.Nanobacteria in the pathogenesis of urolithiasis： Myth or reality？[J].Indian Journal of Urology，2015，31（1）：3-7.

[11] Ansari Hani，AkhavanSepahi Abbas，AkhavanSepahiMohsen.Different Approaches to Detect "Nanobacteria" in Patients with Kidney Stones： an Infectious Cause or a Subset of Life？[J].Urology Journal，2017，14（5）：5001-5007.

[12] Hong Xin， Wang Xiaofeng， Wang Tian， et al.Roleof nanobacteria in the pathogenesis of kidney stone formation[J].American Journal of Translational Research，2016，8（7）：3227-3234.

[13] 葉濤，葉章群 . 炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)與腎結(jié)石形成的研究進(jìn)展 [J]. 中華泌尿外科雜志，2018，39（9）：711-713.

[14] 鄧耀良，劉云龍，陶芝偉，等 . 細(xì)胞 - 晶體反應(yīng)介導(dǎo)的炎癥在腎內(nèi)草酸鈣晶體形成中的作用 [J]. 中華外科雜志，2018，56（10）：733-736.

[15] 鄧昊 . 腎結(jié)石形成的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)醫(yī)師雜志，2015，17（11）：1756-1758.

[16] 朱敏，曾鋒，崔雨，等 . 基質(zhì)Gla蛋白與骨形成蛋白 2在草酸鈣腎結(jié)石患者 Randall 鈣斑中的表達(dá) [J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，42（3）：43-49.

[17] Dhayat NA，Gradwell MW，Pathare G，et al.Furosemide/Fludrocortisone Test and Clinical Parameters to Diagnose Incomplete Distal Renal Tubular Acidosis in Kidney Stone Formers[J].Clinical Journal of the American Society of Nephrology Cjasn，2017，12（9）：1507-1517.

[18] 郝志強(qiáng)，王勤章，倪釗，等 . 腎結(jié)石兩種造模方式血、尿生化的動(dòng)態(tài)比對(duì)研究 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（10）：15-19.

[19] Abrol N，Panda A，Kekre NS，et al.Nanobacteria in the pathogenesis of urolithiasis： Myth or reality？[J].Indian Journal of Urology Iju Journal of the Urological Society of India，2015，31（1）：3.

[20] Hong X，Wang X，Wang T，et al.Role of nanobacteria in the pathogenesis of kidney stone formation[J].Am J Transl Res，2016，8（7）：3227-3234.

[21] 李軍，呂宏迪，明愛民，等 . 納米細(xì)菌感染致Ⅲ型前列腺炎的臨床治療研究 [J]. 實(shí)用醫(yī)藥雜志，2014（5）：389-391.

（收稿日期：2021-04-06）