吳京展 秦坤明 廖聲潮 唐純海 阮玉山

[摘要]目的丘腦-皮層的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系對神經(jīng)科學(xué)有重要的意義，是理解認(rèn)知和意識的核心問題。本研究擬采用三維顯微體視解剖方法聯(lián)合高爾基斷層切片染色的方法呈現(xiàn)兔丘腦-皮層結(jié)構(gòu)的三維層次關(guān)系。方法用福爾馬林固定兩周以上的幼兔頭兩只在連續(xù)變倍體視顯微鏡下解剖，尋找到展示丘腦-皮層關(guān)系的較佳剖面角度，然后利用該剖面作指導(dǎo)，在對側(cè)半球鏡像位置進行同樣的斷層切片和高爾基染色，以標(biāo)注切片研究圖片的正確結(jié)構(gòu)。結(jié)果三維顯微體視解剖技術(shù)可以像在人類神經(jīng)外科臨床解剖研究中所展現(xiàn)的那樣，顯示出強大的三維結(jié)構(gòu)觀察功能。該技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)的腦斷層切片染色技術(shù)，可以幫助正確展示腦結(jié)構(gòu)的剖面，避免單純切片研究中產(chǎn)生的某些對大腦三維結(jié)構(gòu)的誤解。結(jié)論三維顯微體視解剖技術(shù)聯(lián)合二維高爾基斷層切片技術(shù)能很好地顯示兔端腦的丘腦-皮層的層級三維關(guān)系和詳細(xì)的切片染色細(xì)節(jié)。 [關(guān)鍵詞]顯微體視解剖;顯微解剖;腦三維結(jié)構(gòu);斷層切片;丘腦-皮層結(jié)構(gòu);新西蘭兔;脊椎動物

[中圖分類號] R602? [文獻標(biāo)識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）07-0025-06

Study on the thalamocortical hierarchical organization in rabbits by three-dimensional stereoscopic microanatomy combined with two-dimensional sectioning and Golgi staining

WU? Jingzhan??? QIN? Kunming??? LIAO? Shengchao??? TANG? Chunhai??? RUAN? Yushan

Department of Neurosurgery， the Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi， Nanning 530000，China

[Abstract] Objective The structural and functional relationship between thalamus and cortex is of great significance to neuroscience and is the core for understanding cognition and consciousness. In this study， three- dimensional stereoscopic microanatomy combined with sectioning and Golgi staining was used to present the three-dimensional hierarchical relationship of rabbit thalamocortical structure. Methods Two young rabbit heads fixed with formalin for more than two weeks were dissected under a zoom stereo microscope to find a better profile angle to show the relationship between thalamus and cortex. Then under the guidance of this profile， the same cross-sectional sectioning and Golgi staining were performed at the mirror position of the contralateral hemisphere to mark the correct structure on the picture for the sectioning study. Results The three-dimensional stereoscopic microanatomy could demonstrate a powerful three-dimensional structure observation function as shown in the clinical anatomy of human neurosurgery. This technique combined with the traditional brain sectioning and staining technique could help to correctly display the profile of brain structure and avoid some misunderstandings about the three-dimensional structure of brain in the simple sectioning study. Conclusion Three-dimensional stereoscopic microanatomy combined with two-dimensional sectioning and Golgi staining can well display the hierarchical three-dimensional relationship between thalamus and cortex in rabbit telencephalon and sectioning and staining details.

[Key words] Stereoscopic microanatomy; Microanatomy; Three-dimensional structure of brain; Cross-sectional sectioning; Thalamocortical structure; New Zealand rabbit; Vertebrate

目前除人類大腦外，其他脊椎動物的腦結(jié)構(gòu)研究還沒有應(yīng)用顯微體視解剖的方法，仍然主要使用二維切片染色技術(shù)[1]。切片染色固然對顯微解剖（microanatomy）結(jié)構(gòu)的顯示十分清楚，但是對宏觀結(jié)構(gòu)的三維關(guān)系有時會產(chǎn)生誤解，有研究[2]運用斷層解剖制作圖譜的時候由于缺乏三維體視顯微圖譜的參考就誤解了側(cè)腦室和三腦室的范圍和丘腦-半球間隙。研究[3]已經(jīng)證明三維顯微體視解剖在說明新西蘭兔丘腦-皮層結(jié)構(gòu)關(guān)系中的重要參考作用。現(xiàn)擬采用三維顯微體視解剖的方法聯(lián)合傳統(tǒng)的二維高爾基斷層切片染色呈現(xiàn)新西蘭兔丘腦-皮層的三維結(jié)構(gòu)關(guān)系。本研究的圖譜主要呈現(xiàn)兩個方法結(jié)合對生物腦的詳盡展示作用，以及對斷層切片的指導(dǎo)作用，為以后的脊椎動物的丘腦-皮層網(wǎng)絡(luò)功能的闡述提供參考。

1材料與方法

1.1? 標(biāo)本制作和處理

1.1.1 標(biāo)本制作使用兩只40日齡新西蘭幼兔（實驗動物生產(chǎn)許可證號： SCXK 桂2014-0002）。參考已有研究[4]，用過量的戊巴比妥（100 mg/kg）處死動物。剖取兔頭并完全去除頭部皮毛，泡入10%中性緩沖福爾馬林固定液（廣州維格斯生物科技有限公司）并于常溫下避光固定兩周以上待用。

固定處理后的兔頭標(biāo)本在直視下，用咬骨鉗和組織剪分離去除顱骨表面的大塊軟組織。而后在三目體視顯微鏡觀察下用顯微剪、顯微持針器、顯微鑷分離去除顱骨表面肌肉、筋膜、唾液腺及眶內(nèi)組織，各顱神經(jīng)于出顱骨處切斷。

1.1.2 顯微體視解剖標(biāo)本的制作經(jīng)上述處理的兔顱標(biāo)本取仰臥位，于體視顯微鏡（WSOPTICS 上饒市微視時代光學(xué)儀器有限公司，目鏡高眼點廣角20×，物鏡0.3×， XPZ 連續(xù)變倍機頭0.6×～5×可調(diào)，0.5×攝像機接筒）3.6～15倍條件下，用顯微持針器充當(dāng)顯微咬骨鉗，及使用顯微鑷及顯微剪分離解剖去除顱骨。顱骨解剖順序從腹側(cè)的枕骨大孔處開始，逐漸向周圍去除腦的腹側(cè)骨質(zhì)，然后兔顱再左右側(cè)臥以去除顱蓋骨質(zhì)。

去除完骨質(zhì)的兔大腦標(biāo)本外包裹硬腦膜及附屬的靜脈竇、穿行的頸內(nèi)動脈、三叉神經(jīng)的硬腦膜鞘、垂體的硬腦膜鞘。在體視顯微鏡下繼續(xù)將硬腦膜及其附屬結(jié)構(gòu)去除，得到完整的腦結(jié)構(gòu)（包括大腦結(jié)構(gòu)、中腦、腦橋、延髓、小腦及兩側(cè)絨球小結(jié)葉）。在體視顯微鏡下繼續(xù)解剖，切開一側(cè)半球的側(cè)腦室頂部神經(jīng)層，尋找到能正確顯示丘腦-皮層的延伸和卷曲層疊關(guān)系的剖面角度，將該剖面擴展至整個半球和丘腦，從而形成擬做高爾基染色的切片的指導(dǎo)剖面。

1.2 切片染色的制作

1.2.1 高爾基染色在顯微體視解剖已做好剖面?zhèn)鹊拇竽X半球參考下，于對側(cè)半球?qū)⑼媚X組織切出2～3 mm 厚的組織塊。組織塊用生理鹽水輕輕清洗數(shù)遍后，置于45 ml EP 管中，加入高爾基染液（servicebio， G1069）將組織完全浸沒，放置陰涼通風(fēng)處避光處理14 d（浸泡48 h 后換一次新染液，之后每隔3 d 換一次新染液）。

1.2.2 脫水將組織塊取出，置于15%蔗糖溶液中4℃避光脫水1 d。而后取出組織，置于30%蔗糖溶液中4℃避光脫水2 d。

1.2.3 顯影定影取出組織塊用蒸餾水洗1 min，然后浸入濃氨水（國藥）處理45 min，蒸餾水洗1 min，最后浸入酸性堅膜定影液處理45 min，蒸餾水洗1 min。

1.2.4 脫水冰凍切片組織塊置于30%蔗糖溶液中4℃避光脫水2～3 d，腦組織 OCT（SAKURA，4583）包埋，冰凍切片100μm（明膠玻片貼片），常溫避光保存過夜，取出切片浸入純水20 s，濾紙擦干組織周圍多余的水分后，甘油明膠封片（servicebio， G1402）。

1.3 標(biāo)本分析

所有標(biāo)本顯微體視解剖照片均使用三目顯微解剖顯微鏡的攝像機拍攝，光源除顯微鏡自帶物鏡的環(huán)形光源外，另加外置輔助20 cm 直徑環(huán)形補光源。照片的光學(xué)及數(shù)碼放大倍數(shù)在5×～20×，背景為深藍色照相紙。切片染色照片用數(shù)字切片掃描儀（3D HISTECH，Pannoramic 250）全景掃描。

2結(jié)果

兩個兔腦，一個同既往的兔腦大體解剖，展示背側(cè)、腹側(cè)、外側(cè)、內(nèi)側(cè)、喙側(cè)、尾側(cè)大體觀的基本視角，但拍攝的顯微彩色照片較其他研究的黑白大體觀照片有明顯的進步。該標(biāo)本還進一步用于剖開側(cè)腦室頂，觀察丘腦-皮層間脈絡(luò)裂的結(jié)構(gòu)關(guān)系，以幫助第二個兔腦標(biāo)本確定剖面的制作角度。第二個兔腦標(biāo)本在第一個標(biāo)本提供的指導(dǎo)下，選擇合適角度進一步剖開腦室頂并逐步解剖形成丘腦-皮層剖面。這個過程中，顯微體視解剖技術(shù)展示了良好的顯微結(jié)構(gòu)展示功能。第二個標(biāo)本的對側(cè)完整半球在已解剖側(cè)半球的指導(dǎo)下，進行切片包埋后染色制作染色片。在顯微體視解剖輔助下，制作的二維切片圖片的結(jié)構(gòu)關(guān)系簡潔明了，不會產(chǎn)生單純斷層切片解剖研究中三維解剖結(jié)構(gòu)混淆的問題。

2.1 端腦基本視角的重作

顯微體視解剖制作的標(biāo)本顯微細(xì)節(jié)清晰可見。兔腦背、腹、外、內(nèi)、尾、喙視圖各種腦表面細(xì)節(jié)展示非常清楚，特別是腹側(cè)視野，能清晰展示Shek等[5] 用普通解剖技術(shù)及黑白大體解剖照片所不能解剖展示的垂體、垂體柄、各對顱神經(jīng)。內(nèi)側(cè)觀展示了既往大體解剖所不能展示的丘腦間結(jié)構(gòu)：清晰的三腦室結(jié)構(gòu)和丘腦中間塊。見圖1～7。

2.2 半球的顯微解剖

圖8～9展示逐步打開側(cè)腦室的頂-半球背外側(cè)的神經(jīng)層，以展示丘腦-皮層延伸卷曲的層級關(guān)系。圖10展示了左側(cè)丘腦直接延伸出島狀皮質(zhì)，而對側(cè)的完整半球?qū)φ照故玖税肭蚺c丘腦的層疊關(guān)系。他們之間的胼胝體被浮雕狀保留，顯示了兩側(cè)半球間的聯(lián)絡(luò)纖維與丘腦的位置關(guān)系。

2.3 丘腦-半球剖面的制作

在前面顯微體視解剖的觀察的參照下，另外一個兔腦被解剖到圖11的剖面，進而選擇這個剖面制作圖12的剖面。該剖面可以完全展示丘腦和皮層的直接延伸關(guān)系和他們之間卷曲形成的側(cè)腦室和腦表面間隙，很好地糾正了單純斷層切片對一些三維結(jié)構(gòu)的誤解[2]。以這個被選擇的剖面做左右對稱的鏡像指導(dǎo)，在對側(cè)半球進行了組織塊切片，進而做高爾基染色。該切片照片很好展示了丘腦-皮層的延伸關(guān)系。高爾基染色照片顯示，皮層邊緣延續(xù)為海馬和傘，皮層卷曲形成側(cè)腦室，傘分隔了側(cè)腦室和腦表面。見圖13。這些單純切片研究容易誤解的結(jié)構(gòu)在顯微體視解剖和切片染色的聯(lián)合展示下得到很好的說明。

3討論

丘腦-皮層的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系[6-8]對神經(jīng)科學(xué)有重要的意義，是理解認(rèn)知和意識的核心問題[9-19]。正確認(rèn)識這個結(jié)構(gòu)的三維關(guān)系和跨物種演變是腦切片研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[20-25]機制的基礎(chǔ)。然而在臨床工作中，那些僅觀察腦斷層解剖的研究人員，如影像醫(yī)生，由于較少接觸腦三維顯微標(biāo)本，往往會出現(xiàn)對腦三維解剖結(jié)構(gòu)不熟悉或誤解的問題。這個問題在其他脊椎動物的切片研究中也普遍存在。目前神經(jīng)科學(xué)各學(xué)科已經(jīng)在迅速融合，如何在各個神經(jīng)科學(xué)亞學(xué)科間搭建起橋梁以促進整個大學(xué)科的發(fā)展從而幫助研究者徹底地理解大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)？顯而易見技術(shù)融合的方法是非常行之有效的解決途徑。預(yù)計丘腦-皮層網(wǎng)絡(luò)[26]在今后的腦認(rèn)知和意識機制研究[27-28]中將會占據(jù)越來越重要的位置，本研究用顯微體視解剖技術(shù)聯(lián)合高爾基切片染色的方法成功制作了一個高爾基切片染色的照片。在這個剖面中，染色是同一次生成的，整個顯微染色照片具有非常高的整體性，而且染色片可以進一步局部放大以觀察各局部的神經(jīng)元細(xì)節(jié)。當(dāng)然，本研究也有缺陷，如顯微體視解剖拍攝對震動要求非常高，體視顯微鏡搖臂的固有輕微震動稍微影響了顯微體視解剖照片的質(zhì)量。另外切片還可以用除高爾基染色以外的其他染色的方法進行染色，如結(jié)晶染色、尼氏染色等，這將會讓神經(jīng)結(jié)構(gòu)更加清楚。

綜上所述，顯微體視解剖觀察是目前較好的腦三維結(jié)構(gòu)觀察方法，充分利用顯微體視解剖可以制作精美的腦標(biāo)本并展示三維結(jié)構(gòu)[29-33]。因此，利用三維顯微體視解剖技術(shù)可以幫助尋找到切片研究所需要的剖面并進行切片染色。在三維顯微體視解剖的幫助下，切片顯微解剖能在正確理解三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上展示神經(jīng)結(jié)構(gòu)。

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（收稿日期：2021-10-09）