李靜堯，楊 博，拓曉丹，王繼飛，李小偉

（1.寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏賀蘭山國家級自然保護區(qū)管理局，寧夏 銀川 750021）

沙棘（Hippophae）屬胡頹子科，為落葉灌木，分布于華北、西北、西南等地，具有抗旱、抗寒、抗鹽堿等特性，因此被廣泛用于水土保持、防風固沙和改良土壤等，現(xiàn)已成為西北干旱、半干旱區(qū)的重要植物資源[1]。

中國是世界上沙棘資源最豐富的國家，有7種和7亞種[2]。橫斷山和東喜馬拉雅地區(qū)是沙棘屬植物類群分布中心、原始類群中心和類群分化中心。沿著中國的森林-草原過渡帶分布著7種5亞種，存在明顯的替代分布。其中中國沙棘（H.rhamnoides）從黃土高原東部分布到青藏高原東緣，海拔范圍800~3 300 m，是沙棘屬中分布范圍最廣、蘊藏量最大的物種，有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值；肋果沙棘（H.neurocarpa）分布于青藏高原東南緣，海拔范圍3 400~4 300 m；西藏沙棘（H.tibetana）分布于青藏高原東南緣，海拔范圍2 800~5 200 m，是沙棘屬中在青藏高原分布范圍最廣的物種[3—4]。這種分布格局是物種長期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，而結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)的差異和變化必然影響其生理生態(tài)功能，進而影響物種的分布。

葉片是植物最重要、可塑性最大的功能器官，因此研究葉片的結(jié)構(gòu)及其對環(huán)境的響應(yīng)，對闡釋物種分布格局具有重要意義。低溫是影響植物生長發(fā)育和地理分布的一個重要生態(tài)因子，對植物抗寒性的影響顯著大于其他環(huán)境脅迫因素[5—6]。有研究表明，在低溫環(huán)境中，葉片改變其自身結(jié)構(gòu)以適應(yīng)環(huán)境[7]。韓善華等[8]研究了沙冬青，發(fā)現(xiàn)其較耐寒，主要表現(xiàn)為葉肉組織發(fā)達，分化程度高，柵欄組織厚，排列緊密等；楊寧寧等[9]研究認為，冬油菜的抗寒性與其葉片的柵海比呈正相關(guān)；劉星輝等[10]通過香蕉葉片試驗發(fā)現(xiàn)，葉片的角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度與品種抗寒性呈正相關(guān)，而海綿組織厚度/葉片厚度與品種抗寒性呈負相關(guān)；余文琴等[11]研究了荔枝葉片，發(fā)現(xiàn)角質(zhì)層厚度與其抗寒性呈正相關(guān)。由此可見植物葉片解剖結(jié)構(gòu)能夠指示植物的耐寒性[12]。因此，本文以3種沙棘屬植物葉片為材料，使用顯微鏡觀察其永久裝片，對比研究沙棘屬植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，利用隸屬函數(shù)法評價其耐寒性，以期為中國沙棘、肋果沙棘和西藏沙棘替代分布提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集區(qū)概況

試驗材料包括中國沙棘（H.rhamnoides）、肋果沙棘（H.neurocarpa）、西藏沙棘（H.tibetana）。材料均取自四川省阿壩藏族羌族自治州若爾蓋縣，地處青藏高原東北邊緣，地理坐標為東經(jīng)102°08′～103°39′、北緯32°56′～34°19′，該地區(qū)屬高原寒溫帶濕潤季風氣候，常年無夏，年平均氣溫1.1℃，年降水量648.5 mm，無絕對無霜期，降雨多集中于5月下旬—7月中旬，年均相對濕度69%。材料名稱及來源見表1。

表1 材料名稱及來源

1.2 研究方法

1.2.1取樣方法 選取5個沙棘個體，每個個體采集5片發(fā)育良好、沒有病蟲斑的葉片，用FAA固定液（福爾馬林-醋酸-酒精混合液）固定，采用常規(guī)石蠟切片法（取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、染色、透明、封藏）制作葉片橫切面永久裝片（每種材料10片裝片，每片裝片有切片5片，切片厚度為8～10μm），將制片置于olympus顯微鏡下觀察，并用motic image advanced 3.0軟件測量并進行顯微照相。測定內(nèi)容為葉片厚度、上表皮和下表皮厚度、柵欄組織與海綿組織厚度、維管束厚度、角質(zhì)層厚度、木質(zhì)部厚度與韌皮部厚度。并進行以下計算：柵欄組織厚度/海綿組織厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度、葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度、上表皮厚度/下表皮厚度、主脈厚度/葉片厚度、木質(zhì)部厚度/維管束厚度、韌皮部厚度/維管束厚度、木質(zhì)部厚度/韌皮部厚度。

1.2.2數(shù)據(jù)處理 使用microsoft excel 2010和SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法對各個指標進行差異性分析，采用FUZZY數(shù)學中隸屬函數(shù)值法計算各物種的多個耐寒性指標的綜合評判值。隸屬函數(shù)值計算公式如下：

式中：U（Xi）為隸屬函數(shù)值；Xi為指標測定值；Xmax、Xmin為某一指標的最大值和最小值。若某一指標與植物的抗旱性呈負相關(guān)，則用反隸屬函數(shù)進行計算，公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 3種沙棘葉片解剖結(jié)構(gòu)的基本特征

觀察3種沙棘屬植物葉片橫切面結(jié)構(gòu)（圖1），可知葉片均由表皮、葉肉和葉脈三部分構(gòu)成。葉片橫斷面的上、下表皮細胞均為單層，上表皮比下表皮厚，上表皮具發(fā)達的角質(zhì)層。葉肉組織均有明顯的柵欄組織與海綿組織的分化，柵欄組織發(fā)達，位于葉近軸面表皮下，排列緊密，細胞長短不一，由2～3層發(fā)達的柱形細胞規(guī)則排列而成；海綿組織細胞疏松，由不規(guī)則細胞組成，分布在葉遠軸面的下表皮上方，數(shù)量少、不發(fā)達。葉脈具單一維管束，外韌型，略呈凹槽，均由木質(zhì)部、少量形成層和韌皮部構(gòu)成，其中木質(zhì)部導(dǎo)管呈徑向排列，倒傘狀分布于韌皮部上方，構(gòu)成維管束的主要部分。

圖1 3種沙棘葉片橫切面結(jié)構(gòu)

2.1.1葉表皮結(jié)構(gòu)比較 由表2可知，3種沙棘上表皮平均厚度由大到小分別是西藏沙棘17.87μm、肋果沙棘17.58μm、中國沙棘16.10μm，肋果沙棘與西藏沙棘上表皮厚度沒有顯著性差異，但兩者與中國沙棘差異性顯著。下表皮平均厚度為11.68～14.98μm，其中肋果沙棘最厚，西藏沙棘次之，中國沙棘最薄。上、下表皮厚度之比為1.19～1.37，其中西藏沙棘最大，中國沙棘次之，肋果沙棘最小。角質(zhì)層的厚度變化范圍為1.42～1.64μm，中國沙棘最厚，肋果沙棘次之，西藏沙棘最薄。

表2 3種沙棘葉片的解剖特征比較（n=15）

2.1.2葉肉組織比較 西藏沙棘第1層?xùn)艡诮M織細胞密度為7～9個/100μm，肋果沙棘為6～8個/100μm，中國沙棘為9～10個/100μm；柵欄組織厚度由大到小依次為西藏沙棘177.45μm、肋果沙棘166.78μm、中國沙棘148.66μm；葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度由大到小依次為西藏沙棘、肋果沙棘、中國沙棘，沒有顯著性差異；3種沙棘柵海比均大于1，由大到小依次為西藏沙棘1.14、肋果沙棘1.09、中國沙棘1.03，差異性顯著。葉片厚度分別為西藏沙棘355.34μm，肋果沙棘350.64μm，中國沙棘284.37μm。

2.1.3葉脈比較 由表2可知，維管束厚度最大的為中國沙棘，其次為肋果沙棘，西藏沙棘的最小，分別為302.24、168.98、147.11μm，中國沙棘維管束厚度與其余兩者差異性顯著。而木質(zhì)部與維管束厚度之比和木質(zhì)部與韌皮部厚度之比均表現(xiàn)為西藏沙棘最大，肋果沙棘次之，中國沙棘最小，而韌皮部與維管束厚度之比反之，三者有顯著性差異。

2.2 3種沙棘屬植物耐寒性綜合評價

單一的葉片結(jié)構(gòu)指標難以準確全面地反映植物耐寒性的強弱，隸屬函數(shù)法是目前普遍采用的抗性綜合評價方法，能客觀反映植物之間的耐寒性差異。本研究選取了9個耐寒性指標：上表皮厚度、柵欄組織厚度、木質(zhì)部厚度、維管束厚度、主脈厚度、上表皮厚度/下表皮厚度、柵欄組織厚度/海綿厚度、木質(zhì)部厚度/維管束厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度，這些指標均與耐寒性呈正相關(guān)。利用隸屬函數(shù)來評價沙棘屬植物的耐寒能力，其數(shù)值越大表明耐寒性越強。雖然其他指標對葉片的耐寒性分析也具有一定意義，但根據(jù)可比性和可測性原則，這些指標可用另外的指標替代或采用綜合多指標分析其耐寒性。3種沙棘屬植物耐寒性綜合評價值：西藏沙棘為0.53，肋果沙棘為0.51，中國沙棘為0.45，耐寒能力由強到弱依次為西藏沙棘、肋果沙棘、中國沙棘（表3）。

表3 3種沙棘耐寒指標的隸屬函數(shù)值、耐寒性綜合評價及排序

3 討論與結(jié)論

植物的耐寒性是受多方面因素控制的復(fù)合遺傳性狀，單一的耐寒性鑒定指標難以真實反映植物的耐寒性，只有采用多項指標進行綜合評價，才能比較準確地反映出植物的耐寒性。隸屬函數(shù)法在多指標測定的基礎(chǔ)上對植物的某一特性進行綜合評價，能有效避免因采用單個指標進行評價而造成的片面性[13]。隸屬函數(shù)分析作為一種有效的方法已廣泛應(yīng)用于桃（Prunus persica）[14]、油茶（Camellia oleifera）[15]、衛(wèi)矛屬（Euonymus）[16]、苔草屬（Carex）[17]、核桃（Juglans regia）[18]等植物的抗逆性鑒定。

葉片是植物氣體交換和光合作用的器官，與空氣完全接觸，對外界水熱變化敏感，因此葉解剖結(jié)構(gòu)的變化能夠反映植物對外界環(huán)境的響應(yīng)[19—20]。不同植物葉片解剖結(jié)構(gòu)與耐寒性的研究結(jié)果表明：表皮厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度、柵欄海綿比均與植物耐寒性有重要關(guān)系[21—27]。但不同植物的抗寒機制可能會有所不同，影響耐寒性的主要指標也可能不一致，完全按照前人的研究結(jié)果，選擇已有抗寒指標對3種沙棘的耐寒性進行綜合評價，有可能會影響耐寒性鑒定的準確性。本研究從3種沙棘的15個指標中篩選出上表皮厚度、柵欄組織厚度、木質(zhì)部厚度、維管束厚度、主脈厚度、上表皮/下表皮、柵欄/海綿、木質(zhì)部/維管束、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度9個指標，作為耐寒性綜合評價的主要指標，結(jié)果表明，耐寒性由強到弱依次為西藏沙棘、肋果沙棘、中國沙棘。

李瑞雪等[28]、何海旺等[29]的研究結(jié)果表明，柵欄組織排列緊密且厚度越大其耐寒性越好，已有研究[30—33]表明，植物的耐寒性與葉片結(jié)構(gòu)緊密度和柵海比均呈正相關(guān)。本研究中，西藏沙棘的柵欄組織最厚，這與其耐寒性評價結(jié)果為最大值一致；肋果沙棘的葉片組織緊密度最大，但與其耐寒性評價結(jié)果為中間值不一致。這說明在評價3種沙棘耐寒性時不能僅僅以某一單項指標作為評價標準，應(yīng)當考慮多項指標進行綜合評價。本研究利用篩選出的9項葉片結(jié)構(gòu)解剖指標對3種沙棘的耐寒性進行了初步評價，然而要想準確評價沙棘的耐寒性，還需要結(jié)合分子生物學、抗寒生理生化等方面因素加以綜合考慮。

綜上所述，本研究結(jié)果表明：葉片的解剖結(jié)構(gòu)是沙棘屬植物出現(xiàn)替代分布的重要影響因素。