外源酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗尖孢鐮刀菌西瓜?；偷挠绊?/h1>
2022-05-04 10:25孫小涵黃凱悅田彥梅
農(nóng)業(yè)科學(xué)研究 2022年1期
孫小涵，馬 鈺，黃凱悅，田彥梅，顧 欣
（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）
西瓜連作可導(dǎo)致土壤物理、化學(xué)和生物性質(zhì)發(fā)生變化，生產(chǎn)性能降低，還會(huì)引起土壤真菌化，尤其引起病原真菌數(shù)量增加，致使西瓜開花坐果后易發(fā)生枯萎病，造成西瓜產(chǎn)量、品質(zhì)下降，甚至絕收，產(chǎn)生嚴(yán)重的連作障礙[1]，而且枯萎病發(fā)病率有隨連作年限增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)[2]。西瓜枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON），尤以溫室栽培和大棚種植環(huán)境易發(fā)病。
連作可導(dǎo)致作物根系分泌物在土壤中積累，分泌物達(dá)到一定濃度后會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生毒害作用，這是引起連作障礙的主要因素之一[3—4]。其中，酚酸類物質(zhì)作為重要的化感物質(zhì)，一方面會(huì)降低土壤中某些養(yǎng)分的含量[5]，影響土壤中多種酶的活性[6]；另一方面會(huì)改變土壤微生物區(qū)系[7]。有研究表明，土壤酚酸的種類、濃度及無(wú)機(jī)養(yǎng)分與土壤微生物類群分布存在一定關(guān)系[8]。土壤中酚酸的累積可直接影響土壤的理化性質(zhì)，從而使土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、生物量和活性發(fā)生改變，某些種類的微生物在數(shù)量及活性上顯著增加或趨于增長(zhǎng)，同時(shí)另一些微生物則呈下降趨勢(shì)[9—10]。西瓜根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)對(duì)FON產(chǎn)孢、萌發(fā)及生長(zhǎng)往往具有“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”的作用規(guī)律，而水稻根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)則抑制FON產(chǎn)孢及萌發(fā)[11]。有研究表明，連作土壤中并存著多種酚酸類物質(zhì)，且酚酸類物質(zhì)之間存在互作效應(yīng)[12]。如不同濃度水平的水楊酸分別對(duì)對(duì)羥基苯甲酸表現(xiàn)增效和拮抗作用。因此，連作環(huán)境中由酚酸物質(zhì)導(dǎo)致的化感作用是多種酚酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果[13]。
將生防微生物引入綜合防控系統(tǒng)是重要且有效的方法之一[14]。目前，已獲得若干拮抗FON的菌株，并經(jīng)室內(nèi)試驗(yàn)證明其對(duì)病原菌具有不同程度的拮抗作用[15—16]，部分菌株在田間的試驗(yàn)也表現(xiàn)出較好的防效[17]。然而，筆者在應(yīng)用菌劑中遇到了二個(gè)問(wèn)題，一是某些生防菌株在室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中具有較高抑菌率，而田間防效卻不盡如人意；二是相同生防菌劑在不同土壤環(huán)境中使用，防效具有差異。土壤微生物的生存及活性極易受環(huán)境因子的影響[18]。連作土壤中的酚酸類物質(zhì)與植株健康生長(zhǎng)和土壤病原菌數(shù)量變化存在一定關(guān)系，但其對(duì)病原菌的拮抗菌及其功能的影響至今未見報(bào)道。本試驗(yàn)在添加不同濃度鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的條件下，比較FON和生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的情況，并通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)，研究不同外源酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON性能的影響，以期為生防菌劑的應(yīng)用研究提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1供試病原菌 西瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON）菌株由寧夏大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境教研室提供。
1.1.2供試拮抗菌 供試拮抗菌為商品菌劑，購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場(chǎng)。含單一細(xì)菌-解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），有效活菌數(shù)500×108CFU/mL。
1.1.3培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基用于病原菌的培養(yǎng)和對(duì)峙試驗(yàn)。
1.1.4試劑 供試鄰苯二甲酸由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，對(duì)羥基苯甲酸和肉桂酸由北京索萊寶科技有限公司提供，阿魏酸由北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1病原菌活化與菌碟制備 在直徑為9.0 cm的PDA平板中央點(diǎn)接少量FON斜面培養(yǎng)物，28℃、相對(duì)濕度60%，倒置培養(yǎng)5~6 d，待菌落基本長(zhǎng)滿平皿，于距平皿中心2.0 cm處用無(wú)菌打孔器打取直徑0.5 cm、菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)一致的菌碟備用。
1.2.2拮抗細(xì)菌對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響 以無(wú)菌水制備菌劑10倍、50倍和100倍稀釋液，室溫下?lián)u床振蕩混勻30 min，制成菌懸液。在PDA平板中央放置1個(gè)FON菌碟，以菌碟為中心距其邊緣2.0 cm處以十字對(duì)稱方式放置4個(gè)無(wú)菌牛津杯，每個(gè)杯中注入同一稀釋倍數(shù)菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。此時(shí)菌懸液中大部分水分已蒸發(fā)，取走牛津杯，持續(xù)培養(yǎng)并于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。在牛津杯內(nèi)注入120μL無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每處理設(shè)5次重復(fù)。抑菌率計(jì)算公式：抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理后菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。
1.2.3不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響 用無(wú)菌水制備質(zhì)量濃度為10、30和50 mg/L的鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸試劑，混合酚酸試劑中鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和肉桂酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)各占1/4。取酚酸試劑0.1 mL置于PDA培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌三角棒均勻涂抹，靜置2~3 min，待其滲入培養(yǎng)基，制成酚酸平板。于酚酸平板中央放置1個(gè)FON菌碟，28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK1）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.2.4不同酚酸對(duì)拮抗細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的影響 在酚酸平板中央?yún)^(qū)放置2個(gè)無(wú)菌牛津杯，二者相距4.0 cm，每個(gè)杯中注入同種菌劑的100倍稀釋液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基上加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK2）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.2.5不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON的影響 用30 mg/L的5種酚酸試劑制備相應(yīng)的酚酸平板，方法同1.2.3。于酚酸平板中央放置1個(gè)FON菌碟，以菌碟為中心距其2.0 cm處以十字對(duì)稱方式分別放置4個(gè)無(wú)菌牛津杯，每個(gè)杯中注入同一稀釋倍數(shù)的菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，以無(wú)菌水代替酚酸和菌劑為絕對(duì)對(duì)照，計(jì)算抑菌率。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK3）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用microsoft excel 2010處理及制作圖表；方差分析采用SPSS；利用LSD法在P＜0.05水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 拮抗細(xì)菌對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響
由圖1可知，供試菌劑對(duì)FON具有拮抗作用，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增大而降低。培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)，與10倍稀釋液的抑菌率比較，菌劑50倍稀釋液的抑菌率分別降低3.62%、2.98%和1.02%，100倍稀釋液的抑菌率分別降低6.72%、3.64%和1.28%。這說(shuō)明菌劑對(duì)病原菌的抑制率隨稀釋倍數(shù)增加而減小，稀釋10倍處理的抑菌率顯著高于稀釋100倍處理；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，各稀釋倍數(shù)處理間抑菌率的差異呈降低趨勢(shì)。
圖1 不同稀釋倍數(shù)的拮抗菌劑對(duì)FON的抑菌率
2.2 不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響
由表1可知，在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同酚酸處理均對(duì)FON菌落生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且該作用隨酚酸質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，不同酚酸對(duì)FON菌落直徑的促進(jìn)作用發(fā)生了變化。50 mg/L不同酚酸處理對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)作用如下：培養(yǎng)48 h時(shí)由強(qiáng)到弱依次為鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別增加了3.74%、3.54%、2.77%、2.36%和2.21%；培養(yǎng)72 h時(shí)強(qiáng)弱依次為混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸；培養(yǎng)96 h時(shí)強(qiáng)弱依次為肉桂酸、混合酚酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、阿魏酸。培養(yǎng)48 h，同一酚酸組中50 mg/L處理對(duì)菌落直徑的促進(jìn)作用顯著高于10 mg/L處理，鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸和肉桂酸的增幅分別為2.95%、2.18%、1.88%、1.79%和0.81%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，該差異逐漸縮小，至96 h時(shí)差異無(wú)顯著性。
表1 不同酚酸對(duì)FON菌落直徑的影響
2.3 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的影響
拮抗菌株是生防菌劑的核心成分，作為微生物活體，其生長(zhǎng)受到不同酚酸的影響。如表2所示，不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，抑制強(qiáng)度因酚酸種類而不同，并隨著酚酸質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。50 mg/L不同外源酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用如下：培養(yǎng)48 h時(shí)由強(qiáng)到弱依次為鄰苯二甲酸、混合酚酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別減少了18.82%、18.68%、17.24%、16.71%和15.13%；培養(yǎng)72和96 h時(shí)強(qiáng)弱依次為混合酚酸、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸。培養(yǎng)初期，50 mg/L鄰苯二甲酸、肉桂酸和混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落直徑的抑制作用顯著高于10 mg/L相應(yīng)酚酸處理，培養(yǎng)時(shí)間至72、96 h差異幅度縮減至無(wú)顯著性。50 mg/L混合酚酸處理的菌落直徑均為各組最低水平，48、72和96 h菌落直徑與CK相比降幅為18.68%、14.64%和14.64%。
表2 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落直徑的影響
2.4 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON的影響
由圖2可知，在外源酚酸環(huán)境中，生防細(xì)菌仍對(duì)FON表現(xiàn)出拮抗性，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增加而降低。添加不同酚酸顯著降低菌劑對(duì)FON的抑菌率，48 h時(shí)與CK比較，不同酚酸處理下菌劑的10、50和100倍稀釋液的抑菌率分別下降16.94%~21.23%、18.27%~25.32%和23.79%~28.19%。30 mg/L酚酸處理下，肉桂酸對(duì)菌劑100倍稀釋液拮抗性的影響最大，抑菌率僅為19.23%，較CK降低了28.19%；混合酚酸對(duì)菌劑10倍稀釋液拮抗性的影響最小，抑菌率為23.85%，較CK降低了16.94%（圖2-a）。如圖2-b和2-c所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，各處理的抑菌率進(jìn)一步提高，但相同時(shí)間內(nèi)的增幅逐漸減小，抑菌率與CK的差距縮小。至96 h時(shí)，除CK和阿魏酸，各菌劑不同稀釋倍數(shù)處理間的抑菌率差異不顯著。CK3組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于50和100倍稀釋液。阿魏酸組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于100倍稀釋液。
圖2 不同酚酸處理下不同稀釋倍數(shù)菌劑對(duì)FON的抑制率
3 結(jié)論與討論
3.1 不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響不同
土壤中的酚酸類物質(zhì)多源于植物的根系代謝分泌和植株殘?bào)w分解，其中多種酚酸處于一定濃度范圍可促進(jìn)FON的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[11]，同時(shí)考慮到耕作層土壤中單一酚酸濃度多處于較低水平，故本試驗(yàn)采用的酚酸質(zhì)量濃度為10~50 mg/L。郝文雅等[11]研究酚酸類物質(zhì)對(duì)FON的影響，認(rèn)為阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸對(duì)FON孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢具有促進(jìn)作用，且阿魏酸的促進(jìn)作用較為突出。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10~50 mg/L的鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)FON菌落的生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用。培養(yǎng)初期50 mg/L酚酸處理的菌落直徑顯著大于低質(zhì)量濃度處理，且阿魏酸對(duì)FON菌落的促生長(zhǎng)作用顯著低于其他酚酸。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，酚酸類物質(zhì)作為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物可被微生物所消耗[19]，培養(yǎng)至96 h時(shí)，該試驗(yàn)環(huán)境中部分酚酸可能已被降解，各處理的FON菌落直徑無(wú)顯著差異。
3.2 不同酚酸對(duì)拮抗菌菌落生長(zhǎng)的影響不同
試驗(yàn)采用細(xì)菌型生防菌劑。由于細(xì)菌的最適pH值范圍一般為弱堿性，故外源添加酚酸造成環(huán)境pH值降低，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)均具有抑制作用，至72、96 h時(shí)已無(wú)顯著差異。培養(yǎng)至96 h，阿魏酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用最低。值得注意的是，較高質(zhì)量濃度的混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用處于最高水平（除鄰苯二甲酸對(duì)菌劑10倍稀釋液處理外），這說(shuō)明混合酚酸較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。土壤中共存多種酚酸類物質(zhì)，且連作土壤的酚酸含量高于非連作土壤[20]，因此連作土壤中酚酸的積累必然影響生防細(xì)菌的生物活性。
3.3 不同酚酸對(duì)菌劑拮抗FON能力的影響不同
生防菌劑中拮抗菌的數(shù)量與稀釋倍數(shù)成反比，因此無(wú)論環(huán)境中是否有酚酸，抑菌率均隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小。外源添加一定質(zhì)量濃度的酚酸類物質(zhì)，對(duì)FON和生防細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)分別具有顯著促進(jìn)作用和抑制作用，導(dǎo)致生防菌劑對(duì)FON的抑菌率顯著降低。在培養(yǎng)初期（48 h），環(huán)境中的酚酸含量較高，抑菌率顯著下降，最高降幅達(dá)28.19%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，可能由于環(huán)境中的酚酸逐漸被菌體消耗，質(zhì)量濃度下降，其對(duì)抑菌率的影響也逐漸減小，直到與CK無(wú)顯著性差異。至培養(yǎng)后期（96 h），阿魏酸對(duì)FON的促生長(zhǎng)作用及其對(duì)生防菌生長(zhǎng)的抑制作用均為最弱，故不同稀釋倍數(shù)菌劑的抑菌率差異較大，與CK相似。一般而言，有機(jī)酸分子量越大，越不易被降解。阿魏酸是試驗(yàn)中分子量最大的酚酸，可能由此導(dǎo)致其對(duì)微生物的作用較弱。值得關(guān)注的是，混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，但在生防細(xì)菌與FON對(duì)峙培養(yǎng)的初期，雖然顯著降低了生防細(xì)菌的抑菌率，但對(duì)其影響的強(qiáng)度卻不及其他酚酸處理?？赡苁怯捎诓煌铀嶂g的互作效應(yīng)不同[13]，以及微生物對(duì)各種酚酸的敏感度和代謝差異導(dǎo)致了該結(jié)果。
鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)FON的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，對(duì)其生防細(xì)菌的生物活性具有抑制作用，從而導(dǎo)致酚酸環(huán)境中生防細(xì)菌對(duì)FON的拮抗性下降，且菌劑稀釋倍數(shù)越大，受酚酸影響越嚴(yán)重，下降幅度越大?；旌戏铀釋?duì)生防細(xì)菌的抑制作用較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸更強(qiáng)。因此，在酚酸積累的環(huán)境如連作土壤或基質(zhì)中施用細(xì)菌型生防菌劑，應(yīng)適當(dāng)降低菌劑的稀釋倍數(shù)，有利于生防菌株對(duì)病原菌的拮抗性保持在較高水平。
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西瓜連作可導(dǎo)致土壤物理、化學(xué)和生物性質(zhì)發(fā)生變化，生產(chǎn)性能降低，還會(huì)引起土壤真菌化，尤其引起病原真菌數(shù)量增加，致使西瓜開花坐果后易發(fā)生枯萎病，造成西瓜產(chǎn)量、品質(zhì)下降，甚至絕收，產(chǎn)生嚴(yán)重的連作障礙[1]，而且枯萎病發(fā)病率有隨連作年限增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)[2]。西瓜枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON），尤以溫室栽培和大棚種植環(huán)境易發(fā)病。
連作可導(dǎo)致作物根系分泌物在土壤中積累，分泌物達(dá)到一定濃度后會(huì)對(duì)植株產(chǎn)生毒害作用，這是引起連作障礙的主要因素之一[3—4]。其中，酚酸類物質(zhì)作為重要的化感物質(zhì)，一方面會(huì)降低土壤中某些養(yǎng)分的含量[5]，影響土壤中多種酶的活性[6]；另一方面會(huì)改變土壤微生物區(qū)系[7]。有研究表明，土壤酚酸的種類、濃度及無(wú)機(jī)養(yǎng)分與土壤微生物類群分布存在一定關(guān)系[8]。土壤中酚酸的累積可直接影響土壤的理化性質(zhì)，從而使土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、生物量和活性發(fā)生改變，某些種類的微生物在數(shù)量及活性上顯著增加或趨于增長(zhǎng)，同時(shí)另一些微生物則呈下降趨勢(shì)[9—10]。西瓜根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)對(duì)FON產(chǎn)孢、萌發(fā)及生長(zhǎng)往往具有“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”的作用規(guī)律，而水稻根系分泌物及其中的酚酸物質(zhì)則抑制FON產(chǎn)孢及萌發(fā)[11]。有研究表明，連作土壤中并存著多種酚酸類物質(zhì)，且酚酸類物質(zhì)之間存在互作效應(yīng)[12]。如不同濃度水平的水楊酸分別對(duì)對(duì)羥基苯甲酸表現(xiàn)增效和拮抗作用。因此，連作環(huán)境中由酚酸物質(zhì)導(dǎo)致的化感作用是多種酚酸物質(zhì)共同作用的結(jié)果[13]。
將生防微生物引入綜合防控系統(tǒng)是重要且有效的方法之一[14]。目前，已獲得若干拮抗FON的菌株，并經(jīng)室內(nèi)試驗(yàn)證明其對(duì)病原菌具有不同程度的拮抗作用[15—16]，部分菌株在田間的試驗(yàn)也表現(xiàn)出較好的防效[17]。然而，筆者在應(yīng)用菌劑中遇到了二個(gè)問(wèn)題，一是某些生防菌株在室內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中具有較高抑菌率，而田間防效卻不盡如人意；二是相同生防菌劑在不同土壤環(huán)境中使用，防效具有差異。土壤微生物的生存及活性極易受環(huán)境因子的影響[18]。連作土壤中的酚酸類物質(zhì)與植株健康生長(zhǎng)和土壤病原菌數(shù)量變化存在一定關(guān)系，但其對(duì)病原菌的拮抗菌及其功能的影響至今未見報(bào)道。本試驗(yàn)在添加不同濃度鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的條件下，比較FON和生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的情況，并通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)，研究不同外源酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON性能的影響，以期為生防菌劑的應(yīng)用研究提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1.1.1供試病原菌 西瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporumf.sp.niveum，F(xiàn)ON）菌株由寧夏大學(xué)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境教研室提供。
1.1.2供試拮抗菌 供試拮抗菌為商品菌劑，購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)資市場(chǎng)。含單一細(xì)菌-解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），有效活菌數(shù)500×108CFU/mL。
1.1.3培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基用于病原菌的培養(yǎng)和對(duì)峙試驗(yàn)。
1.1.4試劑 供試鄰苯二甲酸由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，對(duì)羥基苯甲酸和肉桂酸由北京索萊寶科技有限公司提供，阿魏酸由北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1病原菌活化與菌碟制備 在直徑為9.0 cm的PDA平板中央點(diǎn)接少量FON斜面培養(yǎng)物，28℃、相對(duì)濕度60%，倒置培養(yǎng)5~6 d，待菌落基本長(zhǎng)滿平皿，于距平皿中心2.0 cm處用無(wú)菌打孔器打取直徑0.5 cm、菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)一致的菌碟備用。
1.2.2拮抗細(xì)菌對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響 以無(wú)菌水制備菌劑10倍、50倍和100倍稀釋液，室溫下?lián)u床振蕩混勻30 min，制成菌懸液。在PDA平板中央放置1個(gè)FON菌碟，以菌碟為中心距其邊緣2.0 cm處以十字對(duì)稱方式放置4個(gè)無(wú)菌牛津杯，每個(gè)杯中注入同一稀釋倍數(shù)菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)24 h。此時(shí)菌懸液中大部分水分已蒸發(fā)，取走牛津杯，持續(xù)培養(yǎng)并于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。在牛津杯內(nèi)注入120μL無(wú)菌水作為空白對(duì)照。每處理設(shè)5次重復(fù)。抑菌率計(jì)算公式：抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理后菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。
1.2.3不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響 用無(wú)菌水制備質(zhì)量濃度為10、30和50 mg/L的鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸試劑，混合酚酸試劑中鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和肉桂酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)各占1/4。取酚酸試劑0.1 mL置于PDA培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌三角棒均勻涂抹，靜置2~3 min，待其滲入培養(yǎng)基，制成酚酸平板。于酚酸平板中央放置1個(gè)FON菌碟，28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK1）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.2.4不同酚酸對(duì)拮抗細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的影響 在酚酸平板中央?yún)^(qū)放置2個(gè)無(wú)菌牛津杯，二者相距4.0 cm，每個(gè)杯中注入同種菌劑的100倍稀釋液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。以培養(yǎng)基上加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK2）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.2.5不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON的影響 用30 mg/L的5種酚酸試劑制備相應(yīng)的酚酸平板，方法同1.2.3。于酚酸平板中央放置1個(gè)FON菌碟，以菌碟為中心距其2.0 cm處以十字對(duì)稱方式分別放置4個(gè)無(wú)菌牛津杯，每個(gè)杯中注入同一稀釋倍數(shù)的菌懸液120μL，28℃恒溫培養(yǎng)，至24 h取走牛津杯，分別于48、72和96 h時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況，測(cè)量FON菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)，以無(wú)菌水代替酚酸和菌劑為絕對(duì)對(duì)照，計(jì)算抑菌率。以培養(yǎng)基表面加0.1 mL無(wú)菌水代替酚酸試劑為空白對(duì)照（CK3）。每處理設(shè)5次重復(fù)。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用microsoft excel 2010處理及制作圖表；方差分析采用SPSS；利用LSD法在P＜0.05水平上進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。
2 結(jié)果與分析
2.1 拮抗細(xì)菌對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響
由圖1可知，供試菌劑對(duì)FON具有拮抗作用，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增大而降低。培養(yǎng)48、72和96 h時(shí)，與10倍稀釋液的抑菌率比較，菌劑50倍稀釋液的抑菌率分別降低3.62%、2.98%和1.02%，100倍稀釋液的抑菌率分別降低6.72%、3.64%和1.28%。這說(shuō)明菌劑對(duì)病原菌的抑制率隨稀釋倍數(shù)增加而減小，稀釋10倍處理的抑菌率顯著高于稀釋100倍處理；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，各稀釋倍數(shù)處理間抑菌率的差異呈降低趨勢(shì)。
圖1 不同稀釋倍數(shù)的拮抗菌劑對(duì)FON的抑菌率
2.2 不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響
由表1可知，在試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同酚酸處理均對(duì)FON菌落生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且該作用隨酚酸質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，不同酚酸對(duì)FON菌落直徑的促進(jìn)作用發(fā)生了變化。50 mg/L不同酚酸處理對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的促進(jìn)作用如下：培養(yǎng)48 h時(shí)由強(qiáng)到弱依次為鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別增加了3.74%、3.54%、2.77%、2.36%和2.21%；培養(yǎng)72 h時(shí)強(qiáng)弱依次為混合酚酸、阿魏酸、肉桂酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸；培養(yǎng)96 h時(shí)強(qiáng)弱依次為肉桂酸、混合酚酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、阿魏酸。培養(yǎng)48 h，同一酚酸組中50 mg/L處理對(duì)菌落直徑的促進(jìn)作用顯著高于10 mg/L處理，鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、混合酚酸、阿魏酸和肉桂酸的增幅分別為2.95%、2.18%、1.88%、1.79%和0.81%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，該差異逐漸縮小，至96 h時(shí)差異無(wú)顯著性。
表1 不同酚酸對(duì)FON菌落直徑的影響
2.3 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的影響
拮抗菌株是生防菌劑的核心成分，作為微生物活體，其生長(zhǎng)受到不同酚酸的影響。如表2所示，不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，抑制強(qiáng)度因酚酸種類而不同，并隨著酚酸質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。50 mg/L不同外源酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用如下：培養(yǎng)48 h時(shí)由強(qiáng)到弱依次為鄰苯二甲酸、混合酚酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸，菌落直徑較CK分別減少了18.82%、18.68%、17.24%、16.71%和15.13%；培養(yǎng)72和96 h時(shí)強(qiáng)弱依次為混合酚酸、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸、阿魏酸。培養(yǎng)初期，50 mg/L鄰苯二甲酸、肉桂酸和混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落直徑的抑制作用顯著高于10 mg/L相應(yīng)酚酸處理，培養(yǎng)時(shí)間至72、96 h差異幅度縮減至無(wú)顯著性。50 mg/L混合酚酸處理的菌落直徑均為各組最低水平，48、72和96 h菌落直徑與CK相比降幅為18.68%、14.64%和14.64%。
表2 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落直徑的影響
2.4 不同酚酸對(duì)生防細(xì)菌拮抗FON的影響
由圖2可知，在外源酚酸環(huán)境中，生防細(xì)菌仍對(duì)FON表現(xiàn)出拮抗性，抑菌率隨著菌劑稀釋倍數(shù)的增加而降低。添加不同酚酸顯著降低菌劑對(duì)FON的抑菌率，48 h時(shí)與CK比較，不同酚酸處理下菌劑的10、50和100倍稀釋液的抑菌率分別下降16.94%~21.23%、18.27%~25.32%和23.79%~28.19%。30 mg/L酚酸處理下，肉桂酸對(duì)菌劑100倍稀釋液拮抗性的影響最大，抑菌率僅為19.23%，較CK降低了28.19%；混合酚酸對(duì)菌劑10倍稀釋液拮抗性的影響最小，抑菌率為23.85%，較CK降低了16.94%（圖2-a）。如圖2-b和2-c所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，各處理的抑菌率進(jìn)一步提高，但相同時(shí)間內(nèi)的增幅逐漸減小，抑菌率與CK的差距縮小。至96 h時(shí)，除CK和阿魏酸，各菌劑不同稀釋倍數(shù)處理間的抑菌率差異不顯著。CK3組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于50和100倍稀釋液。阿魏酸組10倍稀釋液的抑菌率始終顯著高于100倍稀釋液。
圖2 不同酚酸處理下不同稀釋倍數(shù)菌劑對(duì)FON的抑制率
3 結(jié)論與討論
3.1 不同酚酸對(duì)FON菌落生長(zhǎng)的影響不同
土壤中的酚酸類物質(zhì)多源于植物的根系代謝分泌和植株殘?bào)w分解，其中多種酚酸處于一定濃度范圍可促進(jìn)FON的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢[11]，同時(shí)考慮到耕作層土壤中單一酚酸濃度多處于較低水平，故本試驗(yàn)采用的酚酸質(zhì)量濃度為10~50 mg/L。郝文雅等[11]研究酚酸類物質(zhì)對(duì)FON的影響，認(rèn)為阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸對(duì)FON孢子萌發(fā)、產(chǎn)孢具有促進(jìn)作用，且阿魏酸的促進(jìn)作用較為突出。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10~50 mg/L的鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)FON菌落的生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用。培養(yǎng)初期50 mg/L酚酸處理的菌落直徑顯著大于低質(zhì)量濃度處理，且阿魏酸對(duì)FON菌落的促生長(zhǎng)作用顯著低于其他酚酸。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，酚酸類物質(zhì)作為有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物可被微生物所消耗[19]，培養(yǎng)至96 h時(shí)，該試驗(yàn)環(huán)境中部分酚酸可能已被降解，各處理的FON菌落直徑無(wú)顯著差異。
3.2 不同酚酸對(duì)拮抗菌菌落生長(zhǎng)的影響不同
試驗(yàn)采用細(xì)菌型生防菌劑。由于細(xì)菌的最適pH值范圍一般為弱堿性，故外源添加酚酸造成環(huán)境pH值降低，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)均具有抑制作用，至72、96 h時(shí)已無(wú)顯著差異。培養(yǎng)至96 h，阿魏酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用最低。值得注意的是，較高質(zhì)量濃度的混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌菌落生長(zhǎng)的抑制作用處于最高水平（除鄰苯二甲酸對(duì)菌劑10倍稀釋液處理外），這說(shuō)明混合酚酸較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。土壤中共存多種酚酸類物質(zhì)，且連作土壤的酚酸含量高于非連作土壤[20]，因此連作土壤中酚酸的積累必然影響生防細(xì)菌的生物活性。
3.3 不同酚酸對(duì)菌劑拮抗FON能力的影響不同
生防菌劑中拮抗菌的數(shù)量與稀釋倍數(shù)成反比，因此無(wú)論環(huán)境中是否有酚酸，抑菌率均隨著稀釋倍數(shù)的增加而減小。外源添加一定質(zhì)量濃度的酚酸類物質(zhì)，對(duì)FON和生防細(xì)菌菌落的生長(zhǎng)分別具有顯著促進(jìn)作用和抑制作用，導(dǎo)致生防菌劑對(duì)FON的抑菌率顯著降低。在培養(yǎng)初期（48 h），環(huán)境中的酚酸含量較高，抑菌率顯著下降，最高降幅達(dá)28.19%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，可能由于環(huán)境中的酚酸逐漸被菌體消耗，質(zhì)量濃度下降，其對(duì)抑菌率的影響也逐漸減小，直到與CK無(wú)顯著性差異。至培養(yǎng)后期（96 h），阿魏酸對(duì)FON的促生長(zhǎng)作用及其對(duì)生防菌生長(zhǎng)的抑制作用均為最弱，故不同稀釋倍數(shù)菌劑的抑菌率差異較大，與CK相似。一般而言，有機(jī)酸分子量越大，越不易被降解。阿魏酸是試驗(yàn)中分子量最大的酚酸，可能由此導(dǎo)致其對(duì)微生物的作用較弱。值得關(guān)注的是，混合酚酸對(duì)生防細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，但在生防細(xì)菌與FON對(duì)峙培養(yǎng)的初期，雖然顯著降低了生防細(xì)菌的抑菌率，但對(duì)其影響的強(qiáng)度卻不及其他酚酸處理?？赡苁怯捎诓煌铀嶂g的互作效應(yīng)不同[13]，以及微生物對(duì)各種酚酸的敏感度和代謝差異導(dǎo)致了該結(jié)果。
鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸及4種酚酸的混合物對(duì)FON的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，對(duì)其生防細(xì)菌的生物活性具有抑制作用，從而導(dǎo)致酚酸環(huán)境中生防細(xì)菌對(duì)FON的拮抗性下降，且菌劑稀釋倍數(shù)越大，受酚酸影響越嚴(yán)重，下降幅度越大?；旌戏铀釋?duì)生防細(xì)菌的抑制作用較相同質(zhì)量濃度的單一酚酸更強(qiáng)。因此，在酚酸積累的環(huán)境如連作土壤或基質(zhì)中施用細(xì)菌型生防菌劑，應(yīng)適當(dāng)降低菌劑的稀釋倍數(shù)，有利于生防菌株對(duì)病原菌的拮抗性保持在較高水平。
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