王曉玲 李慶飛 原讓花 王夢夢 肖艷 董彥琪 常懷成 張倩倩

摘要：探求大白菜 CMS 不育類型及發(fā)生的時期、特點，利用 PCR 擴(kuò)增方法鑒定 CMS 的類型，并采用石蠟切片的方法觀察花蕾不同長度時花藥的發(fā)育情況。結(jié)果表明，I 晉毛不育系、II 苔不育系為 Polima 型雄性不育系類型，III紫不育系為 Ogura 型雄性不育系類型;保持系花粉皆正常發(fā)育，I 晉毛不育系花蕾在長度小于等于 1 mm 時就明顯觀察到花藥發(fā)育異常，II 苔不育系和 III 紫不育系可以形成花粉囊但大多呈現(xiàn)畸形，在后期花藥內(nèi)出現(xiàn)多藥隔、無藥隔或花粉粘連在一起使其無法進(jìn)行正常散粉。綜上，3 種 CMS 不育系皆不屬于 nap 型雄性不育系;花蕾中花粉敗育的時期很早，當(dāng) L≤1 mm 時就決定了花藥能否形成花粉囊產(chǎn)生花藥。本研究為利用 CMS 不育系培育新品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜;CMS;類型鑒定;石蠟切片;花粉;細(xì)胞學(xué)觀察

中圖分類號：S634.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-2871（2022）03-021-05

Abstract：In order to exam the sterility type， sterility onsetting time and sterility characteristics of CMS Chinese cabbagelines， PCR amplification and paraffin section of flower buds were conducted in this experiment. The results showed thatJinmao I male sterile line and Tai II male sterile lines were Polima type male sterile， and Purple III male sterile line wasOgura type male sterile. The pollen of maintainer lines developed normally. Abnormal anther development was observedwhen the flower bud of Jinmao male sterile line reached less than or equal to 1mm. Pollen sacs were formed in Tai II malesterile line and Purple III male sterile line， but most of them showed deformity. In the later stage the pollen sac had multi ple septa， no septum or pollen adhered together， so that pollen grains could not disperse normally. These results suggestthat three CMS male sterile lines evaluated in this experiment do not belong to nap type male sterile. The pollen abortioninitiated at very early stage of flower development， flower bud less than or equal to 1mm. Our discoveries provided afoundation for new Chinese cabbage CMS male sterile line development.

Key words：Chinese cabbages; Cytoplasmic male sterility; Type identification; Paraffin section; Anthers; Cytologicalobservation.

在十字花科作物大白菜的雜交優(yōu)勢育種中，利用其雄性不育系雜交育種是一條非常重要的途徑[1-2]。雄性不育性在高等植物中普遍存在，雄性不育可以分為細(xì)胞質(zhì)不育型、細(xì)胞核不育型和核質(zhì)互作不育型3種類型[3]。由于大白菜資源中沒有細(xì)胞質(zhì)雄性不育源，生產(chǎn)中使用的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系均來源于異源細(xì)胞質(zhì)[4]。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系主要有3種類型：蘿卜 Ogura CMS、甘藍(lán)型油菜 Polima CMS和甘藍(lán)型油菜nap CMS[5]。雄性不育系的花粉由于受多種因素的影響，花粉不能正常的發(fā)育或者沒有生活力，雄蕊的敗育會因品種或類型的不同而有所差異[6]，不同大白菜材料的CMS和保持系的線粒體DNA的RFLP、RAPD和AFLP呈多態(tài)性，CMS和保持系的線粒體基因組結(jié)構(gòu)也存在著顯著差異[7]。產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的分子機(jī)制主要有兩種：一是線粒體 DNA 產(chǎn)生新的閱讀框（open reading frag-ment，ORF），產(chǎn)生有毒的蛋白，從而影響到線粒體的正常功能;二是與線粒體雄性不育有關(guān)的基因與正常線粒體基因重組或共表達(dá)，直接或間接影響正?；虻墓δ?，產(chǎn)生雄性不育。如在Ogura型蘿卜中發(fā)現(xiàn)的orf138、nap甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)的orf222、Po lima 型油菜中發(fā)現(xiàn)的 orf224、葉用芥菜中發(fā)現(xiàn)的orf220等都是在不育系材料中發(fā)現(xiàn)的與不育性相關(guān)的開放閱讀框。

細(xì)胞和組織在離開機(jī)體后很快會發(fā)生溶解和腐敗，很難維持它原有的形態(tài)和結(jié)構(gòu)[8-9]，因此，通過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、染色等步驟制作石蠟切片可免使細(xì)胞組織死去，以便于后期進(jìn)行觀察分析[10]。

本試驗在以往研究的基礎(chǔ)上，探求大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生的時期及其特點，對現(xiàn)有的不育系材料進(jìn)行鑒定分類和細(xì)胞學(xué)觀察。采用同源序列基因擴(kuò)增技術(shù)，依據(jù)與細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的線粒體嵌合基因orf224、orf138、orf222設(shè)計出3對引物， 對3種大白菜花蕾粒線粒體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得差異片段，并通過電泳試驗對大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的類型進(jìn)行鑒定;繼而采用石蠟切片的方法，用光學(xué)顯微鏡觀察花蕾在不同長度時花藥的發(fā)育程度。為細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在大白菜新品種選育中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采用3個不育系及相對應(yīng)的保持系（表1）。

1.2 器材與試劑

器材：光學(xué)顯微鏡、真空抽氣機(jī)、恒溫箱、蠟片切片機(jī)、相機(jī)、溫臺、展片臺、蠟杯、酒精燈、載玻片、蓋玻片、毛筆。

試劑：FAA固定液、乙醇溶液、醋酸、二甲苯、甲醛、伊紅、粘片劑、石蠟、染色液（固綠、番紅）、加拿大樹膠。

1.3 方法

于2019 年 12 月 10 日進(jìn)行冬季育苗，2020 年 2 月25日定植于大棚，每份材料種植40株，2020年4 月20日在新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研發(fā)中心試驗大棚進(jìn)行采樣，并在此研發(fā)中心實驗室進(jìn)行室內(nèi)試驗。采樣前注意先將塑料袋和鑷子在液氮中預(yù)冷，用鑷子將大白菜花蕾粒輕輕采下放入采樣袋中。根據(jù)試驗田種植的材料，取配對的3個不育源，3個與其對應(yīng)的保持系。在種植的植株上，完全隨機(jī)選擇花序，每個材料取頂部花蕾3～6個，取樣完畢后將樣品放入液氮罐中，于超低溫冰箱-80 ℃冷凍儲存。不育系類型的鑒定和細(xì)胞學(xué)觀察于河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院分子實驗室進(jìn)行，采用混合樣，無重復(fù)。

1.3.1 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系類型的鑒定 在NCBI中檢索的細(xì)胞質(zhì)雄性不育有關(guān)的線粒體嵌合基因 orf224（DQ400846.1 ）、orf138、orf222，利用生物學(xué)軟件primer5軟件設(shè)計出3對引物，由上海生物技術(shù)生物工程有限公司進(jìn)行合成。使用改進(jìn)的CTAB方法[11]分別提取6個大白菜花蕾粒樣本花蕾DNA;并對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定其細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育類型。

1.3.2 大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的細(xì)胞學(xué)觀察 于2020 年 5 月 6 日 9：00—10：00 采取長度分別為（L≤ 1 mm、1 mmm<L≤2 mm、2 mm<L≤3 mm，L代表花蕾的長度）新鮮大白菜花蕾，此時植物細(xì)胞分裂活動明顯，取材效果最好。為了維持大白菜細(xì)胞的自然狀態(tài)，使形態(tài)和結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，取材后參照段國祿等的固定方法馬上進(jìn)行固定，參考何艷艷、張寶華 的 方 法 制 作 石 蠟 切 片 [12- 14]。 在 光 學(xué) 顯 微 鏡（XSP-8C，上海精密儀器儀表有限公司）下觀察切片，并進(jìn)行拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計結(jié)果

從 NCBI 獲得線粒體嵌合基因 orf138、orf224、orf222的序列，并通過Primer 5軟件設(shè)計引物（表2）。

2.2 CMS類型的鑒定

用設(shè)計的 orf138 引物、orf224 引物和 orf222 引物對3個大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的6份花蕾粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果如圖1所示，orf138引物擴(kuò)增出的條帶2清晰可見，即Ⅲ（紫不育系）為Ogura 型雄性不育系類型，ⅢB 為紫保持系;orf224引物擴(kuò)增出的條帶4和條帶6很清晰，即Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）為Polima型雄性不育系類型;條帶5（ⅡB）、條帶7（ⅠB）分別為苔保持系、晉毛保持系。orf222引物未擴(kuò)增出條帶，說明Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）、Ⅲ（紫不育系）都不屬于nap型雄性不育系類型;orf224、orf138和orf222對保持系材料擴(kuò)增條帶均不清晰，即基因序列中沒有與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的開放閱讀框序列。試驗結(jié)果表明：Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）為Polima型雄性不育系類型，Ⅲ（紫不育系）為Ogura型雄性不育系類型;Ⅰ（晉毛不育系）、Ⅱ（苔不育系）、Ⅲ（紫不育系）都不屬于nap型雄性不育系類型。

2.3 保持系材料和不育系材料花藥發(fā)育的特點

大白菜正常的花藥由4個藥室組成，藥室由外到內(nèi)分別是表皮、纖維層、中層、絨氈層。絨氈層呈長方形規(guī)則緊密地排列在藥室最里層，主要為花粉母細(xì)胞提供營養(yǎng)，隨著花粉發(fā)育會逐漸降解，花藥同一側(cè) 2 個相鄰小孢子囊之間的組織也會逐漸消失，打通變成1個藥室。通過切片觀察，可以看到保持系材料 IB 晉毛保持系、IIB 苔保持系和 IIIB 紫保持系的花藥在各個時期都發(fā)育正常（圖2～4）。

大白菜CMS不育主要是雄蕊發(fā)育不正常，不能產(chǎn)生可育的花粉。通過切片觀察可以看到，不育系材料中大多在花蕾長度≤1 mm時就可以明顯看到差異，而后期本該形成藥室的地方只存在大量薄壁細(xì)胞。個別藥室可以形成花粉囊產(chǎn)生花粉，但在后期因花粉延遲發(fā)育或粘連在一起無法正常散粉。此外，還出現(xiàn)個別花藥有多藥隔、無藥隔情況（圖2～4）。

2.4 保持系材料和不育系材料花藥發(fā)育的區(qū)別

根據(jù)對保持系材料與不育材料花藥切片的細(xì)胞學(xué)觀察，在花蕾長度小于等于1 mm時，保持系材料 IB 晉毛保持系（圖 2-2）、IIB 苔保持系（圖 3-2）、IIIB紫保持系（圖4-2）在花蕾的橫切面上，可見1個雌蕊和4個雄蕊，花藥呈蝶形，4個藥室已經(jīng)形成，可以看見絨粘層在花粉囊內(nèi)染色較深，且維管束和花粉囊內(nèi)細(xì)胞均被染色。而I晉毛不育系（圖2-1）和II苔不育系（圖3-1）的4個花粉室尚未形成，III紫不育系（圖4-1）可以看見有花粉囊的形成，但染色較淺，沒有產(chǎn)生明顯的花藥。

當(dāng)花蕾長度為 1 mm<L≤2 mm時，保持系材料花藥中藥室、藥隔更加清晰，絨粘層整齊的排列在小孢子囊母細(xì)胞的周圍，可以看見清楚的藥室由外到內(nèi)分別為表皮、藥室的內(nèi)壁、中層、絨氈層（圖 2-4，3-4，4-4）。但不育系I晉毛不育系（圖2-3）和II苔不育系（圖 3-3）在這個時期仍然沒有形成花粉囊，III紫不育系雖然有花粉囊的形成，但花粉囊內(nèi)的花粉較少，個別花藥內(nèi)不能正常形成4個藥室，還有個別花粉囊內(nèi)絨氈層膨大而擠壓小孢子形成一條縫隙，造成小孢子發(fā)育不良，呈現(xiàn)敗育的現(xiàn)象（圖 4-3）。當(dāng)花蕾長度為2 mm <L≤3 mm時，保持系材料孢間層逐漸溶解，細(xì)胞逐漸分開，變成圓球形，個別細(xì)胞呈四邊體形，著色較深（圖2-6，3-6，4-6）。不育系材料I晉毛不育系雌蕊發(fā)育正常，從此時雌蕊發(fā)育的程度以及IB晉毛保持系的發(fā)育程度來看，花粉發(fā)育應(yīng)該和它的保持系發(fā)育一樣，但此時I晉毛不育系仍然沒有藥室形成，細(xì)胞呈半透明狀，是典型的無花粉囊（圖2-5）。II苔不育系發(fā)育較晚，只有角隅處可以形成2～3個藥室，而且花蕾橫切面不能呈正常的蝶形（圖3-5）。而可以觀察到III紫不育系花粉囊內(nèi)的細(xì)胞染色較淺，花粉囊內(nèi)的花粉粘連無法形成單個的圓形花粉粒，個別出現(xiàn)無藥隔的現(xiàn)象（圖4-5）。

3 討論與結(jié)論

近20年來，在大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育性研究方面，已報道有 Ogura CMS、Polima CMS 和 nap CMS等多種細(xì)胞質(zhì)雄性不育系類型。Polima CMS是最有生產(chǎn)價值的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，不僅在大白菜CMS不育系的選育中被廣泛利用，而且在其他十字花科作物雄性不育系的選育中也被廣泛應(yīng)用[15]。2005 年趙利民[16]建立了一套大白菜新品種灰色關(guān)聯(lián)度多維綜合評判方法，為客觀、準(zhǔn)確地從眾多大白菜組合中篩選出優(yōu)良新品種提供了科學(xué)依據(jù)，提高了新品種選育的準(zhǔn)確性和選擇效率。2018 年崔冰等[18]對大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育形成的機(jī)制進(jìn)行研究。2020 年楊紅麗等[19]培育出耐熱抗根腫病蘿卜胞質(zhì)雄性不育多基因聚合新品種。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，準(zhǔn)確快速鑒定樣本所歸屬的雄性不育系的類型，以便為開展細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并為實現(xiàn)大白菜優(yōu)勢雜交育種提供分子依據(jù)。筆者對 6 個大白菜材料 CMS 的不育類型進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中Ⅰ晉毛不育系、Ⅱ苔不育系為Polima 型雄性不育系類型;Ⅲ紫不育系為 Ogura 型雄性不育系類型;因其基因序列中沒有與本試驗CMS 不育相關(guān)的開放閱讀框序列 ，所以 orf224、orf138和orf222引物均未擴(kuò)增出清晰條帶。

通過石蠟切片法進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)本試驗中大白菜保持系花藥均發(fā)育正常，可以形成4個蝶形藥室從而產(chǎn)生可育的花粉。I晉毛不育系與可育材料IB晉毛保持系比較，I 晉毛不育系的敗育花藥一直處于孢原細(xì)胞之前，在整個時期內(nèi)都沒有形成花粉囊，屬于典型的無花粉囊型敗育，它的藥室異常出現(xiàn)較早，當(dāng)花蕾長度為L≤1 mm時差異顯著;II苔不育系藥室異常出現(xiàn)較晚，在花蕾長度為 1～2 mm 時還未形成花粉囊，發(fā)育較晚，在花蕾長度為2～3 mm時只有2～3個花粉囊可以形成，且花藥畸形，無法形成正常的蝶形藥室，個別花藥內(nèi)還出現(xiàn)多藥隔現(xiàn)象;III紫不育系，在后期可以明顯地觀察到不育系花粉囊內(nèi)的花粉因相互粘連無法形成單個的花粉粒。2016 年郭瑛琪等[19]大白菜核不育花藥敗育起始于減數(shù)分裂期絨氈層結(jié)構(gòu)異常，小孢子在四分體時期開始敗育;不育發(fā)生后，伴隨著絨氈層細(xì)胞異常膨大，嚴(yán)重空泡化，提前降解，小孢子變形干癟而死亡。2012 年許明等[20]研究表明不育花蕾長度在2.5 mm后就已經(jīng)敗育，敗育時期可能發(fā)生在減數(shù)分裂后期到四分體時期。本試驗與其研究結(jié)論一致，花蕾中花粉敗育的時期較早，當(dāng)L≤1 mm時，它就決定了花藥能否形成花粉囊從而產(chǎn)生花藥。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫昊.橘紅心大白菜細(xì)胞質(zhì)不育系的選育與評價[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[2] 閆世江，張繼寧，劉潔.雄性不育在蔬菜雜交育種上的應(yīng)用[J].蔬菜，2011（10）：44-47.

[3] 袁鶴.大白菜雄性核不育的細(xì)胞學(xué)觀察及基因定位和 AFLP分子標(biāo)記[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[4] 張文翔.白菜薹細(xì)胞核雄性不育基因的定位[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[5] 陳燁麗，陳學(xué)好，陳錦秀，等.甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型的分子鑒定[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（3）：19-22.

[6] 龍歡，姚家玲，涂金星.3 種甘藍(lán)型油菜雄性不育系花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，24（6）：570- 575.

[7] 李澤福，夏加發(fā)，唐光勇.植物雄性不育類型及其遺傳機(jī)制的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28（6）：742-746.

[8] 陳土娟，黃子娟，潘海玉，等.茴香成熟葉柄石蠟切片技術(shù)的研究[J].韶關(guān)學(xué)院學(xué)報，2014，35（12）：41-45.

[9] 程圓.三種不育源烏菜轉(zhuǎn)育后代生理生化及其花藥細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[10] 王金平，張俊梅.白頭翁花的石蠟切片制作[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，21（4）：573-576.

[11] 李榮華，夏巖石，劉順枝，等.改進(jìn)的 CTAB 提取植物 DNA 方 法[J].實驗室研究與探索，2009，28（9）：14-16.

[12] 段國祿，施江.植物制片、標(biāo)本制作和植物鑒定[M].北京：氣象出版社.2008.

[13] 何艷艷.石蠟制片的方法、技巧與注意事項[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用，2014（4）：54-57.

[14] 張寶華.聚焦植物石蠟切片制作[J].吉林省教育學(xué)院學(xué)報，2013，29（4）：153-154.

[15] 董美云.大白菜溫敏雄性不育的溫敏特性及選育研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[16] 趙利民.大白菜胞質(zhì)雄性不育系選育、利用及采種技術(shù)的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2005.

[17] 崔冰，石紹峻，李鑫，等.大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育研究進(jìn)展[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（3）：154-157.

[18] 楊紅麗，徐學(xué)忠，胡靖鋒，等.耐熱抗根腫病蘿卜胞質(zhì)雄性不育多基因聚合新品種 CHR18003 的選育[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，66（7）：67-70.

[19] 郭瑛琪，崔海芳，李海燕，等.大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育及其細(xì)胞學(xué)觀察[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)），2016，31（3）：427-432.

[20] 許明，鄭鵬婧，張欣，等.大白菜細(xì)胞核雄性不育甲型“兩用系”細(xì)胞學(xué)觀察[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，21（4）：94-98.