紀(jì)程，孫玉香，2，孟圓，2，劉耀斌，2，徐聰，張永春，2，谷益安，汪吉東，2*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部江蘇耕地保育科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095；3.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，南京 211816）

稻麥輪作（夏水稻-冬小麥）是我國(guó)長(zhǎng)江流域的主要種植制度之一，稻麥輪作區(qū)糧食產(chǎn)量占我國(guó)糧食總產(chǎn)量的72%。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平高，該地區(qū)每年產(chǎn)生大量的秸稈，小麥秸稈產(chǎn)量可達(dá)4.5 t?hm，水稻秸稈產(chǎn)量可達(dá)9 t?hm。傳統(tǒng)的秸稈焚燒方式不僅對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，同時(shí)浪費(fèi)了可利用資源。秸稈中富含氮、磷、鉀等養(yǎng)分，相比于為追求作物高產(chǎn)而過(guò)量施用化肥，利用秸稈還田替代或部分替代化肥是一種能夠有效緩解農(nóng)田土壤退化以及實(shí)現(xiàn)培肥地力的措施。研究表明，秸稈還田能夠提高土壤中有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀及其他微量元素的含量并降低土壤容重。微生物是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)者，秸稈還田可促進(jìn)土壤微生物活性和養(yǎng)分分解利用。然而田間環(huán)境復(fù)雜且秸稈降解周期較長(zhǎng)，可能造成短期和長(zhǎng)期秸稈還田試驗(yàn)結(jié)果之間差異較大，本研究擬通過(guò)長(zhǎng)期田間試驗(yàn)探明稻麥輪作體系下秸稈還田對(duì)土壤養(yǎng)分含量及土壤微生物群落的影響。

田間條件下秸稈降解緩慢，未及時(shí)腐解的秸稈極大地影響了下茬作物的種植和生長(zhǎng)。秸稈腐解過(guò)程由土壤微生物主導(dǎo)，例如，CHEN 等發(fā)現(xiàn)玉米秸稈降解時(shí)土壤革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和放線菌的豐度明顯上升。相比于細(xì)菌，真菌不僅能分解秸稈中的易降解組分，還能高效分解難降解組分（如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素）。韋中等以稻稈粉為唯一碳源篩選獲得降解能力較強(qiáng)的兩株真菌和兩株細(xì)菌，兩株真菌分泌的纖維素酶活性是兩株細(xì)菌的5~14 倍。研究表明秸稈降解導(dǎo)致的腐殖質(zhì)大量累積主要依賴真菌對(duì)木質(zhì)素的降解作用。此外，LI 等發(fā)現(xiàn)水稻秸稈腐解過(guò)程中土壤真菌群落多樣性顯著提高，而細(xì)菌群落多樣性基本保持不變。上述結(jié)果表明還田秸稈降解過(guò)程中真菌的分解作用占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。秸稈降解會(huì)導(dǎo)致土壤真菌群落組成發(fā)生改變。例如，秸稈還田能夠顯著提高真菌總量，影響真菌群落多樣性，并改變真菌類群如接合菌門和子囊菌門以及核盤菌屬和隱球菌屬的相對(duì)豐度。針對(duì)秸稈還田對(duì)土壤理化特性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響方面已開展了廣泛研究，但尚不清楚長(zhǎng)期秸稈還田是否能富集秸稈腐解微生物從而加速秸稈降解。

本研究依托稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田試驗(yàn)（10 a），研究土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)秸稈還田的響應(yīng)，并通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，最后通過(guò)埋盆試驗(yàn)探究秸稈還田土壤是否誘導(dǎo)秸稈降解微生物的富集，從而加速后續(xù)還田秸稈的降解。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采自江蘇省典型稻麥輪作種植區(qū)，位于淮安市原種場(chǎng)江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（稻麥）科技綜合示范基地。該地區(qū)受季風(fēng)氣候影響，四季分明，雨量集中，雨熱同季，年平均氣溫為14.4 ℃，年降水量為906~1 007 mm，土壤類型為潮黃土，土壤pH 為8.1，總有機(jī)質(zhì)含量 6.21 g?kg，全氮含量1.23 g?kg，全磷含量0.8 g?kg。每季作物的施肥情況如下：稻季基肥施用375 kg?hm45%復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）和150 kg?hm尿素，追施分蘗肥、促花肥和?；ǚ示鶠?50 kg?hm尿素。麥季基肥施用375 kg?hm45%復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）和150 kg?hm尿素，分蘗期和拔節(jié)期分別追施150 kg?hm尿素。該示范基地自2009 年后每年均實(shí)行稻麥雙季秸稈還田，獲取上一季作物的全量秸稈后，將秸稈機(jī)械粉碎至5~10 cm，再用旋耕機(jī)旋入土壤耕層（0~20 cm）。每年水稻秸稈的還田量約為9 t?hm，小麥秸稈的還田量約為6 t?hm。對(duì)照田塊收獲秸稈后不還田。采樣時(shí)間為2019年8月水稻季，上季麥稈已全量粉碎并用旋耕機(jī)旋入土壤耕層。

分別采集秸稈還田和對(duì)照田塊土壤樣品，每個(gè)處理田塊按單對(duì)角線取樣法選取3 個(gè)小區(qū)（3 個(gè)生物重復(fù)），每個(gè)小區(qū)依據(jù)梅花形布點(diǎn)法各設(shè)5 個(gè)采樣點(diǎn)采集耕層（0~20 cm）土壤，挑除土樣中殘余秸稈、石塊、植物根系等雜質(zhì)，一部分于陰涼處風(fēng)干用以檢測(cè)土壤化學(xué)性質(zhì)，一部分保存在-80 ℃冰箱，用于DNA 提取及后續(xù)擴(kuò)增子MiSeq測(cè)序。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)秸稈還田土壤中微生物群落對(duì)秸稈的降解能力，余下土壤適當(dāng)風(fēng)干后經(jīng)過(guò)篩處理（10目）用于開展秸稈埋盆試驗(yàn)。

1.2 土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定

土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[17-18]。土壤總碳和可溶性有機(jī)碳含量分別利用元素分析儀（Ele?mental, Germany）和總有機(jī)碳分析儀（Shimadzu, Kyo?to,Japan）測(cè)定。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量利用流動(dòng)分析儀（SEAL AutoAnalyzer 3,Germany）測(cè)定，礦物質(zhì)氮含量為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的加和。土壤總磷含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測(cè)定。土壤pH 利用復(fù)合玻璃電極儀（PHS-3C mv/pH detector，上海）測(cè)定，測(cè)定時(shí)的土水比為1∶5。土壤電導(dǎo)率利用數(shù)字式電導(dǎo)率儀（DDS-11A）測(cè)定。

1.3 土壤DNA提取及真菌群落結(jié)構(gòu)分析

采用土壤DNA 提取試劑盒（Power Soil DNA Iso?lation kit）提取土壤總DNA，稱取0.3 g新鮮土壤樣品，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用Nano?drop分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）檢測(cè)DNA 樣品濃度和純度。DNA樣品于-20 ℃保存。

利 用 引 物 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAG?TAA）和ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）擴(kuò)增真菌 ITS1 區(qū)。PCR 擴(kuò)增體系（25 μL）含 5×反應(yīng)緩沖液 5 μL，5×GC 緩沖液 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L）2μL，前引物（10 μmol·L）1 μL，后引物（10 μmol·L）1 μL，DNA 模板2 μL，ddHO 8.75 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL。PCR 條件（30 個(gè)循環(huán)）包括98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃最后延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，使用Pure link 快速凝膠萃取試劑盒（Trans Gen Biotech）對(duì)所需條帶進(jìn)行剪切純化。純化后的PCR 產(chǎn)物送至上海凌恩生物公司在Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)使用QIIME Pipe?line-Version 1.7.0 的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。簡(jiǎn)言之，先對(duì)雙向序列進(jìn)行拼接，去除低質(zhì)量序列（最大錯(cuò)誤率0.25）和barcode 序列，然后用UCHIME 算法去除嵌合體序列。以97%的相似度為閾值劃分操作分類單元（OTU），利用UNITE 數(shù)據(jù)庫(kù)的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP）確定每個(gè)真菌OTU的分類地位，閾值為0.8。利用QI?IME 軟件計(jì)算真菌群落OTU 數(shù)量和Shannon 多樣性指數(shù)。利用LEfSe 軟件對(duì)真菌序列進(jìn)行線性判別分析（Liner discriminant analysis, LDA），獲得秸稈還田和對(duì)照土壤中豐度具有顯著差異的主要真菌屬（相對(duì)豐度前20%），篩選標(biāo)準(zhǔn)為顯著性檢驗(yàn)<0.05 和線性判別分析值≥3。

1.4 土壤微生物群落秸稈降解潛力的測(cè)定

為了探究10 a 秸稈還田處理對(duì)土壤微生物消納秸稈潛力的影響，利用秸稈埋盆試驗(yàn)測(cè)定土壤微生物群落的秸稈降解潛力，該試驗(yàn)可最大程度地避免田間條件下前期還田而未腐解秸稈對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。供試土壤為過(guò)篩的田間土壤，分別稱取1 kg秸稈還田和未還田土壤置于容量為1.5 L的盆缽內(nèi)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)盆缽。將7 g 烘干后的小麥秸稈剪成5 cm 小段，裝入尼龍袋（80 目）并填埋于花盆內(nèi)。尼龍網(wǎng)袋能使微生物通過(guò)，同時(shí)防止未分解秸稈的損失，且秸稈腐解后呈絲狀、絮狀，導(dǎo)致腐解秸稈與土壤難以區(qū)分，使用尼龍袋可從土壤中快速、有效回收秸稈。尼龍網(wǎng)袋填埋深度為8 cm，調(diào)節(jié)土壤水分至60%田間最大持水量，培養(yǎng)過(guò)程中利用稱質(zhì)量法保持水分（每2 d 測(cè)一次）。室溫培養(yǎng)兩個(gè)月后（2019 年8—10 月）取出尼龍袋。尼龍網(wǎng)袋中土壤的去除方式參照文獻(xiàn)[23-24]，將尼龍網(wǎng)袋中的秸稈放入100 目篩網(wǎng)中，使用流速相同且緩慢的去離子水洗去秸稈表面附著的土壤顆粒，直至篩孔流出的水變清澈為止，隨后將洗去土壤顆粒的秸稈置于80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，利用秸稈降解率（）計(jì)算土壤秸稈降解潛力：

式中：為初始秸稈干質(zhì)量，g；W為培養(yǎng)時(shí)間后秸稈干質(zhì)量，g。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析土壤化學(xué)性質(zhì)和秸稈降解率在對(duì)照和處理間的差異顯著性（SPSS 21.0）。利用基于非權(quán)重UniFrac 距離矩陣的主坐標(biāo)軸分析（PCoA）研究秸稈還田對(duì)土壤真菌群落的影響。熱圖采用R 語(yǔ)言（pheatmap 包）繪制。利用冗余分析（RDA，CANOCO 4.5）研究秸稈降解率、土壤化學(xué)特性及真菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，排序軸的顯著性通過(guò)蒙特卡羅排列檢驗(yàn)（=499）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

由表1 可以看出，與未還田對(duì)照相比，10 a 秸稈還田處理能夠顯著降低土壤pH，下降了約0.22 個(gè)單位；秸稈還田分別提高了土壤可溶性有機(jī)碳和總碳含量的23%和2%。同時(shí)，秸稈還田處理下土壤電導(dǎo)率（EC）和總磷（TP）含量分別增加了48%和24%。然而，秸稈還田對(duì)土壤銨態(tài)氮（NH-N）含量的影響并不顯著（=0.81）。盡管秸稈還田對(duì)硝態(tài)氮（NO-N，=0.14）和礦質(zhì)氮（=0.14）含量有一定程度的提高，但與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。

表1 秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響Table 1 Effects of straw incorporation on the soil physical and chemical properties

2.2 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照土壤相比，10 a秸稈還田顯著降低土壤真菌群落Alpha 多樣性，真菌群落OTU 數(shù)量和Shannon多樣性指數(shù)分別降低了32.9%（<0.05）和14.2%（<0.05）（圖1a、圖1b）?；诜菣?quán)重UniFrac距離矩陣的PCoA 結(jié)果表明，對(duì)照和秸稈還田土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)沿主坐標(biāo)軸1明顯區(qū)分（圖1c），該坐標(biāo)軸可解釋真菌群落變異比的88.7%。

圖1 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落Alpha多樣性和Beta多樣性的影響Figure 1 Effects of straw incorporation on the Alpha-diversity and Beta-diversity of fungal community

序列比對(duì)結(jié)果表明供試土壤真菌群落主要由子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）和接合菌門（Zygomycota）組成（圖2a），其中子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢(shì)類群，其相對(duì)豐度占整體真菌群落的50%以上。秸稈還田顯著增加了子囊菌門的相對(duì)豐度（<0.05），增幅為25%；同時(shí)，接合菌門（Zygomycota）的相對(duì)豐度有所下降，但并不顯著（=0.17）。由熱圖可看出秸稈還田對(duì)土壤主要真菌屬（相對(duì)豐度前20%）的相對(duì)豐度影響明顯，對(duì)照和秸稈還田處理形成明顯聚類（圖2b）。線性判別分析結(jié)果表明裂殼菌屬（）、帚枝菌屬（）、赤雷菌屬（）、囊根壺菌屬（）、林氏草孔菌屬（）、隱球菌屬（）、漆斑菌屬（）等真菌屬在秸稈還田土壤中被富集（>3，<0.05），增幅為2.5~132.3 倍，而秸稈還田顯著降低了、、、、、和等真菌屬的相對(duì)豐度（<-3，<0.05）。

圖2 秸稈還田對(duì)土壤真菌群落門水平組成及土壤真菌群落屬水平組成的影響Figure 2 Effects of straw incorporation on the relative abundances of fungal phyla and the relative abundances of dominant fungal genus

2.3 秸稈還田對(duì)土壤微生物群落降解麥稈潛力的影響

秸稈埋盆試驗(yàn)中，對(duì)照和秸稈還田土壤的秸稈降解率分別為38%和52%，長(zhǎng)期秸稈還田顯著提高了土壤微生物對(duì)小麥秸稈的降解潛力（<0.05），增幅為37%。

2.4 土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成及秸稈降解潛力的冗余分析（RDA）

利用RDA分析了土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成（屬水平）及秸稈降解潛力的關(guān)系，結(jié)果見圖3。RDA1 和RDA2 兩軸可共同解釋真菌群落結(jié)構(gòu)差異的96.1%。蒙特卡羅檢驗(yàn)結(jié)果表明秸稈還田土壤中的麥稈降解潛力與真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著相關(guān)性（<0.01）。此外，土壤 pH（<0.01）、EC（<0.01）、TP（<0.01）、TC（<0.01）和DOC（<0.01）對(duì)真菌群落組成具有顯著影響，、、、、、和等真菌屬的相對(duì)豐度與土壤EC、TP、TC和DOC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與pH呈正相關(guān)關(guān)系。秸稈還田通過(guò)提高、、、、、、、、、和真菌屬的相對(duì)豐度提高小麥秸稈降解率。

圖3 土壤化學(xué)性質(zhì)、真菌群落組成及秸稈降解率的相互關(guān)系Figure 3 Correlations between soil chemical properties,fungal community structure and straw degradation rates

3 討論

秸稈還田是提高土壤碳固存能力的有效手段。本研究發(fā)現(xiàn)稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田可提高土壤總碳和可溶性有機(jī)碳含量（表1）。類似地，CONG等通過(guò)4 a 田間試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)玉米秸稈還田可提高土壤可溶性有機(jī)碳含量；XIA 等的整合分析結(jié)果表明秸稈還田可提高土壤可溶性有機(jī)碳含量的22%，并提高土壤總有機(jī)碳含量的15%。上述結(jié)果的主要原因是：一方面，秸稈本身的有機(jī)碳含量較高，秸稈腐解加速土壤碳積累；另一方面，秸稈施用為土壤微生物提供了充足碳源，提高了微生物數(shù)量和活性，進(jìn)而能夠促進(jìn)秸稈中惰性碳向活性有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化。

ZHANG 等認(rèn)為秸稈還田能夠增加土壤中氮和磷元素的含量。本研究中秸稈還田顯著提高了土壤總磷含量，但對(duì)土壤無(wú)機(jī)氮含量的影響并不顯著，可能的原因是秸稈經(jīng)礦化作用產(chǎn)生的無(wú)機(jī)氮被土壤微生物所同化。與以往諸多研究結(jié)果相同，本研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田顯著降低了土壤pH，該結(jié)果可能是由于秸稈腐解過(guò)程會(huì)釋放較多的有機(jī)酸。

秸稈還田可改變土壤微生物群落組成，相關(guān)研究表明，秸稈可提高土壤微生物多樣性。然而本研究中，秸稈還田降低了土壤真菌群落多樣性，這可能是由于秸稈作為碳氮源為微生物提供養(yǎng)分從而大幅提高了部分真菌類群的相對(duì)豐度，導(dǎo)致整體群落多樣性的降低。例如，本研究中優(yōu)勢(shì)真菌類群——子囊菌門的相對(duì)豐度在秸稈還田土壤中有較大幅度的上升。此外，本研究中秸稈還田增加了土壤可溶性有機(jī)碳、總碳以及總磷的含量，土壤養(yǎng)分含量的提升可能進(jìn)一步影響土壤真菌群落組成。本研究?jī)H關(guān)注了秸稈還田對(duì)土壤化學(xué)性質(zhì)的影響，但秸稈還田同樣可以改善土壤物理性狀，如增加土壤孔隙度和透氣性，通過(guò)改善土壤物理性狀間接對(duì)土壤微生物群落組成的影響尚需進(jìn)一步探究。真菌群落組成與土壤pH聯(lián)系緊密，本研究中秸稈還田對(duì)土壤pH 的降低作用可能是造成土壤真菌組成發(fā)生變化的重要原因。

對(duì)于長(zhǎng)期秸稈還田是否會(huì)加速土壤微生物對(duì)秸稈降解的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期秸稈還田土壤可顯著提高還田秸稈的腐解效率。本研究中子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落的優(yōu)勢(shì)菌群，其相對(duì)豐度受長(zhǎng)期秸稈還田的影響而大幅增加。MA 等發(fā)現(xiàn)在秸稈降解的不同階段子囊菌均占據(jù)主導(dǎo)地位，表明該類菌是驅(qū)動(dòng)土壤秸稈降解的關(guān)鍵類群。因此，子囊菌門相對(duì)豐度的增加可能是長(zhǎng)期秸稈還田條件下秸稈降解能力顯著增強(qiáng)的主要原因。此外，LEfSe 和RDA分析結(jié)果均表明裂殼菌屬（）、帚枝霉屬（）、赤霉菌屬（）、囊根壺菌屬（）、林氏革孔菌屬（）、隱球菌屬（）和漆斑菌屬（）能夠在長(zhǎng)期秸稈還田的土壤中富集。以往研究表明裂殼菌屬、帚枝霉屬、赤霉菌屬、囊根壺菌屬、漆斑菌屬以及隱球菌屬均具有高效秸稈纖維素降解能力，其中帚枝霉屬和隱球菌屬還可利用秸稈水解產(chǎn)物生產(chǎn)低聚糖氧化酶和脂質(zhì)。此外，LI 等發(fā)現(xiàn)接種人工合成的秸稈降解菌群可提高裂殼菌屬的豐度，說(shuō)明該菌屬可能與其他秸稈降解菌存在互利關(guān)系。林氏革孔菌屬與秸稈降解的關(guān)系未見報(bào)道。

3 結(jié)論

（1）稻麥輪作系統(tǒng)長(zhǎng)期秸稈還田能顯著提高土壤可溶性有機(jī)碳、總碳以及總磷的含量。

（2）秸稈還田驅(qū)動(dòng)真菌群落組成改變，降低了土壤真菌群落多樣性，提高了子囊菌門及裂殼菌屬、帚枝霉屬、赤霉菌屬、囊根壺菌屬、漆斑菌屬以及隱球菌屬等潛在秸稈降解真菌的相對(duì)豐度。

（3）秸稈還田通過(guò)富集潛在秸稈降解真菌加速秸稈的降解。