張海闊，張寶剛，周鐘昱，梁佳輝，吳家森，呂玉龍，解宏圖，蔡延江*

（1.浙江農(nóng)林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學環(huán)境與資源學院，杭州 311300；3.浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術學院，杭州 311300；4.安吉縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 安吉 313300；5.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，沈陽 110016）

土壤胞外酶是一種來源于土壤微生物、植物根系或死亡動植物殘體且具有催化作用的蛋白質，其在土壤中主要以游離態(tài)或礦物結合態(tài)等形式存在。土壤胞外酶參與土壤物質循環(huán)的關鍵步驟，可以催化有機質的分解和礦化，直至有機質分解產(chǎn)物可以被微生物同化利用。土壤胞外酶活性（Extracellular enzyme activities，EEAs）對環(huán)境變化或人類活動所引起的土壤擾動響應靈敏，因此，EEAs常被視為土壤生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學過程發(fā)生改變的敏感指標。土壤中多種胞外酶對物質循環(huán)存在功能分化，即多種不同的酶可催化同一種物質或同一種酶可催化土壤中多種物質的分解。在若干種土壤胞外酶中，與碳循環(huán)相關的β-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）、纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase，CBH）、β-木糖苷酶（β-1，4-xylosidase，BX）、酚氧化酶（Phenol oxidase，POX）和過氧化物酶（Peroxidase，PER），與氮循環(huán)相關的N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷酶（β-1，4-N-acetylglucosaminnidase，NAG）、亮氨酸氨基肽酶（Leucine aminopeptidase，LAP），以及與磷循環(huán)相關的土壤酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）得到了廣泛研究。

人類活動的加劇正在破壞著越來越多的天然林，在1980 年至1990 年間，人們受經(jīng)濟收益和糧食需求的驅使而大規(guī)?？撤ド?，僅全世界熱帶地區(qū)就有83%的新增農(nóng)業(yè)用地是由天然林直接改造而來。將天然林轉變?yōu)槿斯ち只蚍N植園的現(xiàn)象在我國熱帶及亞熱帶地區(qū)也頻繁發(fā)生。由天然林轉變而來的人工林或種植園常伴隨著施肥、耕作、林下植被去除等集約經(jīng)營措施，這些管理措施會通過影響pH、含水量、有機質積累、底物有效性和微生物生物量等土壤性質而影響土壤EEAs。例如，在中國亞熱帶的四川洪雅林場，將天然林轉變?yōu)樯寄救斯ち趾?，由于底物有效性的降低，土壤BG 和NAG 的活性均顯著降低；在中國亞熱帶的浙北地區(qū)，將天然常綠闊葉林轉變?yōu)榧s經(jīng)營的毛竹人工林后，土壤ACP、脲酶和蛋白酶的活性受施肥和林下植被去除等影響均顯著降低；在印度熱帶的Hathinala 地區(qū)，將天然林轉變?yōu)槟径狗N植園等農(nóng)用地后，由于化肥的施用而降低了土壤ACP 活性。此外，土壤EEAs 還受到多種生物因素和非生物因素的調控，眾多研究者的研究結果也不盡相同。因此，深入探究由天然林轉變?yōu)椴煌斯ち只蚍N植園后土壤EEAs的變異特征及其關鍵驅動因子，具有十分重要的意義。

綜上可知，大量研究均證實天然林轉變?yōu)檗r(nóng)業(yè)用地可顯著影響土壤的EEAs，由于天然林轉變?yōu)檗r(nóng)業(yè)用地后大都采用了不同的經(jīng)營管理措施，這些管理措施可直接改變土壤環(huán)境因子，土壤環(huán)境因子的改變又直接關系到土壤EEAs的變化。例如天然林轉變?yōu)榧s經(jīng)營的毛竹人工林后的經(jīng)營措施是通過改變土壤活性氮、磷的含量而間接改變土壤氮、磷獲取酶的活性；天然林轉變?yōu)樯寄救斯ち值拇胧﹦t是通過改變土壤微生物群落結構間接降低土壤碳、氮獲取酶的活性。位于中國亞熱帶地區(qū)的浙江省擁有豐富的天然林資源，從20 世紀末至21 世紀初期將天然林轉變?yōu)槿斯ち只蚍N植園的現(xiàn)象時有發(fā)生。天然林轉變后的人工林或種植園多采用粗放經(jīng)營或集約經(jīng)營等管理措施，這極有可能顯著改變土壤的環(huán)境因子，進而影響土壤EEAs 的活性。相比天然林，這一地區(qū)的人工林或種植園土壤EEAs發(fā)生了怎樣的變化？起關鍵驅動作用的土壤環(huán)境因子是什么？這些問題還亟待進一步探究。為此，本研究選取浙江省安吉縣的天然林土壤及由天然林轉變的毛竹林和茶園土壤作為研究對象，分析探討了土壤EEAs 的變化特征及其與土壤環(huán)境因子的關系，以期為進一步明確土壤酶學特征對天然林轉變?yōu)椴煌愋腿斯ち只蚍N植園后的響應機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)（30°41'~30°42' N，119°46'~119°47' E），該區(qū)域屬亞熱帶海洋性季風氣候，四季分明，雨熱同期，雨季為每年的5—6月，年平均氣溫15.1 ℃，年降水量1 286 mm，無霜期228 d，土壤屬酸性紅壤，原生植被為以苦櫧（）、木荷（）、青岡（）等為優(yōu)勢種的天然常綠闊葉林（Evergreen broad-leaved forests，EBFs）。

1.2 土壤樣品采集與分析

于2019年4—6月對研究區(qū)域進行了多次實地踏勘，在結合當?shù)卣块T提供的相關資料后，選取相同海拔、坡向的EBFs 及其鄰近的EBFs 轉變約15~20 a 的粗放經(jīng)營毛竹林（Moso bamboo plantations，MBPs）和轉變約20 a 的集約經(jīng)營（每年10 月平均施用400 kg·hm的復合肥，N∶PO∶KO=15∶15∶15，且茶樹修剪枝葉還田）茶園（Tea plantations，TPs）為研究對象，各設置3 塊樣地，每塊樣地面積約20 m×20 m。于2019 年7 月在每塊樣地中根據(jù)五點取樣法采集0~20 cm 的土壤樣品，土樣過2 mm 篩后混合成一份樣品。將土壤樣品置于4 ℃便攜式冰箱中迅速帶回實驗室并分成兩份，一份自然風干用于測定土壤基本理化性質，另一份保存在4 ℃冰箱中用于測定土壤生化指標。

土壤容重（BD）采用環(huán)刀法測定；pH（水土比2.5∶1）利用 METTLER TOLEDOSeven Compact 型 pH 計（METTLER TOLEDO，USA）測定；土壤有機碳（SOC）采用外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法測定；全氮（TN）采用半微量凱氏定氮法測定；全磷（TP）采用高氯酸-硫酸-鉬銻抗比色法測定；有效磷（AP）采用鹽酸-氟化銨-鉬銻抗比色法測定；微生物生物量碳（MBC）和微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸直接提取法測定。土壤EEAs 采用改進后的微孔板熒光法測定。各種酶的名稱、縮寫、作用及特定底物見表1。分別以4-甲基傘形酮（4-methylumvelliferyl，4-MUB）和L-二羥苯丙氨酸（Levodopa，L-DOPA）作為測定水解酶（其中LAP 用7-Amino-4-methylcoumarin）和氧化酶活性的標準對照物質。取1.5 g 新鮮土壤放入125 mL醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）中，以磁力攪拌器勻質1 min 后，用八通道移液器分別 3 次吸取 200 μL 土壤漿液注入96 孔板內作為樣品組，樣品組的第1~3 列額外再分別加入50μL的醋酸鈉緩沖液、標準對照物質和特定底物；此外，再分別3 次吸取200μL 醋酸鈉緩沖液注入96 孔板內作為對照組，對照組的第1~3列也額外分別加入50μL 的醋酸鈉緩沖液、標準對照物質和特定底物。加液完畢后，將96 孔板經(jīng)25 ℃恒溫培養(yǎng)后用 BiotekSynergy H1 型酶標儀（Biotek，USA）讀取熒光值或吸光值，其中水解酶在365 nm 激發(fā)光和450 nm 發(fā)射光下讀取，氧化酶在460 nm 吸收光下讀取。

表1 土壤酶的名稱、縮寫、作用及特定底物Table 1 Names，abbreviations，functions and substrates of the soil extracellular enzymes

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2016 進行預處理，包括計算平均值和標準誤差（SE）等，文中所有天然林、茶園和毛竹林數(shù)據(jù)皆為3 個樣地的平均值。在檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性后，采用SPSS 18.0 軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）及最小顯著差異法（LSD）確定3種土地利用類型間測定指標的顯著差異性（<0.05 為差異顯著），采用Spearman 相關系數(shù)對土壤環(huán)境因子和土壤EEAs 進行相關性分析。采用R語言 vegan 包、rdacca.hp 包和 ggplot2 包進行冗余分析（RDA）并繪圖。

2 結果與分析

2.1 研究區(qū)土壤基礎理化性質及微生物學性質

天然常綠闊葉林轉變?yōu)椴鑸@和毛竹林后，土壤BD未發(fā)生顯著改變（表2）。與天然林土壤相比，毛竹林土壤pH 顯著升高（<0.05），而茶園土壤pH 略有降低，但未達到顯著水平。天然林轉變?yōu)槊窳趾骃OC含量略有升高但未達到顯著水平，而轉變?yōu)椴鑸@后SOC 含量顯著降低了31.6%（<0.05）。土壤TN 和TP含量在3 種土地利用類型間無顯著差異。天然林轉變?yōu)椴鑸@和毛竹林后，土壤C/N 有所下降，但未呈現(xiàn)出顯著差異；毛竹林土壤C/P未出現(xiàn)顯著變化，而茶園土壤C/P 顯著降低了41.2%（<0.05）；毛竹林和茶園土壤N/P 略有升高，但均未達到顯著水平。天然常綠闊葉林轉變?yōu)槊窳趾螅寥繫BC 和MBN 含量分別顯著增加了118.2%和90.6%（<0.05），轉變?yōu)椴鑸@后，MBC 和MBN 含量卻分別顯著降低了54.9%和51.2%（圖1，<0.05），而MBC/MBN 在3種土地利用類型間無顯著差異。

圖1 研究區(qū)土壤微生物生物量碳、氮含量Figure 1 Soil microbial biomass carbon and nitrogen concentrations in study area

表2 研究區(qū)土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties in study area

2.2 研究區(qū)土壤EEAs的特征

天然林和兩種人工林的土壤EEAs 結果如表3 所示。天然林轉變的毛竹林中，土壤LAP、POX 活性分別顯著增加了385%和84.4%（<0.05），土壤ACP 活性顯著降低了58.9%（<0.05），其余EEAs 均未發(fā)生顯著變化；在由天然林轉變的茶園中，除土壤BX、LAP 及PER 活性未出現(xiàn)顯著變化外，BG、CBH、NAG和ACP的活性均顯著降低（<0.05），相比天然林分別降低了29.9%、51.8%、63.9%和36.6%，而POX 活性顯著升高了82.9%（<0.05）。

表3 不同土地利用類型土壤胞外酶活性（均值±標準誤）Table 3 Soil extracellular enzymes activity in three land-use types（Mean±SE）

2.3 土壤環(huán)境因子與土壤EEAs的關系

Spearman 相關性分析結果表明（表4），土壤pH與LAP活性呈極顯著正相關（<0.01）；土壤SOC含量與BG、CBH、NAG 和LAP 活性均呈極顯著正相關（<0.01）；土壤 AP 含量與 LAP 活性、C/N 與 POX 活性均呈顯著負相關（<0.05）；土壤 C/P 與 CBH 和 NAG 活性呈顯著正相關（<0.05），與LAP活性呈極顯著正相關（<0.01）；土壤N/P 與LAP 活性呈顯著正相關（<0.05），但與 PER 活性呈顯著負相關（<0.05）；土壤MBC 和 MBN 均與 BG、CBH、NAG 和 LAP 活性呈極顯著正相關（<0.01）。

表4 土壤胞外酶活性和土壤環(huán)境因子的關系Table 4 Correlations between soil extracellular enzyme activities and the environment factors

為了進一步篩選出影響土壤總體EEAs的關鍵環(huán)境因子，將土壤環(huán)境因子BD、pH、SOC、TN、TP、AP、C/N、C/P、N/P、MBC、MBN 和 MBC/MBN 作為解釋變量，將土壤EEAs 作為響應變量進行冗余分析。結果發(fā)現(xiàn)，RDA 的前兩軸分別解釋了土壤EEAs 變化的88.03%（RDA1）和6.53%（RDA2），其中土壤pH 是影響土壤總體EEAs的關鍵驅動因子（圖2）。

圖2 環(huán)境因子與土壤EEAs的冗余分析（RDA）Figure 2 Redundancy analysis（RDA）of relationship between soil extracellular enzyme activities with soil environment factors

3 討論

3.1 土壤EEAs的變化特征

土壤碳轉化過程中有機質的降解主要由土壤生物分泌的胞外酶催化實現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)天然林轉變?yōu)槊窳趾筒鑸@后，土壤活性碳及惰性碳獲取酶的活性分別產(chǎn)生了不同的響應。天然林轉變?yōu)榇址沤?jīng)營的毛竹林后，除土壤POX 活性顯著增加外，土壤活性碳獲取酶BG、BX、CBH 以及惰性碳獲取酶PER 的活性均未發(fā)生顯著變化，這與LIN 等在相鄰區(qū)域發(fā)現(xiàn)天然林轉變?yōu)榧s經(jīng)營毛竹人工林后土壤BG、CBH活性均顯著降低的結果不同。造成這種差異的可能原因是集約經(jīng)營毛竹林氮肥的施用會抑制土壤微生物活性，而本研究中粗放經(jīng)營毛竹林土壤EEAs 并不會受到施肥的抑制。與毛竹人工林不同，天然林轉變?yōu)榧s經(jīng)營的茶園后，伴隨SOC 和MBC 含量的降低，土壤BG 和CBH 活性均顯著下降，這可能是因為茶園長期施肥刺激了有機碳的礦化分解，進而使活性有機碳含量降低，由于底物量的減少，微生物分泌活性碳獲取酶的量也隨之減少，此外，茶園土壤生態(tài)系統(tǒng)特殊的物質循環(huán)模式造成了土壤酸化和鋁離子積累，這也會使土壤微生物豐度和活性下降，從而導致EEAs 的降低。土壤POX 與木質素降解有關，其能將土壤腐殖質中的芳香族化合物氧化成醌，再與土壤中的蛋白質、氨基酸、糖類等反應生成有機質。在本研究中，天然林轉變?yōu)槊窳趾筒鑸@后，土壤POX 活性均顯著升高，這可能是由于天然林與毛竹林、茶園相比擁有更多的凋落物，充足的養(yǎng)分供應使微生物為了降低制造酶的成本而減少了相關酶的生產(chǎn)，但在凋落物較少的毛竹林和茶園土壤中，微生物為了保障養(yǎng)分的供給不得不生產(chǎn)更多的POX 以從頑固性碳庫中獲取能量。

土壤氮素作為土壤肥力中比較活躍的元素，在生物地球化學循環(huán)中具有舉足輕重的地位，植物在生長過程中需從土壤獲取大量的氮素養(yǎng)分，而這些氮素營養(yǎng)的獲取也與土壤的酶促作用有關。本研究中，天然林轉變的粗放經(jīng)營毛竹人工林相比天然林土壤，LAP活性顯著增加，NAG 活性略有增加但未達到顯著水平；而天然林轉變的集約經(jīng)營茶園相比天然林，土壤NAG 活性和LAP 活性分別降低了63.9%和44.8%，根據(jù)資源配置理論可解釋為茶園土壤施肥增加了氮素等養(yǎng)分的輸入，充足的氮素使微生物或植物根系等不需要分泌更多的氮素獲取酶，因此降低了茶園土壤中NAG 和LAP 的活性。此外，氮獲取酶活性的降低也可能預示著茶園土壤微生物依靠有機氮礦化來獲取氮素養(yǎng)分的活動減少，氮肥成為茶園土壤微生物的主要氮素養(yǎng)分來源。

土壤ACP是主要的磷素獲取酶，在本研究涉及到的6 種水解酶中，其活性最高，這在一定程度上反映出研究區(qū)域可能存在較強的磷限制。天然林轉變?yōu)槊窳趾筒鑸@后土壤ACP 的活性都出現(xiàn)了顯著降低，這可能與亞熱帶森林酸性土壤磷固定效應強，存在磷限制有關。天然林土壤微生物在磷素供給不充足的情況下會增加土壤磷獲取酶的生產(chǎn)，以滿足其對磷素養(yǎng)分的需求，而施肥使茶園土壤磷素供給充足（茶園土壤AP 含量顯著高于天然林土壤），土壤微生物無需分泌更多的磷獲取酶，從而造成了與天然林相比，毛竹林和茶園土壤ACP 活性顯著降低，且土壤有機磷的礦化過程可能也不活躍。

3.2 土壤EEAs變化的關鍵驅動因子分析

土壤EEAs 特征受環(huán)境因子的驅動。BG 和CBH調節(jié)土壤纖維素的降解，尤其是BG 參與纖維素解聚的最后一步，其被認為是最重要的碳獲取酶。本研究中土壤SOC 與BG 活性顯著相關，這與前人研究結果一致，同時也說明了研究區(qū)內纖維素在土壤有機質輸入中有較大的貢獻。NAG 與LAP 是重要的氮獲取酶，其分別影響甲殼素和蛋白質的降解，土壤NAG 活性會因為SOC 含量及土壤微生物量的降低而受到抑制，在本研究中，NAG 與 SOC、MBC 和 MBN有顯著的相關性；此外，土壤LAP 活性與pH、SOC、AP、C/P、N/P、MBC 和 MBN 均具有顯著的相關性，這說明LAP 活性相較其他土壤胞外酶更容易受到環(huán)境變化的影響。土壤C/N 與EEAs 關系密切，土壤EEAs受制于養(yǎng)分有效性及其化學計量比，本研究發(fā)現(xiàn)土壤C/N是POX活性的主要驅動因子（表4），且ZHANG等的研究也進一步支持了這一結果，即較低的C/N會使土壤氧化酶的活性增加。

本研究還通過將所有土壤環(huán)境因子作為解釋變量，所有EEAs 作為響應變量進行RDA，以篩選出土地利用變化后造成土壤總體EEAs變異的關鍵環(huán)境驅動因子。RDA 結果表明（圖2），土壤pH 是造成總體EEAs 變異的唯一顯著影響因子。值得注意的是，與RDA 結果不同，Spearman 相關性分析顯示pH 僅與LAP 活性顯著相關，這是由于RDA 與經(jīng)典相關性分析的原理和目的均不相同，從RDA 可得知土地利用變化后土壤pH 對整體EEAs 變異的解釋度，而從Spearman 相關性分析得到的卻是pH 與單個土壤EEAs 的相關性，所以兩種分析可能會出現(xiàn)不同的結果。此外，以往研究也發(fā)現(xiàn)，土壤pH 是影響EEAs 的重要因素，例如ZHANG 等采用RDA 發(fā)現(xiàn)中國亞熱帶地區(qū)林地轉變?yōu)檗r(nóng)田后，土壤pH 顯著解釋了6 種碳獲取酶的總變異；TURNER等采集了29個英國低地牧場土壤樣品，發(fā)現(xiàn)土壤pH 可能通過影響土壤中占優(yōu)勢的生物類群來對磷酸酶活性造成影響。土壤pH 與胞外酶在土壤溶液中的穩(wěn)定性緊密相關，其可通過改變土壤微生物群落結構和酶的空間結構而改變土壤胞外酶的催化活性。土壤pH 對EEAs 的影響機制較為復雜，本研究中土壤EEAs總變異對pH的響應機制還需在未來采用擴增子測序、功能基因定量或代謝組學等方法做更深入地探究。

4 結論

（1）相比天然林，粗放經(jīng)營的毛竹人工林土壤活性碳獲取酶、NAG 和PER 活性均無顯著差異；此外，毛竹林土壤的LAP和POX活性顯著高于天然林，ACP活性顯著低于天然林。

（2）相比天然林，集約經(jīng)營茶園土壤BX、LAP 和PER 活性均無顯著差異；此外，茶園土壤的POX 活性顯著高于天然林，BG、CBH、NAG 和ACP 活性顯著低于天然林。

（3）冗余分析發(fā)現(xiàn)，粗放經(jīng)營毛竹林、集約經(jīng)營茶園和天然林間土壤總體EEAs 存在明顯差異，在影響土壤總體EEAs的一系列環(huán)境因子中，土壤pH的貢獻最大。因此，在土地利用變化背景下，土壤pH可在一定程度上解釋亞熱帶地區(qū)由天然林轉變的粗放經(jīng)營毛竹人工林和集約經(jīng)營茶園中土壤總體EEAs的變異規(guī)律。