錢(qián)永明，任東，唐鳳琳，楊湞，吳云當(dāng)，路璐，彭超1，*

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009；2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637009；3.西華師范大學(xué)化學(xué)合成與污染控制四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；4.北京大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，北京 100871；5.廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所/廣東省農(nóng)業(yè)環(huán)境綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510650）

鐵（Fe）是環(huán)境中具有高活性和高豐度的元素，同時(shí)也是構(gòu)成生命體的必需重要元素之一。由Fe（Ⅱ）與Fe（Ⅲ）的氧化和還原過(guò)程組成的鐵循環(huán)，關(guān)聯(lián)著環(huán)境中多個(gè)元素和污染物的生物地球化學(xué)過(guò)程。在pH中性的環(huán)境中，F(xiàn)e（Ⅲ）多以固體鐵礦物的形式存在。大量研究表明，這些鐵礦物的表面具有較強(qiáng)的化學(xué)活性，在環(huán)境中能作為吸附劑影響污染物的遷移，或作為催化劑促進(jìn)環(huán)境中多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過(guò)程。

在環(huán)境中鐵還原過(guò)程由生物和非生物的化學(xué)反應(yīng)共同驅(qū)動(dòng)。異化鐵還原微生物（鐵還原微生物）是一種能夠在無(wú)氧的條件下，利用有機(jī)質(zhì)、氫氣等多種物質(zhì)為電子供體，將Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ）的微生物。鐵還原微生物在環(huán)境中廣泛分布，其對(duì)Fe（Ⅲ）礦物的還原影響著環(huán)境中眾多的生物和化學(xué)過(guò)程，具有重要的環(huán)境意義。然而，由于處于固態(tài)的鐵礦物難以穿過(guò)細(xì)胞膜，如何將電子從細(xì)胞轉(zhuǎn)移給鐵礦物是微生物鐵還原過(guò)程的主要限制因素之一。除了微生物自身建立的一套胞外電子傳遞系統(tǒng)以外，在環(huán)境中還存在一些氧化還原活性物質(zhì)，能夠作為電子穿梭體在微生物與鐵礦物之間傳遞電子，讓鐵還原微生物在不與鐵礦物發(fā)生直接接觸的情況下還原Fe（Ⅲ）。最近的研究發(fā)現(xiàn)，作為環(huán)境功能材料之一的生物質(zhì)炭能夠影響微生物鐵還原過(guò)程。但目前關(guān)于生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的影響仍存在爭(zhēng)議。由于菌種、生物質(zhì)炭類(lèi)型、實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置等的差異，甚至出現(xiàn)了相悖的結(jié)論。一部分研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭能夠促進(jìn)微生物鐵還原，然而又有一些研究發(fā)現(xiàn)同樣的生物質(zhì)炭在一定生物質(zhì)炭和鐵的濃度比例下會(huì)抑制微生物鐵還原。目前已知的生物質(zhì)炭影響微生物鐵還原過(guò)程的機(jī)制有多種，包括通過(guò)生物質(zhì)炭表面的化學(xué)官能團(tuán)在細(xì)胞和礦物之間傳遞電子、在生物質(zhì)炭的雙電層（Electrical double-layer）存儲(chǔ)或釋放電子、利用生物質(zhì)炭的導(dǎo)電性直接在細(xì)胞和礦物之間傳遞電子，以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行吸附形成團(tuán)聚體改變細(xì)胞與礦物的接觸關(guān)系等。

在過(guò)去對(duì)生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原的多數(shù)研究中，使用的水鐵礦濃度都相對(duì)較高，有一些甚至達(dá)到每升數(shù)十毫摩爾（mmol·L）。然而在實(shí)際環(huán)境中，生物質(zhì)炭和鐵的添加量和天然含量都在較大的范圍內(nèi)波動(dòng)，在不同環(huán)境中的差異甚至可達(dá)到2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)環(huán)境中水鐵礦含量大多也僅占總鐵濃度的一小部分，且在不同環(huán)境中含量不同。此外，研究表明，微生物鐵還原的速率與水鐵礦濃度呈正比，而由于一些在中高溫度條件下制備的生物質(zhì)炭具有較高的得失電子能力，能夠快速對(duì)鐵礦物進(jìn)行化學(xué)還原，降低初始鐵濃度。因此，鐵礦物的濃度很可能是影響生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原的關(guān)鍵因素之一。為了驗(yàn)證該推測(cè)，進(jìn)一步明晰生物質(zhì)炭影響微生物鐵還原的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)制備水稻秸稈生物質(zhì)炭，借助介導(dǎo)電化學(xué)技術(shù)明確其得失電子能力；在多個(gè)不同水鐵礦濃度條件下，開(kāi)展鐵還原菌MR-1 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，在多個(gè)生物質(zhì)炭和水鐵礦濃度條件下測(cè)定了微生物鐵還原的反應(yīng)速率；借助化學(xué)成分分析和共聚焦顯微鏡成像等技術(shù)手段，分析MR-1 在不同生物質(zhì)炭和水鐵礦濃度下還原水鐵礦的動(dòng)力學(xué)，觀察微生物細(xì)胞與生物質(zhì)炭形成的聚合體的形態(tài)。該研究對(duì)揭示具有不同鐵濃度的環(huán)境中生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原的機(jī)制有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 生物質(zhì)炭的和鐵礦物的制備

采集水稻收獲后的新鮮秸稈，用自來(lái)水初步清洗后，避光風(fēng)干。磨碎過(guò)10 目篩，置于有蓋坩堝內(nèi)放在馬弗爐中，在500 ℃下無(wú)氧熱解2 h（持續(xù)通N，流量200 mL·min）。自然冷卻到室溫后，再次過(guò)10目篩，用0.1 mol·LHF-HCl浸洗24 h，重復(fù)兩遍，再用去離子水清洗生物質(zhì)炭到無(wú)F、Cl檢出，以排除生物質(zhì)炭中殘余的礦物成分對(duì)微生物鐵還原過(guò)程中電子傳遞過(guò)程的干擾。最后避光風(fēng)干，磨碎過(guò)230 目篩后避光保存。

水鐵礦（Fh）和針鐵礦（Gt）使用九水合硝酸鐵和氫氧化鉀在實(shí)驗(yàn)室合成，礦物的具體合成方案參考AMSTAETTER 等的方法。在無(wú)氧手套箱中（100%N，布勞恩Unilab Pro）利用無(wú)氧水將鐵礦物配制成懸浮液，存儲(chǔ)于血清瓶中，用丁基膠塞密封試管口，加蓋鋁蓋，避光保存。

1.2 菌株及微生物鐵還原實(shí)驗(yàn)

MR-1，最初分離自美國(guó)Oneida 湖的無(wú)氧沉積物中，是目前研究較為廣泛的鐵還原微生物之一。

將MR-1 菌株于-80 ℃冷凍保存，在實(shí)驗(yàn)前通過(guò)劃線接種至含有LB 固體培養(yǎng)基的平板上（培養(yǎng)基成分：胰蛋白酶10 g·L、酵母提取物5 g·L、NaCl 10 g·L、瓊脂 15 g·L），于 28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)約 24 h 后，保存于4 ℃冰箱中。在LB 固體培養(yǎng)基上挑取MR-1的單一菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行避光培養(yǎng)，搖床速度為150 r·min，培養(yǎng)溫度為28 ℃。通過(guò)OD值檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中微生物的生長(zhǎng)曲線，培養(yǎng)約12 h后，離心（5 000，5 min）收集處于對(duì)數(shù)期后期的細(xì)胞（OD約 0.41），離心之后倒掉上清液，用無(wú)氧的PIPES 緩沖溶液（10 mmol·L，pH 為 7）重新懸浮細(xì)胞，并再次進(jìn)行離心（5 000，5 min）。重復(fù)操作兩次，以去除殘余的LB 培養(yǎng)基。最后用無(wú)氧的PIPES緩沖溶液重新懸浮細(xì)胞，制備成約20 倍濃縮的細(xì)胞懸浮液。

在pH=7的PIPES無(wú)氧培養(yǎng)液（10 mmol·LPIPES）中按照順序分別添加不同濃度的水鐵礦（2、4、10 mmol·L）或針鐵礦（4 mmol·L）、10 mmol·L乳酸鈉、不同濃度生物質(zhì)炭（2、4、10 g·L），取一定量的濃縮的細(xì)胞懸浮液添加到PIPES 無(wú)氧培養(yǎng)液中，使其最終細(xì)胞數(shù)為6.20×10個(gè)·μL，最后分裝到亨蓋特厭氧培養(yǎng)管（頂空含100%N）中，用丁基膠塞密封試管口，加蓋鋁蓋，在28 ℃無(wú)氧黑暗的條件下靜置培養(yǎng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置不加生物質(zhì)炭的對(duì)照組和未添加細(xì)胞的非生物對(duì)照組。

1.3 Fe（Ⅱ）濃度測(cè)定和微生物鐵還原速率計(jì)算

培養(yǎng)過(guò)程中每隔數(shù)小時(shí)采集樣品，通過(guò)斐林試劑法測(cè)得樣品中Fe（Ⅱ）濃度。具體步驟為：首先，用N清洗過(guò)的注射器采集樣品，然后迅速用1 mol·L鹽酸（水鐵礦處理）或6 mol·L鹽酸（針鐵礦處理）對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)谑覝兀ㄋF礦處理）或60 ℃培養(yǎng)箱（針鐵礦處理）中避光靜置2 h 后離心（5 000，1 min）取上清液。在 96 孔板中，用 1 mol·L鹽酸溶液對(duì)樣品再次進(jìn)行再次稀釋?zhuān)缓蠡旌响沉衷噭┤芤海?.1%∶ferrozine，50%∶醋酸銨）培養(yǎng)5 min后，利用微孔板酶標(biāo)儀（Multiskan GO，Thermo Fisher Sci?entific 公司）測(cè)量波長(zhǎng)為562 nm 處的吸光值，與使用（NH）Fe（SO）·6HO 和 1 mol·L鹽 酸 制 得 的 Fe（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，測(cè)得Fe（Ⅱ）濃度。最后利用Excel 軟件選取鐵還原最快的時(shí)期中至少3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Fe（Ⅱ）濃度變化，進(jìn)行一元線性回歸分析[=a+b，式中：為時(shí)間，為Fe（Ⅱ）濃度]，從線性擬合直線的斜率得出微生物鐵還原的速率。

1.4 介導(dǎo)電化學(xué)分析

采用介導(dǎo)電化學(xué)氧化（MEO）和還原（MER）方法對(duì)生物質(zhì)炭的供電子能力（）和得電子能力（）進(jìn)行定量化測(cè)定。測(cè)試系統(tǒng)由電化學(xué)工作站（CHI 760E）和介導(dǎo)測(cè)試反應(yīng)裝置兩部分組成，其中三電極測(cè)試體系由石墨板（工作電極）、鉑網(wǎng)（對(duì)電極）和Ag/AgCl 電極（參比電極）組成，介導(dǎo)劑分別為ABTS 和Ziv，測(cè)試電壓分別為 0.61 V 和?0.49 V，電介質(zhì)溶液為 0.1 mol·LKCl（pH=7.0，PBS）。為排除氧氣對(duì)測(cè)試體系的干擾，測(cè)試前所有溶液均采用高純氮?dú)饷撗跆幚?0 min。于i-測(cè)試模式下達(dá)到穩(wěn)定電流，加入 500 μL 10 mmol·L的 ABTS 或 ZiV 溶液，待反應(yīng)電流回到基線并再次穩(wěn)定后，向測(cè)試體系加入100 μL 生物質(zhì)炭懸浮液（1.0 g·L），得到生物質(zhì)炭得失電子過(guò)程中的i-曲線。最后，采用公式（1）和公式（2）對(duì)生物質(zhì)炭的和進(jìn)行計(jì)算。

式中：和分別為介導(dǎo)還原和氧化電流，A；F 為法拉第常數(shù)，96 485 C·mol；為加入測(cè)試體系中生物質(zhì)炭的質(zhì)量，g；為積分時(shí)間，s。

1.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察

細(xì)胞懸浮液的制備同1.2。首先用4%甲醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，然后利用含有SYTO 9 和Propidium iodide 的死活菌染色試劑盒（Live/Dead BacLight，Invi?trogen）對(duì)菌體進(jìn)行避光染色。染色完成后，將細(xì)胞添加到含有 10 g·L生物質(zhì)炭和 4 mmol·L水鐵礦的PIPES 緩沖溶液中，并使最終細(xì)胞濃度達(dá)到與實(shí)驗(yàn)中相同的6.20×10cells·μL。利用Leica TCS SP8 激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)獲取樣品中生物質(zhì)炭、鐵礦物和細(xì)胞沿Z 軸方向的系列圖層，使用的激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm。然后使用NIH ImageJ 1.53 軟件對(duì)采集到的系列圖層進(jìn)行最大密度投影（Maximum intensity pro?jection）處理，分析生物質(zhì)炭、鐵礦物和細(xì)胞的結(jié)合和空間分布情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0 對(duì)不同實(shí)驗(yàn)設(shè)置條件下測(cè)得的微生物鐵還原速率、生物質(zhì)炭的得電子能力（）和失電子能力（）的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），<0.05 時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生物質(zhì)炭濃度對(duì)微生物異化鐵還原的影響

在加入生物質(zhì)炭的處理中，在0時(shí)刻有大量Fe（Ⅱ）產(chǎn)生，其濃度隨著生物質(zhì)炭濃度的增加而增加（圖1）。平均每克生物質(zhì)炭與水鐵礦[4 mmol·LFe（Ⅲ）]反應(yīng)生成了約174.8μmol Fe（Ⅱ）。在之后的培養(yǎng)時(shí)間里，在添加了生物質(zhì)炭的處理中，微生物鐵還原的速率和程度均明顯低于不添加生物質(zhì)炭的對(duì)照組。在對(duì)照組中，微生物鐵還原的速率為110.1 μmol·L·h，而在添加了 2、4、10 g·L生物質(zhì)炭的實(shí)驗(yàn)組中，微生物鐵還原的速率分別為 36.9、34.5、65.8 μmol·L·h，其中添加了2、4 g·L生物質(zhì)炭的樣品與不添加生物質(zhì)炭或添加10 g·L生物質(zhì)炭的樣品的微生物鐵還原的速率具有顯著差異。

圖1 不同生物質(zhì)炭濃度條件下微生物對(duì)水鐵礦的還原Figure 1 Reduction of ferrihydrite by MR-1 at different biochar concentrations

2.2 不同鐵礦物濃度對(duì)生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原的影響

為了研究鐵礦物的濃度對(duì)生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物異化鐵還原動(dòng)力學(xué)的影響，在添加及不添加10 g·L的生物質(zhì)炭條件下，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了2、4、10 mmol·L3個(gè)Fe（Ⅲ）濃度。此外，還設(shè)置了一個(gè)加入針鐵礦的對(duì)照，以驗(yàn)證在0時(shí)刻生成的Fe（Ⅱ）是否為水鐵礦與生物質(zhì)炭的反應(yīng)生成，排除鹽酸對(duì)亞鐵進(jìn)行提取的過(guò)程對(duì)結(jié)果的干擾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵礦物的濃度會(huì)顯著影響微生物還原水鐵礦的動(dòng)力學(xué)，在添加了生物質(zhì)炭的處理中，鐵礦物濃度的變化對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的影響更為顯著。如圖2 所示，微生物鐵還原速率和程度隨著Fe（Ⅲ）濃度增加而增加。在添加了生物質(zhì)炭的處理中（圖2A），F(xiàn)e（Ⅲ）濃度為2 mmol·L時(shí)微生物鐵還原幾乎被完全抑制，其鐵還原速率僅有17.8μmol·L·h。而隨著 Fe（Ⅲ）濃度升高，在含有生物質(zhì)炭的處理中，當(dāng)Fe（Ⅲ）濃度為4、10 mmol·L時(shí)的鐵還原速率分別為 83.4 μmol·L·h和 105.1 μmol·L·h，分別是Fe（Ⅲ）濃度為2 mmol·L時(shí)的4.69倍和5.90倍。在不含生物質(zhì)炭的處理中（圖2B），當(dāng)Fe（Ⅲ）濃度從 2 mmol·L增加到 4 mmol·L和 10 mmol·L后，微生物的鐵還原速率從 53.4 μmol·L·h分別增加到133.3 μmol·L·h和251.2 μmol·L·h，分別是Fe（Ⅲ）濃度為 2 mmol·L時(shí)的 2.50 倍和 4.70 倍。在使用針鐵礦為鐵源的處理中，添加生物質(zhì)炭后，在0時(shí)刻和實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)（約23.4 h）均未檢測(cè)到Fe（Ⅱ）的產(chǎn)生（圖2A），證明添加針鐵礦和生物質(zhì)炭的處理中，0 時(shí)刻所產(chǎn)生的Fe（Ⅱ）不是在用HCl 對(duì)鐵進(jìn)行提取的過(guò)程中生物質(zhì)炭對(duì)Fe（Ⅲ）的還原所產(chǎn)生的。

圖2 不同F(xiàn)e（Ⅲ）濃度和礦物種類(lèi)條件下的微生物鐵還原Figure 2 Microbial iron reduction at different concentrations of ferrihydrite and goethite

2.3 生物質(zhì)炭的氧化還原特性和對(duì)微生物細(xì)胞的吸附

電化學(xué)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該生物質(zhì)炭的給電子能力為（0.29±0.06）mmol·g，得電子能力為（0.91±0.21）mmol·g（圖3），其得電子能力是給電子能力的3.14倍，二者具有顯著差異（<0.05）。其給電子能力高于實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的對(duì)4 mmol·L水鐵礦的還原能力（約0.17 mmol·g）（圖 3）。

圖3 生物質(zhì)炭的得電子能力（EAC）和失電子能力（EDC）Figure 3 Electron accepting capacities（EAC），and electron donating capacities（EDC）of biochar

共聚焦激光顯微鏡成像發(fā)現(xiàn)，在混合了4 mmol·L水鐵礦、6.20×10cells·μLMR-1 細(xì)胞和 10 g·L生物質(zhì)炭的處理中，有大量的細(xì)胞吸附在生物質(zhì)炭表面，形成聚合體，但聚合體中并沒(méi)有明顯觀察到水鐵礦，許多細(xì)胞仍自由懸浮于液體中（圖4）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在不同的生物質(zhì)炭和鐵濃度條件下，生物質(zhì)炭均抑制了微生物的鐵還原過(guò)程，這與以往的許多研究中發(fā)現(xiàn)的生物質(zhì)炭促進(jìn)微生物鐵還原的現(xiàn)象相反。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)了生物質(zhì)炭可以化學(xué)還原水鐵礦，從而降低初始Fe（Ⅲ）濃度的現(xiàn)象，以及生物質(zhì)炭吸附細(xì)胞于其表面、形成微生物細(xì)胞和生物質(zhì)炭的聚合體的現(xiàn)象。

生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的抑制作用可能與其自身對(duì)水鐵礦的還原所導(dǎo)致的初始Fe（Ⅲ）濃度下降有關(guān)。在本研究中，無(wú)論是否添加生物質(zhì)炭，微生物鐵還原的速率與水鐵礦濃度呈正比（圖2），即當(dāng)水鐵礦的濃度升高時(shí)，鐵還原速率也隨之升高，這與前人的研究結(jié)果類(lèi)似。因此，生物質(zhì)炭自身對(duì)水鐵礦的還原所導(dǎo)致Fe（Ⅲ）濃度的降低（圖1），可能是其在低鐵濃度條件下抑制微生物鐵還原的原因之一。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，相比不添加生物質(zhì)炭的對(duì)照組，在添加生物質(zhì)炭（10 g·L）的處理中，鐵礦物濃度的變化對(duì)微生物鐵還原速率的影響更為顯著。當(dāng)鐵濃度從2 mmol·L增加到4 mmol·L時(shí)，在添加生物質(zhì)炭（10 g·L）的處理中微生物鐵還原速率增加了3.69 倍（圖2A），而在不添加生物質(zhì)炭的處理中僅增加了1.50 倍（圖2B）。這可能是由于隨著初始Fe（Ⅲ）濃度的升高，相同濃度生物質(zhì)炭化學(xué)還原水鐵礦，降低一部分初始Fe（Ⅲ），因此對(duì)微生物鐵還原速率的負(fù)面影響相對(duì)降低。該結(jié)果證明水鐵礦的濃度在生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原過(guò)程中扮演了重要的作用。

生物質(zhì)炭抑制微生物鐵還原的另一個(gè)原因可能與細(xì)胞-生物質(zhì)炭聚合體的形成有關(guān)。共聚焦激光顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)一部分細(xì)胞吸附于生物質(zhì)炭的表面形成聚合體，且在聚合體中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)水鐵礦（圖4）。這一現(xiàn)象與前人發(fā)現(xiàn)當(dāng)鐵礦物與微生物細(xì)胞-生物質(zhì)炭聚合體結(jié)合時(shí)生物質(zhì)炭才會(huì)促進(jìn)微生物鐵還原的現(xiàn)象一致。這種由微生物和生物質(zhì)炭形成的聚合體，可能會(huì)限制微生物和生物質(zhì)炭在溶液中的活動(dòng)性，減少微生物和生物質(zhì)炭與水鐵礦的接觸概率，進(jìn)而抑制電子傳遞給水鐵礦。然而，由于在過(guò)去類(lèi)似的研究中，使用的水鐵礦的濃度都相對(duì)較高，如15 mmol·L和 30 mmol·L等，遠(yuǎn)高于本研究中所使用的4 mmol·L。在含有較高濃度水鐵礦的情況下，即使也有微生物-生物質(zhì)炭聚合體的形成和一部分Fe（Ⅲ）被還原的現(xiàn)象，但由于其體系中依然有足夠高濃度的水鐵礦供微生物接觸和還原，因此對(duì)后期培養(yǎng)過(guò)程中微生物鐵還原的抑制作用并不顯著。本研究中的結(jié)果也支撐了這一推論，當(dāng)水鐵礦的初始濃度相對(duì)較低時(shí)，生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原的抑制作用更為顯著（圖2）。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡拍攝到的生物質(zhì)炭顆粒和微生物細(xì)胞沿垂直方向的堆疊圖Figure 4 Biochar particles and bacterial cells photographed using laser scanning confocal microscopy

同時(shí)，由于本研究中使用的生物質(zhì)炭具有較高的給電子和得電子能力（圖3），在形成不含水鐵礦的微生物-生物質(zhì)炭聚合體后，生物質(zhì)炭可能取代水鐵礦作為微生物呼吸作用的電子受體，與水鐵礦產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，這可能是本研究中生物質(zhì)炭進(jìn)一步抑制微生物對(duì)水鐵礦的還原另一個(gè)原因。

此外，該研究結(jié)果與以往研究結(jié)果不同，也可能與使用了不同的物理化學(xué)特性的生物質(zhì)炭有關(guān)。本研究中使用的是去除了煅燒過(guò)程中產(chǎn)生的礦物質(zhì)成分的生物質(zhì)炭，而前人對(duì)該過(guò)程的研究中多使用包含礦物成分的生物質(zhì)炭。已有的研究發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭中的礦物成分可能會(huì)影響生物質(zhì)炭對(duì)有機(jī)質(zhì)的吸附，而這些礦物成分對(duì)生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原過(guò)程的影響目前仍然未知，值得在未來(lái)開(kāi)展進(jìn)一步深入的研究。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中，不同生物質(zhì)炭（2~10 g·L）和水鐵礦濃度（2~10 mmol·L）下，生物質(zhì)炭均對(duì)微生物鐵還原有抑制作用。YANG 等在研究木材煅燒的生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原的研究中發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)炭與Fe（Ⅲ）的質(zhì)量濃度比（g·mmol）高于或低于一個(gè)固定比值時(shí)，生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原分別表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制作用的現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)濃度為10 mg·L的石墨烯就會(huì)對(duì)微生物鐵還原過(guò)程表現(xiàn)出抑制作用。因此，氧化還原活性和吸附能力不同的生物質(zhì)炭或碳基材料在不同的環(huán)境條件下對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的影響可能不盡相同，并非所有的生物質(zhì)炭都能夠促進(jìn)微生物鐵還原。

目前，生物質(zhì)炭作為新型碳材料在農(nóng)業(yè)環(huán)境領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，本研究的結(jié)果為生物質(zhì)炭的環(huán)境效應(yīng)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)在生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原過(guò)程中，生物質(zhì)炭不僅作為電子穿梭體促進(jìn)微生物鐵還原，也可以通過(guò)其自身的氧化還原特性改變環(huán)境中水鐵礦的濃度，以及通過(guò)吸附細(xì)胞形成聚合體等方式參與微生物鐵還原的過(guò)程。生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的抑制，可能會(huì)進(jìn)而影響到環(huán)境中與鐵還原微生物厭氧呼吸相關(guān)的多種電子供體的降解過(guò)程，例如微生物對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解、甲烷的氧化，以及最新發(fā)現(xiàn)的銨根離子的降解等。同時(shí)，由于環(huán)境中的鐵是由多種不同的類(lèi)型的各類(lèi)鐵礦物混合而成的，在一些環(huán)境中，具有較高生物利用度的水鐵礦濃度可能相對(duì)較低。許多生物質(zhì)炭均有一定的給電子能力，進(jìn)而能夠還原Fe（Ⅲ），在以往的研究中發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)炭的給電子能力可以達(dá)到2 mmol·g。在一些具有較低濃度水鐵礦的環(huán)境中，施加具有較強(qiáng)化學(xué)鐵還原和與鐵還原微生物形成聚合體能力的生物質(zhì)炭，可能會(huì)強(qiáng)烈抑制環(huán)境微生物鐵還原過(guò)程。在未來(lái)需進(jìn)一步從微生物-生物質(zhì)炭聚合體和生物質(zhì)炭-鐵礦物的反應(yīng)效應(yīng)等方向?qū)ι镔|(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原過(guò)程的機(jī)制展開(kāi)深入研究。

4 結(jié)論

（1）該研究中的水稻秸稈生物質(zhì)炭顯著抑制了微生物鐵還原過(guò)程。

（2）生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原過(guò)程的抑制作用可能有兩個(gè)原因：一是生物質(zhì)炭對(duì)水鐵礦的化學(xué)還原降低了初始Fe（Ⅲ）濃度；二是形成了微生物-生物質(zhì)炭聚合體。

（3）水鐵礦初始濃度相對(duì)較低時(shí)，生物質(zhì)炭對(duì)微生物鐵還原的抑制更顯著。

（4）鐵礦物濃度是影響生物質(zhì)炭介導(dǎo)微生物鐵還原過(guò)程的重要因素。

感謝西華師范大學(xué)侯怡鈴教授和白鑫同學(xué)提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，以完成本項(xiàng)目中激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)。