郭靖 王宇琪 楊中銳 張舒 賈杰?

1 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 口腔科,河南 開封 475000;2河南大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院,河南 開封 475000;3河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科,河南 開封475000

涎腺導(dǎo)管癌(salivary duct carcinoma,SDC)是一組發(fā)病率低、惡性程度高的涎腺腫瘤,約占涎腺惡性腫瘤的1%～3%,好發(fā)于腮腺組織,其次是頜下腺,男女發(fā)病率約為2∶1～3∶1,50～60歲男性好發(fā)[1-2]。涎腺導(dǎo)管癌的組織病理學(xué)特征類似于低分化乳腺導(dǎo)管癌,1968年由Kleinsasser等[3]首次報(bào)道,在我國由俞光巖等[4]首次報(bào)道。該腫瘤侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移,常轉(zhuǎn)移至頸淋巴結(jié)、肺、肝、腦、皮膚和骨等,死亡率高,預(yù)后較差[5-6]。FAM83H(Family with sequence similarity 83 member H)是FAM83家族成員之一,位于8號(hào)染色體的長(zhǎng)臂。FAM83H 在牙釉質(zhì)形成過程中起重要作用,其突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳病牙釉質(zhì)礦化不全。近年研究[7-10]發(fā)現(xiàn),FAM83H 在多種類型癌組織中表達(dá)水平明顯升高,是前列腺癌、大腸癌、結(jié)腸癌、膽囊癌、宮頸癌、肺癌等的候選致癌基因。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)FAM83H 在涎腺導(dǎo)管癌組織及非癌涎腺組織中的表達(dá)情況,分析其表達(dá)與涎腺導(dǎo)管癌臨床病理特征間的關(guān)系,為發(fā)現(xiàn)涎腺導(dǎo)管癌的腫瘤生物標(biāo)志物和候選致癌基因提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013 年1 月至2021年1月手術(shù)切除的涎腺導(dǎo)管癌病理標(biāo)本21例及其配對(duì)非癌涎腺組織19例,均由病理檢查證實(shí)。其中男性17例、女性4例,年齡42～85歲(中位年齡59歲),14例發(fā)生于腮腺、5 例發(fā)生于頜下腺、2例發(fā)生于舌下腺,均為首次手術(shù)。術(shù)前未行放化療,按照國際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC,2002)TNM(Tumor Node Metastasis)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分期。本研究獲得河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

標(biāo)本常規(guī)固定、包埋,將石蠟組織進(jìn)行連續(xù)切片,厚度3μm,常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。經(jīng)病理確診為涎腺導(dǎo)管癌和非癌涎腺組織后,采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶標(biāo)記法(Streptomycin avidin peroxidase notation,SP法)檢測(cè)涎腺導(dǎo)管癌及非癌涎腺組織中FAM83H 的表達(dá)情況。組織切片脫蠟后,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的H2O2室溫孵育15 min,PBS洗3次,多聚甲醛固定。采用微波抗原修復(fù)法修復(fù)抗原。滴加SP試劑盒中的A液,37℃孵育15 min,滴加兔抗FAM83H 一抗(1∶200),4 ℃冰箱孵育過夜。第2天,按SP試劑盒說明書要求,依次滴加B液、C液。DAB顯色液顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,返藍(lán),脫水,中性樹膠封片。SP-9001免疫組化染色試劑盒,ZLI-9018濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。兔抗FAM83H 多克隆抗體購自美國Biorbyt公司,貨號(hào)orb183479。

1.3 FAM 83H 免疫組化結(jié)果判定

結(jié)果由2名病理醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行雙盲讀片,每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野(×100)。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色,0分;淺黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):＜1%,0 分;1%～2%,1分;3%～10%,2分;11%～33%,3 分;34%～66%,4 分;67%～100%,5 分。兩種評(píng)分相加為最終得分,得分范圍0～8[11-12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過繪制涎腺導(dǎo)管癌患者死亡的受試者工作曲線(receiver operating characteristic curve,ROC 曲 線)確 定FAM83 H 表達(dá)高低的免疫組化得分界值。運(yùn)用Fisher's精確檢驗(yàn)分析比較FAM83H 在涎腺導(dǎo)管癌和非癌涎腺組織中的表達(dá)差異,及其與涎腺導(dǎo)管癌臨床病理特征間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM 83H 在涎腺導(dǎo)管癌和非癌涎腺組織中的表達(dá)

FAM83H 在涎腺導(dǎo)管癌組織中呈陽性表達(dá),主要表現(xiàn)為棕黃或棕褐色顆粒,彌漫分布于癌細(xì)胞胞質(zhì)中。在非癌涎腺組織中FAM83H 基本不表達(dá),只在導(dǎo)管處呈淺黃或棕黃色顆粒,彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)中。見圖1。

圖1 FAM 83H在涎腺導(dǎo)管癌和非癌涎腺組織中的表達(dá)

在癌旁組織中發(fā)現(xiàn)涎腺導(dǎo)管上皮呈階段性瘤化增生,FAM83H 在各瘤化增生階段的涎腺導(dǎo)管上皮中呈不同程度染色:越靠近癌組織染色越深,表達(dá)量越高;越遠(yuǎn)離癌組織染色越淺,表達(dá)量越低。見圖2。

圖2 FAM 83H在涎腺導(dǎo)管癌癌旁組織的表達(dá)

繪制涎腺導(dǎo)管癌患者死亡的受試者工作曲線,確定FAM83 H 表達(dá)高低的免疫組化得分界值,界值為7。≥7 者定義為高表達(dá),＜7 者定義為低表達(dá)。見圖3。

圖3 涎腺導(dǎo)管癌患者死亡的ROC曲線

FAM83H 在涎腺導(dǎo)管癌中的表達(dá)量明顯高于非癌涎腺組織,P＜0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。

表1 FAM 83H在癌與非癌涎腺組織中的表達(dá)差異

2.2 FAM 83H 的表達(dá)與涎腺導(dǎo)管癌患者臨床病理特征間的關(guān)系

FAM83H 的表達(dá)和涎腺導(dǎo)管癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性,見表2。繪制FAM83 H 表達(dá)預(yù)測(cè)涎腺導(dǎo)管癌患者死亡的ROC曲線,約登指數(shù)法確定FAM83H表達(dá)高低的界值。

表2 FAM 83H表達(dá)與SDC患者臨床病理因素間的關(guān)系

3 討論

涎腺導(dǎo)管癌是一組少見的高度惡性的涎腺腫瘤,易早期浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,早期臨床癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期。研究[13-15]表明,涎腺導(dǎo)管癌患者的預(yù)后與就診時(shí)的TNM 分期有明顯相關(guān)性,早期診斷及治療可顯著提高患者生存率。因此,尋找涎腺導(dǎo)管癌的腫瘤標(biāo)志物及致病基因,進(jìn)行早期診斷和生物靶向治療,對(duì)涎腺導(dǎo)管癌患者的預(yù)后起著關(guān)鍵作用。

FAM83H 最早引起人們的注意是因其在牙釉質(zhì)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,其無義突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的牙釉質(zhì)發(fā)育不全[16]。近年研究[7-8]發(fā)現(xiàn),FAM83H 在多種類型癌組織中表達(dá)水平明顯升高,其DNA 拷貝數(shù)的增加與腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后明顯相關(guān)。在結(jié)腸癌細(xì)胞中,FAM83 H 過表達(dá)與角蛋白纖維降解密切相關(guān),可導(dǎo)致上皮細(xì)胞去極化,對(duì)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要作用[17-18]。Hatanaka課題組[19]利用膽管癌的cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化灶形成研究,發(fā)現(xiàn)FAM83H cDNA斷裂片段具有轉(zhuǎn)移能力,證明FAM83H 在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Nalla等[20]發(fā)現(xiàn),在正常小鼠模型中插入FAM83H 基因可促使前列腺癌的發(fā)生,敲除前列腺癌細(xì)胞中的FAM83H 基因可抑制前列腺癌的發(fā)生,證明FAM83 H 為前列腺癌的致癌基因。在抗癌藥物達(dá)沙替尼敏感/拮抗的肺癌細(xì)胞系的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),拮抗達(dá)沙替尼的癌細(xì)胞中FAM83 H 的磷酸化水平降低了將近10 倍,這表明磷酸化的FAM83 H 參與了達(dá)沙替尼的拮抗作用[21]。

本研究發(fā)現(xiàn),FAM83 H 在非癌涎腺組織的導(dǎo)管上皮及癌旁的涎腺導(dǎo)管上皮中均有不同程度的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了涎腺導(dǎo)管癌的組織來源為涎腺導(dǎo)管上皮[22-24]。涎腺導(dǎo)管癌中FAM83 H 的表達(dá)量顯著高于非癌涎腺組織(P=0.001),且FAM83 H 在癌旁組織中越靠近癌組織染色越深,表達(dá)量越高,越遠(yuǎn)離癌組織染色越淺,表達(dá)量越低,提示涎腺導(dǎo)管癌的發(fā)生可能與FAM83 H 的過表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。本研究未發(fā)現(xiàn)FAM83H 的表達(dá)和涎腺導(dǎo)管癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯相關(guān)。參閱文獻(xiàn)[25-29]發(fā)現(xiàn),FAM83 H 的表達(dá)普遍與腫瘤的組織學(xué)分化程度相關(guān),分化程度越低,FAM83 H 表達(dá)量越高;普遍與患者的性別、年齡無明顯相關(guān);與腫瘤大小、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性腫瘤研究存在差異。這與本文的研究結(jié)果一致。綜上所述,涎腺導(dǎo)管癌的發(fā)生可能與FAM83H的過表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。