李雯雯張亞茹高帆牛玉季杜鋼軍

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所,開封475004

肝癌是惡性腫瘤的代表之一,目前也是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界較為熱點(diǎn)的研究之一。目前臨床上常采用外科手術(shù)、肝移植、經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞、射頻消融、靶向治療、化療等措施[1],雖然從某種程度上可以緩解病情,但也會(huì)使患者機(jī)體的正常功能受損。

廣玉蘭果實(shí)是木蘭科木蘭屬植物廣玉蘭(Magnolia grandifloraL.)的干燥果實(shí)[2]。廣玉蘭果實(shí)性辛溫、無毒,有祛風(fēng)散寒、行氣止痛的功效,外感風(fēng)寒、頭痛、鼻塞、脘腹脹痛、嘔吐、腹瀉、高血壓等是其主要的適應(yīng)證[3]。本研究旨在探討廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥材

制備廣玉蘭果實(shí)水煎液的步驟:①稱取廣玉蘭果實(shí)100 g;②加蒸餾水使其埋沒,充分浸泡30 min;③中火煎煮30 min左右,過濾,得第1次濾液;④加適量蒸餾水,中火煎煮30 min左右,過濾,得第2次濾液;⑤再加適量蒸餾水,中火煎煮30 min左右,過濾,得第3次濾液;⑥合并三次濾液繼續(xù)煎煮并濃縮至200mL;⑦待藥液冷卻至室溫,裝于瓶中,標(biāo)記好名稱、日期,放置于-20 ℃冰箱冷凍。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康的昆明小鼠(雌性,23～28 g),許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0002。

1.3 腫瘤細(xì)胞

河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供H22肝癌細(xì)胞,許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0002。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

FA1004B型電子天平(廣州市典銳化玻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋(濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司);EM-KC150數(shù)顯游標(biāo)卡尺(河?xùn)|區(qū)星光扳鉗工具廠);Thermo FC 型酶標(biāo)儀(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司);超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)驗(yàn)公司);SL2306 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Shellab公司);800型離心機(jī)(上海梅香儀器有限公司);微量移液器(上海佳安分析儀器廠);BCD-539WT 低溫冰箱(中國海爾集團(tuán))等。

1.5 實(shí)驗(yàn)試劑

印度墨汁(1∶4生理鹽水);生理鹽水;75%(v/v)酒精;紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl);蒸餾水;0.1%(m/m)碳酸鈉溶液。

2 試驗(yàn)方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的構(gòu)建

將已腹腔接種7～9 d H22肝癌細(xì)胞的小鼠頸椎脫臼處死,于酒精中充分浸泡消毒;超凈臺(tái)無菌環(huán)境下,將乳白色腹水從小鼠腹腔中抽出;離心(1 000 r/min,5 min);上清倒掉,加紅細(xì)胞裂解液(Tris-NH4Cl),間隔3 min后,二次離心(1 000 r/min,5 min);Tris倒掉,加生理鹽水(滅菌),吹打細(xì)胞后,三次離心(1 000 r/min,5 min);上清倒掉,滅菌的生理鹽水將細(xì)胞稀釋150倍成細(xì)胞懸液;將瘤液接種于小鼠右肢腋部皮下,每只小鼠0.2mL。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

接瘤后,小鼠隨機(jī)分為模型組、廣玉蘭果實(shí)組,各11只。模型組以0.2mL/10 g的劑量灌胃生理鹽水;廣玉蘭果實(shí)組以0.2mL/10 g的劑量灌胃廣玉蘭果實(shí)水煎液,每天1次,連續(xù)灌胃12 d。

2.3 觀察指標(biāo)

測(cè)定瘤體積、瘤質(zhì)量和抑瘤率。當(dāng)手感受到腫瘤長出后,用游標(biāo)卡尺對(duì)瘤的長徑a和短徑b進(jìn)行測(cè)量、記錄,每天1次,并計(jì)算瘤體積V(mm3),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。頸椎脫臼處死小鼠,將瘤完整剝離、稱質(zhì)量,計(jì)算抑瘤率R[4]。

式中,m1為模型組平均瘤質(zhì)量,m2為廣玉蘭果實(shí)組平均瘤質(zhì)量。

2.4 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天,小鼠灌胃廣玉蘭果實(shí)水煎液半小時(shí)后,各組以0.1mL/10 g的劑量尾靜脈注射印度墨汁(1∶4生理鹽水),注射后1 min(t1)眼眶采血20μL加到2mL 0.1%(m/m)的碳酸鈉溶液中,混勻,注射后10 min(t2)再次眼眶采血20μL 加到2mL 0.1%(m/m)的碳酸鈉溶液中,混勻。離心(3 000 r/min,10 min)后,吸取各組上清加入96孔板中,酶標(biāo)儀于620 nm 波長處測(cè)定吸光度A。采完血后,頸椎脫臼處死小鼠,將瘤、肝、脾完整剝離、稱質(zhì)量,計(jì)算吞噬指數(shù)K和吞噬系數(shù)α[5]。

式中,A1、A2分別為取血時(shí)間t1、t2時(shí)的吸光度,M為體質(zhì)量,mli為肝臟質(zhì)量,msp為脾臟質(zhì)量。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)過程

利用上海有機(jī)所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)查詢廣玉蘭的活性成分;用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)篩選其活性成分(設(shè)定OB≥30%、DL≥0.10);由Swiss Target Predication數(shù)據(jù)庫獲取廣玉蘭活性成分靶點(diǎn);由Gene Cards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫分別獲取肝癌和巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的蛋白靶點(diǎn);由Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)分別獲取活性成分靶點(diǎn)與肝癌和巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的交集靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建廣玉蘭抗腫瘤活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和免疫調(diào)節(jié)活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò);由String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分別獲得交集靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系;用Cytoscape 3.2.1軟件分別構(gòu)建抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(PPI);用DAVID 數(shù)據(jù)庫分別對(duì)交集靶點(diǎn)GO注釋和KEGG通路進(jìn)行分析(P＜0.05);由OmicShare高級(jí)氣泡圖獲得GO 和KEGG 富集分析圖;用Cytoscape 3.2.1軟件的merge功能對(duì)廣玉蘭抗腫瘤活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)、免疫調(diào)節(jié)活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Graph Pad Prism 8.0.2統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),借助t檢驗(yàn)完成組間兩兩比較,借助單因素方差分析完成多組間比較。P＜0.05時(shí),顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)小鼠腫瘤的影響

接瘤后第5天,小鼠腋下長出腫瘤。在第8～12 d,模型組小鼠腫瘤增長較快;與模型組比較,廣玉蘭果實(shí)組小鼠腫瘤增長較慢,抑瘤率為31.90%(P＜0.05)。見如表1、圖1。

表1 廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)小鼠腫瘤的影響

圖1 瘤體積變化趨勢(shì)

3.2 廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)小鼠碳粒廓清水平的影響

模型組小鼠吞噬指數(shù)K、吞噬系數(shù)α較低,與模型組比較,廣玉蘭果實(shí)組小鼠吞噬指數(shù)K、吞噬系數(shù)α較高,P＜0.05。見表2。

表2 廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)小鼠碳粒廓清水平的影響

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果

廣玉蘭果實(shí)的活性成分共有5 種:和厚樸酚(honokiol)、厚樸酚(magnolol)、廣玉蘭內(nèi)酯(magnograndiolide)、無梗五加苷B(acanthoside B)、β-谷甾醇(beta-sitosterol),這5 種既是抗腫瘤活性成分,也是免疫調(diào)節(jié)活性成分。廣玉蘭果實(shí)抗腫瘤活性成分—預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有202個(gè)節(jié)點(diǎn),260條邊,見圖2。廣玉蘭果實(shí)抗腫瘤交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(PPI)共有172個(gè)節(jié)點(diǎn),656條邊,見圖3。廣玉蘭果實(shí)免疫調(diào)節(jié)活性成分—預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有202個(gè)節(jié)點(diǎn),260條邊,見圖4。廣玉蘭果實(shí)免疫調(diào)節(jié)交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(PPI)共有172個(gè)節(jié)點(diǎn),659條邊,見圖5。

圖2 廣玉蘭抗腫瘤活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 廣玉蘭抗腫瘤交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖4 廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

廣玉蘭果實(shí)抗腫瘤GO 富集分析篩得49個(gè)生物過程(設(shè)定P＜0.05,count≥9),排行前5個(gè)分別是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“氧化還原過程”“DNA 轉(zhuǎn)錄的正反饋調(diào)節(jié)”“蛋白磷酸化”“蛋白自磷酸化”。廣玉蘭果實(shí)抗腫瘤KEGG 富集分析篩得41條信號(hào)通路(設(shè)定P＜0.05,count≥9)。排行前五個(gè)分別是“癌癥通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“刺激神經(jīng)組織配體-受體的相互作用”“癌癥的蛋白多糖”“Rap1 信號(hào)通路”。

廣玉蘭果實(shí)免疫調(diào)節(jié)GO 富集分析篩得35個(gè)生物過程(設(shè)定P＜0.05,count≥11),排行前5個(gè)分別是“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“氧化還原過程”“DNA 轉(zhuǎn)錄的正反饋調(diào)節(jié)”“蛋白磷酸化”“蛋白自磷酸化”。廣玉蘭果實(shí)免疫調(diào)節(jié)KEGG 富集分析篩得33條信號(hào)通路(設(shè)定P＜0.05,count≥11),排行前5個(gè)分別是“癌癥通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“刺激神經(jīng)組織配體-受體的相互作用”“癌癥的蛋白多糖”“Rap1信號(hào)通路”。OmicShare高級(jí)氣泡圖對(duì)抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)GO 分析結(jié)果的前21項(xiàng)、KEGG 富集的前20項(xiàng)進(jìn)行可視化,見圖6、圖7、圖8。廣玉蘭果實(shí)抗腫瘤活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)共有207個(gè)節(jié)點(diǎn),398條邊,見圖9。廣玉蘭果實(shí)免疫調(diào)節(jié)活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)共有207個(gè)節(jié)點(diǎn),398條邊,見圖10。

圖6 廣玉蘭抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)GO 富集分析

圖7 廣玉蘭抗腫瘤KEGG富集分析

圖8 廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)KEGG富集分析

圖9 廣玉蘭抗腫瘤活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

圖10 廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

4 討論

肝癌發(fā)病率在世界癌癥發(fā)病率中位居第六,死亡率在全球癌癥死亡率中位居第二[6]。目前,從分子生物學(xué)水平研究肝癌的發(fā)病機(jī)制在深入進(jìn)行,這可能是未來治療肝癌的新方向,其已知的發(fā)病機(jī)制[7]如下:①原癌基因(ras基因、HBV X 基因)在化學(xué)因素、病毒因素等作用下異常激活,轉(zhuǎn)變成癌基因,誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。②抑癌基因(P53基因、P21基因、P16基因)突變或失活,使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒约?xì)胞,產(chǎn)生癌癥。③信號(hào)通路(Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、AKT信號(hào)通路)活化異常。④生長因子(肝細(xì)胞生長因子HGF、表皮生長因子EGF、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGF)調(diào)控失衡,細(xì)胞增殖分化異常,產(chǎn)生癌癥。上述基因、通路等與肝癌有很大聯(lián)系,徹底理解它們之間的關(guān)系,有助于改善肝癌治療效果。

中醫(yī)藥依據(jù)不同患者或同一患者不同時(shí)期的病情辨證論治,尤其是在肝癌患者的晚期階段,中醫(yī)藥能夠有效發(fā)揮其自身優(yōu)勢(shì),對(duì)西醫(yī)劣勢(shì)進(jìn)行彌補(bǔ),這也獲得了廣大研究人員的認(rèn)可[8]。

關(guān)于廣玉蘭果實(shí)活性成分和藥理作用的研究較少,鑒于廣玉蘭果實(shí)來源于廣玉蘭,我們推測(cè)二者有相似的活性成分和作用。因此,本研究將廣玉蘭作為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)對(duì)象,可能會(huì)為未來明確廣玉蘭果實(shí)的成分和作用提供參考。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)廣玉蘭有5種活性成分:和厚樸酚、厚樸酚、廣玉蘭內(nèi)酯、無梗五加苷B、β-谷甾醇,這5種成分既是與抗腫瘤相關(guān)的活性成分,也是與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的活性成分。有研究[9]證實(shí),以和厚樸酚、厚樸酚為代表的新木脂素類化合物具有抗腫瘤、抗病毒等多種生物學(xué)活性。無梗五加苷B 對(duì)腫瘤細(xì)胞脂滴的生成有抑制作用[10]。β-谷甾醇具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[11]。廣玉蘭抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)涉及的主要信號(hào)通路:“癌癥通路”“PI3K-Akt信號(hào)通路”“刺激神經(jīng)組織配體-受體的相互作用”“癌癥的蛋白多糖”“Rap1信號(hào)通路”。其中,刺激神經(jīng)組織配體-受體的相互作用是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合。PI3K-Akt信號(hào)通路在多種腫瘤中活化異常,與腫瘤細(xì)胞生長、增殖、代謝有很大聯(lián)系[12]。Rap1信號(hào)通路在多種類型細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、整合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附[13]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:模型組小鼠腫瘤增長較快,瘤質(zhì)量為(3.556±0.745)g;廣玉蘭果實(shí)組小鼠腫瘤增長較慢,瘤質(zhì)量為(2.422±0.825)g,抑瘤率為31.90%(P＜0.05)。表明廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)H22荷瘤小鼠有抗腫瘤作用,提示可能與廣玉蘭抗腫瘤活性成分有關(guān)。

另外,模型組小鼠吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)較低,廣玉蘭果實(shí)組小鼠吞噬指數(shù)和吞噬系數(shù)較高(P＜0.05),表明廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能有增強(qiáng)作用,提示可能與廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)活性成分有關(guān)。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞之一,吞噬并殺滅病原菌和凋亡細(xì)胞[14],在腫瘤的每個(gè)階段都發(fā)揮重要作用。廣玉蘭免疫調(diào)節(jié)活性成分靶向腫瘤微環(huán)境,通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,提高免疫調(diào)節(jié)能力,發(fā)揮間接抗腫瘤作用[15]。

綜上所述,廣玉蘭果實(shí)水煎液對(duì)H22荷瘤小鼠有抗腫瘤作用,這可能是廣玉蘭抗腫瘤活性成分與免疫調(diào)節(jié)活性成分協(xié)同作用的結(jié)果。