非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是指除酒精和其他明確肝臟損傷因素外，以肝細(xì)胞脂肪過度堆積、脂肪變性等為主要特征的臨床綜合征，并可能導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎、肝細(xì)胞癌（HCC）和肝硬化等嚴(yán)重后果。NAFLD 起病隱匿，缺乏早期臨床癥狀，尚未有防治NAFLD的特效藥物。NAFLD患者常常伴有自噬通量受損的現(xiàn)象，自噬體將細(xì)胞內(nèi)脂滴包裹運(yùn)輸?shù)饺苊阁w，特異性結(jié)合形成自噬溶酶體并將脂滴降解成游離脂肪酸的過程稱為脂噬。研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活能夠減少脂滴形成和肝臟甘油三酯沉積，改善NAFLD。雷帕霉素（mTOR）通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白和溶酶體的生物合成在自噬中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。AMPK是mTOR的上游調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子，據(jù)報(bào)道，調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路可以有效減輕脂肪肝變性，AMPK/mTOR通路可能是基于自噬防治NAFLD的重要靶點(diǎn)。

二氫楊梅素（DMY）是一種常見的膳食天然活性物質(zhì)，其化學(xué)本質(zhì)是2,3-二氫黃酮醇化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、細(xì)胞死亡介導(dǎo)和代謝調(diào)節(jié)等作用。研究發(fā)現(xiàn)，DMY能夠改善NAFLD患者的血脂、血糖水平，但其機(jī)制尚不清楚。DMY可通過調(diào)節(jié)自噬途徑對(duì)損傷細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，并緩解肝細(xì)胞脂肪沉積，提示DMY可通過脂噬調(diào)節(jié)肝臟中的脂質(zhì)代謝途徑，但它能否通過影響AMPK/mTOR途徑促進(jìn)脂噬尚未見報(bào)道。因此，本研究基于AMPK/mTOR介導(dǎo)的脂噬的嶄新防治思路來(lái)探索DMY對(duì)NAFLD的防治機(jī)制。

NAFLD 后期發(fā)展嚴(yán)重將會(huì)導(dǎo)致HCC，但目前HCC缺乏有效治療措施。已有研究證實(shí)DMY抑制肝癌細(xì)胞的增殖，DMY 的前體物質(zhì)楊梅素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，但其機(jī)制尚未闡明。本研究將從細(xì)胞周期及DNA斷裂兩方面來(lái)研究DMY對(duì)HepG2的促凋亡機(jī)制。

本研究建立胎牛血清（FBS）誘導(dǎo)人肝細(xì)胞LO2脂肪變性模型，并通過探究對(duì)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）、AMPK、mTOR、自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物（Beclin1）及p62的mRNA表達(dá)的影響初步探討DMY基于AMPK/mTOR介導(dǎo)的脂噬對(duì)LO2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的防治作用；觀察DMY對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用并探討其分子機(jī)制，探索DMY對(duì)NAFLD發(fā)生、發(fā)展的防治作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMY（阿拉丁），LO2和HepG2細(xì)胞系（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）。磷酸鹽緩沖液、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素和胎牛血清（Gibco）。油紅O染色試劑盒、二辛可寧酸（BCA）檢測(cè)試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成）。總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒（北京BHKT）。脫脂奶粉、吖啶橙（AO）（Sigma）?？笹APDH和抗輕鏈3（LC3）抗體（Cell Signaling Technology）。細(xì)胞自噬染色檢測(cè)（MDC）試劑盒（碧云天）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LO2肝細(xì)胞脂肪變性模型的建立 采用FBS誘導(dǎo)LO2細(xì)胞建立脂肪變性模型。研究分為7組，各組均進(jìn)行油紅O 溶液染色測(cè)定脂滴含量：模型組：50% FBSDMEM 培養(yǎng)LO2 細(xì)胞24 h；陽(yáng)性對(duì)照組：100 μg/mL DMY處理24 h；處理組：在不含DMY的50%FBS-DMEM培養(yǎng)24 h，后在梯度濃度DMY（50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL DMY）中處理24 h?；謴?fù)對(duì)照組：50%FBSDMEM中培養(yǎng)24 h，后在10%FBS-DMEM中培養(yǎng)24 h。DMY預(yù)處理：造模前使用DMY處理24 h。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q-PCR）檢測(cè)AMPK/mTOR通路自噬相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平 100 μg/mL DMY處理LO2正常細(xì)胞24 h后，使用50%FBS造模24 h，1 mL TRIzol 收集細(xì)胞，后加入200 μL 氯仿，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上層清液400 μL，加入等體積異丙醇，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，75%乙醇洗滌沉淀2次，Nano drop 2000c（Thermo Fisher Scientific,ND2000）測(cè)定RNA濃度及純度并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific，StepOnePlus）進(jìn) 行Quantitative Real-time PCR擴(kuò)增，運(yùn)用2法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，具體引物列表如下表1。

1.2.3 AO 染色鑒定細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的形成與分布使用100 μg/mL DMY處理正常LO2細(xì)胞12 h，后加入1 μg/mL AO染料染色20 min，PBS溶液沖洗3次。采用熒光顯微鏡（Olympus，IX-73）在波長(zhǎng)460～495 nm范圍內(nèi)，通過藍(lán)色激發(fā)濾光片捕獲最終圖像。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成與分布100 μg/mL DMY處理LO2正常細(xì)胞12 h后，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)冷的2.5%戊二醛固定細(xì)胞并制備成切片，透射電子顯微鏡（TEM）（Hitachi 7500）下觀察、記錄結(jié)果。

1.2.5 Western blot測(cè)定自噬關(guān)鍵蛋白LC3的表達(dá)情況收集各組細(xì)胞并提取蛋白備用。12%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，后分別加入LC3和GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜。TBST溶液洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h。最后，使用試劑盒可視化目標(biāo)條帶并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3）環(huán)保效益。由于套管氣含有H2S、CO等有害氣體，排放到大氣中將污染環(huán)境，其溫室效應(yīng)是C02的21倍。有毒氣體嚴(yán)重地影響了石油企業(yè)的職工和當(dāng)?shù)厝罕姷纳硇慕】怠?/p>

2.2.1 DMY糾正LO2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂 陽(yáng)性對(duì)照組與對(duì)照組相比，AST、ALT、LDH酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，表2），但模型組的AST、ALT、LDH酶活性較對(duì)照組分別高3.0、5.8、1.9倍（＜0.05）；與模型組相比，DMY處理組LO2細(xì)胞ALT、AST和LDH水平顯著下降（＜0.05），高劑量組的AST、ALT、LDH酶活性恢復(fù)到對(duì)照組水平（＞0.05）。恢復(fù)對(duì)照組的相關(guān)酶活性較模型組比有所下降（＜0.05），但仍為對(duì)照組的2.4、2.7、1.1倍（表2）。

1.2.2 TC、TG、LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性測(cè)定 收集各組細(xì)胞的上清液，按照試劑盒說明書對(duì)TC、TG、LDL含量水平和AST、ALT和LDH的酶活性進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯試驗(yàn)DMY（50、100、200 μg/mL）處理HepG2細(xì)胞48 h后使用胰蛋白酶消化，獲得細(xì)胞沉淀。細(xì)胞分成兩組，一組加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）溶液避光孵育15 min，一組用PI染色作為空白對(duì)照。流式細(xì)胞儀于488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

播種前通常需要人工選擇種子，并去除一些有病斑、蟲咬、碎屑和破損的種子。播種前5～10天，待播大豆種子在陽(yáng)光下攤開3～5天的干燥時(shí)間，用來(lái)提高大豆種子的酶活性，提高種子的發(fā)芽率，需要注意經(jīng)常翻轉(zhuǎn)。種子在陽(yáng)光下。種子干燥后，按1:70～100的比例混合35%的DOFO混合物。在重茬田中，0.5%和50%多福合劑的用量和0.3%和50%多菌靈的劑量可降低大豆種子病的風(fēng)險(xiǎn)。

相同條件處理的HepG2 細(xì)胞收集后，用70%酒精-20 ℃下固定12 h，后用含有PI的RNase溶液進(jìn)行染色，37 ℃避光培養(yǎng)30 min，PBS漂洗3次，用流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記的細(xì)胞及使用Cell Quest Research Software分析細(xì)胞周期。

車行隧道與下臥地鐵隧道施工期相互影響的研究…………………………………… 林治平，劉惠康，隋耀華（7-131）

在商業(yè)銀行客戶滿意度的評(píng)定方面，為了反映不同指標(biāo)的重要程度，對(duì)它們賦予不同的權(quán)值是否合理關(guān)系到模型最終評(píng)判的結(jié)果。層次分析法(Analytic Hierarchy Process，縮寫為AHP)把評(píng)價(jià)總目標(biāo)分解成各級(jí)評(píng)價(jià)指標(biāo)，從高到低排成若干層次，然后對(duì)每層中的評(píng)價(jià)因素進(jìn)行兩兩對(duì)比打分，最后通過簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)運(yùn)算就能得到各指標(biāo)所占的比例。鑒于其可操作性比較強(qiáng)，本文以此方法為例說明。借鑒前人的研究成果，采用目前應(yīng)用較為廣泛的1～9標(biāo)度法[10]，對(duì)每一層次各指標(biāo)間的相對(duì)重要程度進(jìn)行兩兩比較判斷，采用求平均值的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，得到判斷矩陣。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過單因素方差分析和多重比較分析不同組之間的差異，＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)于我國(guó)的智能電網(wǎng)，從當(dāng)前的使用來(lái)看，遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)這兩種算法得到了廣泛的應(yīng)用，這也讓電力系統(tǒng)智能化能夠有一個(gè)非常堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠?qū)﹄娏ο到y(tǒng)中一些復(fù)雜的非線性問題進(jìn)行計(jì)算，從而解決問題，而基礎(chǔ)為生物神經(jīng)系統(tǒng)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，由于其科學(xué)化、高效化以及智能化的特點(diǎn)，在智能電網(wǎng)的應(yīng)用非常的普及。同時(shí)也隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，我國(guó)對(duì)于智能電網(wǎng)的建設(shè)腳步也不斷的加快，繼電保護(hù)技術(shù)智能化的發(fā)展也越來(lái)越迅速。同時(shí)，對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行運(yùn)用，分析系統(tǒng)故障的樣本信息，能夠在最快的之間只能發(fā)現(xiàn)發(fā)生故障的部位，從而對(duì)故障能夠及時(shí)的進(jìn)行排除，讓系統(tǒng)的工作效率有效提升。

2 結(jié)果

2.1 DMY抑制LO2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積

2.3.1 DMY促進(jìn)LO2細(xì)胞自噬體和自噬溶酶體的形成處理組的橙色熒光強(qiáng)度大于對(duì)照組（圖2A），自噬溶酶體含量較對(duì)照組增多。TEM鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DMY處理后，自噬體的數(shù)量也顯著增加（圖2B）。

2.2 DMY對(duì)LO2細(xì)胞酶活性及脂質(zhì)代謝的影響

1.2.6 細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒（MDC法）檢測(cè)DMY預(yù)處理對(duì)脂肪變性模型自噬體形成的影響 100 μg/mL DMY 處理LO2 正常細(xì)胞24 h 后，使用50%FBS 造模24 h，PBS清洗1次后加入MDC染液，避光孵育15 min，Assay Buffer清洗3次，再加入1 mL Assay Buffer，置于熒光顯微鏡在激發(fā)波長(zhǎng)為330～360 nm范圍內(nèi)，發(fā)射波長(zhǎng)為510～540 nm范圍內(nèi)觀察自噬體的染色熒光強(qiáng)度。

陽(yáng)性對(duì)照組與對(duì)照組相比，TG、TC和LDL水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。高FBS誘導(dǎo)后，LO2細(xì)胞中的TG、TC 和LDL 水平比對(duì)照組高7.8、3.9、6 倍（＜0.05，表2）。與模型組相比，DMY處理組的TC、TG和LDL水平顯著降低（＜0.05），高劑量組的脂質(zhì)指標(biāo)水平與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）?；謴?fù)對(duì)照組的脂質(zhì)水平較模型組略有下降（＜0.05），但仍為對(duì)照組的2.4、2.7、1.1倍（表2）。

2.2.2 DMY預(yù)處理對(duì)LO2細(xì)胞酶活性及脂質(zhì)代謝影響DMY預(yù)處理組AST、ALT、LDH酶活性顯著低于模型組（＜0.05，表3），且高劑量預(yù)處理組呈現(xiàn)更好的保護(hù)作用，AST、ALT、LDH比模型組分別下降2.0、2.6和1.1倍（＜0.05）。

DMY 預(yù)處理后TC、TG 和LDL 水平也顯著降低（＜0.05），且高劑量的DMY抑制TC和TG堆積效果更好，高劑量組的TC 和TG 水平分別比模型組的下降83.8%和67.3%（＜0.05，表3）。

2.3 DMY對(duì)LO2細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞核周圍分布較大的紅色或橙色脂滴（圖1A、1B），說明造模成功。圖1C、D和E顯示，DMY處理組的脂滴明顯比模型組少，DMY預(yù)處理的陽(yáng)性對(duì)照組（圖1F），未觀察到明顯脂滴?；謴?fù)對(duì)照組觀察到有較明顯脂滴，但脂滴含量較模型組少（圖1G）。

2.3.2 DMY促進(jìn)LO2細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的表達(dá) 隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3的表達(dá)量明顯增加（圖3A），在12 h處與對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＜0.001）；LC3的表達(dá)量隨著DMY干預(yù)濃度上升而上升（圖3B），干預(yù)濃度為200 μg/mL（＜0.001）表達(dá)量最大。

1.2.9 HepG2細(xì)胞DNA斷裂分析HepG2細(xì)胞用DMY（50、100、200 μg/mL）處理48 h，分別收集于裂解液中，37 ℃孵育30 min，后55 ℃恒溫1 h；將產(chǎn)物溶解在含有0.25 mg/mL蛋白酶K和0.03 mg/mL RNase的溶液中。苯酚-氯仿混合液分離DNA，異丙醇純化。70%乙醇洗滌3次后溴化乙錠染色，2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外線透射儀（Tanon 1600）下成像。

2.4 DMY通過AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬改善高FBS誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞損傷

2.4.1 DMY減輕高FBS誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞自噬體形成抑制 正常LO2 細(xì)胞的自噬過程處于動(dòng)態(tài)的穩(wěn)定（圖4A1），高脂損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬體含量下降，熒光強(qiáng)度下降（圖4B1）。DMY預(yù)處理-FBS組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度上升，自噬體的形成恢復(fù)（圖4C1）。

2.4.2 DMY改善AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬通路相關(guān)因子mRNA表達(dá) FBS誘導(dǎo)后，LC3的mRNA含量明顯下降，而DMY預(yù)處理-FBS組細(xì)胞的LC3 mRNA含量明顯上升（圖5A），同時(shí)，ATG 7（圖5B）和AMPK（圖5C）的mRNA 含量也顯著上升。而mTOR（圖5D）及p62（圖5E）的mRNA含量則明顯下降，并且Beclin1（圖5F）的mRNA含量也略有上升。

由式(7)和(8)可知點(diǎn)(0，0)，(1，0)，(0，1)和點(diǎn) (1，1)是均衡點(diǎn)。令 p'=可知，當(dāng)滿足時(shí)，點(diǎn)(p'，q')也是均衡點(diǎn)。

①納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選的患者均符合2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，意識(shí)清醒，可以正常溝通，資料齊全，自愿參與本次研究。②排除標(biāo)準(zhǔn)：排除了合并存在嚴(yán)重臟器疾病患者以及既往存在精神病史、無(wú)法正常溝通患者，排除了資料不齊全、不配合研究的患者[3]。

2.5 DMY促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡

對(duì)照組沒有顯示清晰的DNA階梯泳帶，DMY處理組觀察到清晰的DNA 階梯泳帶，泳帶末端濃度隨著DMY 濃度的增加而增加（圖8），提示DMY 處理后HepG2細(xì)胞的DNA斷裂情況增加。

除了政治經(jīng)濟(jì)現(xiàn)代化方面進(jìn)行理論創(chuàng)新之外，我們?cè)谏鐣?huì)現(xiàn)代化、文化現(xiàn)代化、生態(tài)現(xiàn)代化、國(guó)際現(xiàn)代化方面也進(jìn)行了理論創(chuàng)新，先后提出了構(gòu)建社會(huì)主義和諧社會(huì)、建設(shè)社會(huì)主義先進(jìn)文化、建設(shè)社會(huì)主義核心價(jià)值觀、推進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)美麗中國(guó)、建設(shè)“一帶一路”和構(gòu)建人類命運(yùn)共同體等。

2.6 DMY誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯

DMY處理后S期HepG2細(xì)胞分布明顯增加，并隨DMY濃度增高而增加（圖7），對(duì)照組S期細(xì)胞分布率為32.31%，高劑量DMY組的增加至70.17%（表4）。各組間G2/M期無(wú)顯著差異，G0/G1期百分比隨S期細(xì)胞分布率增多而降低（表4）。

2.7 DMY促進(jìn)HepG2細(xì)胞DNA斷裂

中劑量和高劑量DMY處理組的細(xì)胞凋亡百分比與對(duì)照組相比，早期凋亡比例無(wú)明顯差異（圖6），晚期細(xì)胞凋亡百分比明顯增加（44.08%，57.86%4.74%）。

3 討論

DMY是一種2,3-二氫黃酮醇化合物，是著名的藥食兩用植物顯齒蛇葡萄中含量最豐富的黃酮物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及代謝調(diào)節(jié)等作用。研究表明，DMY可以緩解油酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，并具有改善NAFLD的作用，但目前其對(duì)NAFLD的發(fā)生、發(fā)展的防治機(jī)制尚不明確。

本研究首先觀察了DMY干預(yù)或預(yù)處理對(duì)LO2細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積及脂質(zhì)代謝、肝酶活性影響。結(jié)果顯示，DMY干預(yù)高脂誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂滴含量明顯降低，且AST、ALT和LDH酶活性明顯下降，TC、TG和LDL水平顯著降低，說明DMY具有防止肝細(xì)胞損傷、抑制脂質(zhì)蓄積的作用，該結(jié)果與Xie等的研究報(bào)道DMY可以降低油酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞的TG和TC水平結(jié)果一致。研究表明，血脂水平與NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)正相關(guān)，降血脂、預(yù)防脂肪變性是防治NAFLD最重要的措施。本研究發(fā)現(xiàn)，DMY可以預(yù)防肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂，DMY預(yù)處理24 h可以降低LO2細(xì)胞的TC、TG和LDL水平和AST、ALT和LDH酶活性，說明DMY預(yù)處理可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，緩解高脂損傷，具有保護(hù)肝細(xì)胞、預(yù)防脂脂質(zhì)沉積的作用，這與之前的研究報(bào)道DMY對(duì)LPS/D-半乳糖胺（LPS/D-GalN）誘導(dǎo)的小鼠重型肝炎具有預(yù)防和保護(hù)效果結(jié)論相一致，而DMY預(yù)處理降低棕櫚酸誘導(dǎo)的人胚胎肝細(xì)胞系HHL-5脂質(zhì)損傷模型的氧化應(yīng)激程度的結(jié)論更佐證了本研究對(duì)肝細(xì)胞的高脂損傷具有預(yù)防作用的結(jié)果。

本研究進(jìn)一步基于脂噬研究了DMY的肝保護(hù)作用機(jī)制。脂噬是一種特殊的細(xì)胞選擇性自噬，是正常肝細(xì)胞清除多余脂滴的重要手段。已有研究報(bào)道DMY可通過參與自噬過程緩解酒精性肝損傷并延緩脂肪變性，提示DMY可能參與脂噬修復(fù)過程。結(jié)果顯示，DMY的預(yù)處理可激活LO2細(xì)胞的自噬體和自噬溶酶體的形成，進(jìn)一步檢測(cè)自噬關(guān)鍵蛋白LC3的含量，發(fā)現(xiàn)LC3表達(dá)量隨DMY處理濃度上升而上升。本研究與相關(guān)研究報(bào)道DMY可誘導(dǎo)自噬體和自噬溶酶體的形成，并促進(jìn)酒精性脂肪肝小鼠肝細(xì)胞LC3蛋白的表達(dá)的結(jié)論相一致。據(jù)此，我們推測(cè)DMY預(yù)處理可能通過激活自噬來(lái)防止高脂損傷。

自噬不僅影響肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝，而且保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷和死亡。自噬的關(guān)鍵標(biāo)志蛋白主要包括LC3，Beclin1和p62。細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)發(fā)生時(shí)，自噬體膜上的LC3可識(shí)別脂滴上的自噬受體，通過ATG3和ATG7參與多聚泛素化反應(yīng)形成自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，將脂滴降解為脂肪酸，進(jìn)入脂質(zhì)代謝循環(huán)。LC3對(duì)自噬體的形成極為重要，包括LC3A，LC3B，LC3B2和LC3C 4種亞型，主要分為胞漿形式的LC3-I和膜形式的LC3-II，LC3-I可以被ATG7激活形成LC3-II，附著于前自噬體和自噬體膜上，與自噬呈正相關(guān)。選擇性自噬最具特征的底物之一是p62，p62通過LC3相互作用區(qū)與LC3直接作用，隨后被并入自噬體后降解，p62與自噬呈負(fù)相關(guān)。Beclin1是自噬調(diào)控的關(guān)鍵因子，可以調(diào)動(dòng)自噬相關(guān)蛋白定位于前自噬體。AMPK是一種調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要能量傳感器，mTOR是營(yíng)養(yǎng)敏感激酶，mTOR 及AMPK 參與自噬的上游通路，AMPK可以通過mTOR抑制間接激活自噬啟動(dòng)子磷酸化的ULK，同時(shí)AMPK也可以直接激活ULK進(jìn)行磷酸化，從而啟動(dòng)自噬途徑。

在咱東北，桓仁、新賓到通化這一帶，小孩兒要是哭、鬧，不聽話，大人就嚇唬：“再鬧，老杲子來(lái)啦!大虎杲子來(lái)啦?。　薄袄详阶印边@名是啥時(shí)候留下來(lái)的呢？在王杲做古埒城城主的時(shí)候留下來(lái)的。

本研究結(jié)果顯示，高FBS誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞自噬體的形成受到抑制，而DMY 預(yù)處理后，高FBS 誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞自噬體形成抑制得到有效減輕。同時(shí)，高FBS誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)水平明顯下降，說明其自噬通量受損，而DMY預(yù)處理后LC3、ATG7 和Beclin1 mRNA水平都明顯上升，而p62mRNA水平明顯下降，說明DMY具有正向調(diào)控自噬體的形成過程的作用。據(jù)報(bào)道，抑制AMPK可抑制肝臟自噬，而AMPK抑制可導(dǎo)致肝臟脂肪變性。結(jié)果顯示AMPK mRNA水平顯著上升，同時(shí)與自噬呈負(fù)相關(guān)的mTOR mRNA水平下降，說明DMY對(duì)自噬體形成的促進(jìn)作用是經(jīng)由AMPK/mTOR 上游通路發(fā)生的。AMPK/mTOR 介導(dǎo)的自噬激活是NAFLD的重要保護(hù)機(jī)制。研究表明，AMPK/mTOR介導(dǎo)的自噬水平在高脂飲食的小鼠和用游離脂肪酸處理的LO2細(xì)胞中都受到顯著抑制，這與我們的研究結(jié)果相一致。據(jù)報(bào)道，對(duì)乙酰氨基酚可加速NAFLD的脂肪蓄積，其潛在機(jī)制可能與抑制AMPK/mTOR途徑相關(guān)的自噬有關(guān)，而LRG和FNDC5改善NAFLD的主要機(jī)制是激活A(yù)MPK/mTOR介導(dǎo)的自噬。因此，DMY預(yù)處理極有可能是通過激活A(yù)MPK/mTOR介導(dǎo)的脂噬途徑來(lái)改善NAFLD脂肪蓄積，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞、預(yù)防脂肪變性等作用。

具有地方高校特色的公共數(shù)學(xué)課程教學(xué)模式改革適用于地方高校理、工、經(jīng)、管、生、農(nóng)等有公共數(shù)學(xué)課程的專業(yè)人才培養(yǎng)，包括分類分級(jí)教學(xué)、管理機(jī)制、協(xié)同共享改革、學(xué)科競(jìng)賽、自主學(xué)習(xí)模式和精品資源共享平臺(tái)建設(shè)等，充分體現(xiàn)了因材施教和OBE教學(xué)思想，以及以學(xué)生發(fā)展為本的教學(xué)理念．

NAFLD發(fā)展可能導(dǎo)致多種不良的難以逆轉(zhuǎn)的疾病結(jié)局，尤其是HCC。NAFLD作為代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，可使肝細(xì)胞腺瘤向HCC轉(zhuǎn)化。研究證實(shí)DMY不僅可以緩解高脂肝毒性癥狀，對(duì)HCC也有抗癌效果。細(xì)胞凋亡是抗癌藥物的基本作用機(jī)制，其特征在于誘發(fā)DNA 斷裂、細(xì)胞周期停滯等。有研究顯示，DMY可以改變細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)G2/M期阻滯，本研究結(jié)果提示，DMY干預(yù)可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞晚期凋亡，并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的G0/G1期阻滯；同時(shí)，DMY 還誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞的DNA 斷裂。因此，DMY可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)DNA斷裂來(lái)促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，這與Fang D等的報(bào)道，高良姜素、扁柏雙黃酮等黃酮類物質(zhì)通過誘導(dǎo)G0/G1期阻滯并促進(jìn)凋亡發(fā)揮抗HCC的機(jī)制一致。

綜上所述，本研究證實(shí)DMY可以降低高脂誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞損傷程度并改善脂質(zhì)代謝紊亂；DMY預(yù)處理可以促進(jìn)自噬體和自噬溶酶體形成，并激活A(yù)MPK/mTOR介導(dǎo)的脂噬；同時(shí)，DMY可以通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)HepG2 細(xì)胞凋亡，減緩HCC 發(fā)生。本研究首次探索DMY 可以通過激活A(yù)MPK/mTOR 介導(dǎo)的脂噬途徑來(lái)預(yù)防NAFLD，為NAFLD防治提供新思路，并通過預(yù)防-治療-延緩發(fā)展的思路探索DMY對(duì)NAFLD發(fā)生、發(fā)展的作用。在未來(lái)研究工作中，將進(jìn)一步利用動(dòng)物模型深入探討DMY在肝臟代謝、脂質(zhì)代謝中的作用及基于脂噬的防治機(jī)制，為DMY作為防治NAFLD候選藥物提供科學(xué)依據(jù)。