梁 群 楊 洋 李 帥 潘郭海容 朱永志△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

腦出血（ICH）又稱出血性卒中，隨著年齡的增長腦出血發(fā)生的風險明顯增加，但目前50歲以下的發(fā)病率穩(wěn)定上升，占比逐漸增大，治療及預后并沒有得到明顯改善[1-2]。近期的研究多集中于出血性卒中病理機制的研究，以期為臨床治療尋找潛在的靶點，但由于其復雜性和局限性，進展一直有限[3]。

有研究顯示，神經(jīng)損害是腦出血發(fā)生后出現(xiàn)的腦水腫、氧化應激等繼發(fā)性腦損傷導致的，神經(jīng)元是患者神經(jīng)功能恢復的重要因素[4]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號轉(zhuǎn)導通路對神經(jīng)細胞增殖、分化、抑制凋亡意義非凡，對血管新生亦十分重要[5]。糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它的高表達可加重神經(jīng)元的損傷，且GSK-3β的促凋亡作用此前已被證明通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路途徑負調(diào)控[6]。“中風1號”是一種用于出血性中風急性期的中藥方劑，本研究將其應用于腦出血模型大鼠，通過觀察其對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路、GSK-3β蛋白表達的調(diào)控，來探索中醫(yī)、中藥對出血性卒中治療的可行性，進一步探討其作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別體質(zhì)量200～240 g的SD雄性大鼠40只，購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。在自然光線的實驗室使用普通專用飼料喂養(yǎng)，溫度（22±4）℃，相對濕度40%～70%，經(jīng)過1周適應性飼養(yǎng)后進行實驗，操作過程及處死方式遵循國際通用實驗動物使用指南。

1.2 實驗藥物 中風1號，組方：水蛭10 g，澤瀉10 g，三七粉10 g，生大黃5 g，生地黃5 g，飲片購自黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室。大鼠用藥灌胃量按動物體表面積比率計算[7]，水煎至每毫升含藥3.5 g（3.5 g/mL）。20%甘露醇注射液，石家莊四藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格50 mL/瓶，國藥準字H1302303。

1.3 試劑與儀器 Western blotting一抗二抗去除液（P00258 Beyotime）；完全不含EDTA的蛋白酶抑制劑（04693159001Roche）；5×Protein Loading Buffer（B130043 Biosntech）；Page ruler prestained protein ladder（26617 Thermo）；RIPALysis Buffer（P00013B Biosntech）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（BL508A Biosharp）；TrisBase（T1378 Sigm）；Glycine（NC-S0002-500納川）；Sodium dodecyl sulfate（NC-0227-500納川）；封閉專用脫脂奶粉（P1622普利萊）；Tween20（0777 Amresco）；Western HRP Substrate（NC-WBLUR0500F Millipore）；異丙醇、甲醇（西隴化工）；電泳儀（042BR13724 Bio-Rad）；低溫離心機（SORVALLST8/8R Thermo）；轉(zhuǎn)膜儀（221BR52130 Bio-Rad）；酶標儀（MULTISKANFC Thermo）。

1.4 分組與造模 將40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只。分別為假手術(shù)組、模型組、中風1號組、甘露醇組，將1∶10的水合氯醛粉劑與生理鹽水混合，振搖至完全溶解，按400 mg/kg注射于大鼠腹腔，約8～10 min后，用鑷子輕夾大鼠四肢，確定大鼠進入麻醉狀態(tài)，將其俯臥固定于立體儀上，頭部毛發(fā)剃除，常規(guī)備皮，前囟抬高約1 mm，以碘伏消毒，在頭部正中割2.5 cm縱形切口，使用擴皮器牽開切口，在前囟點右側(cè)3.5 mm，再延矢狀面在后側(cè)0.2 mm處取點，牙鉆鉆孔，深及骨膜，有鏤空感即止[8]。注射器抽取大鼠尾部動脈血（血量＞70 μL）后，迅速用微量注射器抽取60 μL，并將其固定于定位儀，使微量注射器針頭垂直于顱骨圓孔，進針深約6.0 mm，將動脈血緩慢注入大鼠腦內(nèi)，時間約為2 min，留針10 min以防血液倒流，緩慢退針，牙科水泥封孔，縫合手術(shù)創(chuàng)面，為防感染，于縫合處覆蓋少量青霉素鈉粉末[9]。假手術(shù)組不注入動脈血，只做開顱、鉆孔。

1.5 給藥方法 首次給藥時間為術(shù)后24 h，參考成人劑量與人體質(zhì)量的折算系數(shù)比例公式來計算大鼠用藥量，且已于前期實驗研究確定用藥劑量。模型組、假手術(shù)組：生理鹽水1.5 mL灌胃，生理鹽水1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。中風1號組：中藥湯劑1.5 mL灌胃，生理鹽水1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。甘露醇組：生理鹽水1.5 mL灌胃，甘露醇1 g/kg尾靜脈注射，每日2次。各組持續(xù)給藥7 d。

1.6 神經(jīng)行為學評分 于術(shù)后24 h（給藥前）、3、7 d進行神經(jīng)功能評分，采用改良版的神經(jīng)功能缺損評定標準（mNSS）[10]進行評分，分值0～18分。

1.7 Western blotting檢測 術(shù)后第8天予乙醚麻醉后，斷頭處死大鼠，取血腫區(qū)的腦組織20 mg，提取蛋白，取20～40 μg蛋白溶液RIPALysisBuffer補齊一致，加入5×Protein Loading Buffer，金屬浴100 ℃，5 min。取含20 μg蛋白的溶液上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗、二抗，ECL顯色，置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS25統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。計量資料采用獨立樣本t檢驗（不符合正態(tài)性采用非參數(shù)檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1。術(shù)后24 h，與假手術(shù)組比較，各造模組神經(jīng)功能評分明顯升高（P＜0.05），而模型組、中風1號組、甘露醇組分別兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），證明造模成功。術(shù)后3、7 d，各造模組與假手術(shù)組比較評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中風1號組、甘露醇組分別與模型組比較評分明顯降低（P＜0.05），提示中風1號能改善腦出血后大鼠的神經(jīng)功能。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別模型組假手術(shù)組中風1號組甘露醇組n 8 8 8 8術(shù)后24 h 11.6±1.5*1 11.2±1.8*10.9±1.6*術(shù)后3 d 15.7±1.8*1 13.8±1.6*△11.8±1.2*△術(shù)后7 d 15.4±1.7*1 11.6±1.9*△9.2±1.4*△

2.2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表達水平比較 見表2，圖1。與假手術(shù)組相比，模型組PI3K、Akt蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達顯著增高（P＜0.05）。與模型組相比，中風1號組、甘露醇組PI3K、Akt蛋白表達均顯著上升（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達顯著下降GSK-3β（P＜0.05）。而中風1號組與甘露醇組相比，PI3K、Akt蛋白表達有明顯差異（P＜0.05），GSK-3β蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠PI3K、Akt、GSK-3β蛋白相對表達量比較（±s）

注：與中風1號組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01。

組別模型組假手術(shù)組中風1號組甘露醇組n 8 8 8 8 PI3K 0.701±0.035*1.159±0.038 0.819±0.054*△0.945±0.055*△△▲Akt 0.748±0.046*1.245±0.046 0.882±0.059*△1.028±0.072*△△▲GSK-3β 1.717±0.075*1.287±0.040 1.556±0.073*△1.480±0.079*△

圖1 各組大鼠腦組織PI3K、Akt、GSK-3β蛋白表達

3 討 論

腦血管病變是腦出血發(fā)病的主要原因，在腦出血發(fā)生后，腦血腫及腦組織在破壞過程中所釋放的炎癥因子、毒性因子導致了神經(jīng)細胞的凋亡和神經(jīng)纖維的斷裂[11]。如何抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕神經(jīng)功能缺陷，成為改善臨床患者治療及預后的研究重點。腦出血發(fā)生后會釋放出神經(jīng)細胞生長因子等具有絡氨酸酶活性的物質(zhì)，這種活性物質(zhì)會特異性地結(jié)合PI3K的調(diào)節(jié)亞基，使PI3K下游效應分子Akt獲得催化[12]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K下游效應的主要中介，協(xié)調(diào)多種胞內(nèi)信號，控制細胞對外界刺激的反應，Akt被激活后可以使下游靶向蛋白磷酸化，發(fā)揮抗凋亡作用[13]。有研究顯示，大腦中動脈閉塞后5 h在缺血病灶區(qū)神經(jīng)元可測到磷酸化Akt[14]，由此可見PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在細胞新陳代謝、增殖、凋亡中起到重要的作用，和神經(jīng)功能損傷密切相關(guān)。GSK-3β是Akt信號通路下游的重要靶點，是細胞保護信號通路的會聚點，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元極性、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性紊亂等方面有重要意義[15]，進一步激活GSK-3β的促凋亡作用，可加重神經(jīng)細胞損傷[16]，由此可見GSK-3β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性和急性疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17]。越來越多的研究表明，能夠激活PI3KAkt信號轉(zhuǎn)導通路，并抑制GSK3β蛋白活性的藥物可以在腦出血發(fā)生后起到神經(jīng)保護的作用[18]。

腦出血在中醫(yī)學屬“中風-中臟腑閉證-陽閉”的范疇，基本病機為臟腑陰陽失調(diào)、氣血逆亂。逆亂的氣血上沖至腦，使神竅閉阻，血菀腦腑，髓破血溢。多由內(nèi)傷積損，產(chǎn)生瘀血、痰火、肝風、風火，加之外邪侵襲、情志不遂、飲食不節(jié)、勞逸過度等因素誘發(fā)[19]。中醫(yī)中藥從整體出發(fā)，在腦出血的治療及預后貢獻了一定的作用，說明中醫(yī)藥在這一領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢?！爸酗L1號”是全國名中醫(yī)藥專家傳承工作室指導教師朱永志教授多年治療急性腦出血臨床經(jīng)驗的總結(jié)，由水蛭、澤瀉、三七粉、生大黃、生地黃配伍而成，化痰祛風，以使血脈暢通、祛瘀生新、消濁祛痰，以達到標本兼治的目的[20-21]。甘露醇注射液是臨床搶救腦部疾患常用的一種降低顱內(nèi)壓的高滲降壓藥，在其進入體內(nèi)后能迅速提高血漿滲透壓，使組織脫水，降低顱內(nèi)壓、眼內(nèi)壓，經(jīng)腎小球濾過后，不易被腎小管重吸收，增加尿滲透壓，可帶出體內(nèi)大量水分，減輕腦水腫，因此選作對照用藥。

本研究建立腦出血大鼠模型，觀察術(shù)后24 h、3 d、7 d神經(jīng)功能損傷評分，發(fā)現(xiàn)“中風1號”可以有效緩解大鼠腦出血后神經(jīng)功能的損害，雖與甘露醇組有一定差距，但也是具有顯著效果的。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)“中風1號”對PI3K/Akt、GSK-3β蛋白表達的有調(diào)控作用，可以有效提高PI3K、Akt的蛋白表達，降低GSK-3β的蛋白表達。因此我們假設“中風1號”可以通過激活PI3K/Akt信號通路，來抑制GSK-3β的促凋亡作用，以達到減少神經(jīng)細胞凋亡、減輕腦出血后神經(jīng)功損傷，改善預后的目的。從研究中可以看出“中風1號”在調(diào)控PI3K、Akt蛋白表達方面發(fā)揮了較為明顯的作用，但與甘露醇的調(diào)控效果還具有一定差異，可在抑制GSK-3β蛋白表達方面與甘露醇無明顯差異，究竟是什么原因使“中風1號”在調(diào)控GSK-3β蛋白表達上能力更突出，有待進一步研究。