王 叢 楊 旭 唐艷芬

（南京中醫(yī)藥大學(xué)南通附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226000）

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是排除心源性因素后出現(xiàn)頑固性低氧血癥和呼吸窘迫為特征的危重疾病[1]。ARDS的出現(xiàn)不僅僅是肺內(nèi)因素，外科手術(shù)、膿毒癥、大量輸血等肺外因素均可出現(xiàn)ARDS，核心病理改變是炎癥反應(yīng)失衡、肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮屏障受損[2-4]。隨著醫(yī)療水平越來(lái)越高，呼吸機(jī)支持、體外膜肺氧合等技術(shù)手段不斷進(jìn)步，ARDS病死率較前下降，但仍高達(dá)30%～50%左右，因此ARDS的治療仍是臨床難題[5]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在治療急危重癥中起到很大作用，尤其是能阻斷輕癥患者向重癥轉(zhuǎn)化，為中醫(yī)藥治療ARDS提供有力支持。本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探索中藥制劑金蕎麥水劑對(duì)ARDS大鼠肺組織炎癥介質(zhì)釋放和肺水腫情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠50只，雄性180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，溫度（22±4）℃、相對(duì)濕度40%～70%、自然光線、普通專用飼料喂養(yǎng)，24 h自由攝水、取食、適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，動(dòng)物倫理：S20210224-064。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 金蕎麥水劑由南通市中醫(yī)院藥劑科按照2005版《中國(guó)藥典》，應(yīng)用金蕎麥單品嚴(yán)格進(jìn)行制作，成品為紅棕色液體，具有清熱解毒、排膿祛瘀、止咳平喘的作用。生產(chǎn)批號(hào)20210113，規(guī)格500 mL/瓶，正常成人用量：40 mL/次。

1.3 試劑與儀器 脂多糖（LPS）購(gòu)自上海源葉公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）ELISA試劑盒均購(gòu)自Abcam公司；蘇木素、伊紅購(gòu)自索萊寶公司；手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械有限公司；AF-800電子精密天平購(gòu)自上海精密公司天平儀器廠；電熱恒溫箱購(gòu)自上海一恒公司；實(shí)驗(yàn)用微波爐格蘭仕公司（中國(guó)）；moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)（美國(guó)）。

1.4 模型制備 將50只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為空白組10只、模型組10只及金蕎麥高、中、低劑量組各10只。模型組、金蕎麥各組大鼠均氣管內(nèi)滴注3.00 mg/kg LPS 100 μL造模，翻轉(zhuǎn)大鼠使脂多糖溶液均勻分布于大鼠兩肺，留置6 h后大鼠出現(xiàn)呼吸急促，萎靡少動(dòng)、豎毛、腹瀉等造模成功[6]。

1.5 給藥方法 按照人與大鼠用藥換算公式（《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》）換算用藥劑量，金蕎麥高、中、低劑量組分別灌胃金蕎麥水劑12、6、3 mL/kg，空白組、模型組灌胃生理鹽水6mL/kg，每次給藥前重新測(cè)量大鼠體質(zhì)量，早、晚各給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 各組隨機(jī)選取8只大鼠，稱體質(zhì)量后，用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔麻醉。無(wú)睫毛反射后，將大鼠仰臥于操作臺(tái)，固定門齒及四肢，胸腹部消毒備皮，沿腹部正中線切開(kāi)約3 cm切口，找到腹主動(dòng)脈，接負(fù)壓采血器，收集所需血液后拔出采血針，延腹部正中線向胸部剪開(kāi)，取出肺組織進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。1）氧合指數(shù)測(cè)定。將采集的血液做血?dú)夥治?，?jì)算氧合指數(shù)。2）肺組織病理觀察。剪取右下肺組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫蠟、染色、脫水等制成石蠟切片，HE染色后鏡下觀察。3）肺組織濕干比評(píng)估肺水腫。將肺組織的重量標(biāo)記濕重（W），隨后將同標(biāo)本肺組織用錫紙包裹好放入恒溫烤箱中，設(shè)置90℃，烘烤24 h后取出，稱重記錄干重（D），計(jì)算肺組織濕干重比（W/D）[7]。4）ELISA 檢測(cè)法肺組織中炎性因子。按ELISA試劑盒要求經(jīng)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔、加樣、加酶、溫育、配液及洗滌、顯色、終止反應(yīng)、打開(kāi)酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)肺組織中IL-6、IL-10和TNF-α的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組內(nèi)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠氧合指數(shù)、WBC及NEU%比較 見(jiàn)表1。金蕎麥高、中、低劑量組與模型組比較氧合指數(shù)上升，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒百分率均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），金蕎麥高、中、低劑量組之間進(jìn)行比較，高劑量組療效更顯著，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠氧合指數(shù)、WBC、NEU%比較（±s）

表1 各組大鼠氧合指數(shù)、WBC、NEU%比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與高劑量組比較，#P＜0.05；與中劑量組比較，△P＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組別空白組模型組金蕎麥高劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥低劑量組n 8 8 8 8 8 PaO2/FiO2（mmHg）436.31±9.51 261.90±28.11 388.69±31.06*333.93±15.36*#297.02±16.49*#△WBC（×109/L）6.35±0.83 15.35±1.19 9.37±1.46*12.45±0.82*#13.75±1.18*#△NEU%52.51±1.75 91.53±1.83 73.57±2.41*82.01±4.55*#86.68±2.81*#△

2.2 各組大鼠肺組織炎性因子和肺濕/干重比的比較 見(jiàn)表2。金蕎麥高、中、低劑量組與模型組比較，TNF-α、IL-6、IL-10釋放明顯減少、肺組織濕/干重比低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；金蕎麥高、中、低劑量組之間比較，療效更顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織濕/干重比及炎性因子水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織濕/干重比及炎性因子水平比較（±s）

組別空白組模型組金蕎麥高劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥低劑量組n 8 8 8 8 8 W/D 4.33±0.27 7.09±0.34 4.68±0.31*5.88±0.31*#6.48±0.47*#△TNF-α（pg/mL）25.46±1.04 93.95±2.04 60.89±2.76*71.94±4.31*#83.06±4.38*#△IL-6（pg/mL）28.34±0.97 83.37±3.83 44.67±1.94*59.54±2.92*#70.24±2.47*#△IL-10（pg/mL）44.39±2.26 100.85±2.55 62.73±2.42*73.75±2.01*#85.88±4.31*#△

2.3 各組大鼠肺組織病理變化 見(jiàn)圖1?？瞻捉M：病理切片均肺泡完好，視野中未見(jiàn)肺泡塌陷，未見(jiàn)水腫、充血及炎性滲出液，未見(jiàn)明顯肺泡壁增厚。模型組：出現(xiàn)肺泡塌陷嚴(yán)重，充血嚴(yán)重的情況，可見(jiàn)炎性浸潤(rùn)，出現(xiàn)肺泡壁增厚。金蕎麥高劑量組：肺泡明顯充盈，塌陷明顯減輕，水腫減輕，炎性滲出少，充血情況減輕。金蕎麥中劑量組：肺組織少量充血水腫及炎癥滲出，細(xì)胞塌陷較高劑量組嚴(yán)重。金蕎麥低劑量組：可見(jiàn)明顯充血水腫但少于模型組。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色變化（100倍）

3 討 論

ARDS歸屬于中醫(yī)學(xué)“喘證”“暴喘”“肺衰”范疇。發(fā)病機(jī)制主要是人體感受邪毒，痰熱互結(jié)，因肺為華蓋，首先侵犯于肺，導(dǎo)致肺宣發(fā)肅降功能失常，致肺絡(luò)郁閉不通，咳喘時(shí)作，痰、飲、熱、瘀是加重ARDS的相關(guān)因素，加之正氣虛衰導(dǎo)致病情遷延難愈，發(fā)為本虛標(biāo)實(shí)之證[8-9]。本實(shí)驗(yàn)主要基于ARDS病初標(biāo)實(shí)，為外邪、痰濁、瘀毒之邪，壅滯于肺，使肺不主氣、肺失宣降的病理基礎(chǔ)，治療ARDS的方法主要為：清痰瀉熱、宣肺化飲、解瘀通經(jīng)等，提出金蕎麥水劑可以改善ARDS標(biāo)實(shí)階段肺組織炎性因子釋放、減輕肺組織水腫的假設(shè)，并運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)手段對(duì)假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探索金蕎麥治療ARDS的機(jī)制。

中藥制劑金蕎麥水劑是南通市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由成云龍先生研制至今已近50年，其主要性狀為紅棕色液體，具有清熱解毒、排膿祛瘀、止咳平喘的作用，金蕎麥水劑被廣泛應(yīng)用于臨床，尤其是熱毒襲肺和痰熱壅肺引起的呼吸系統(tǒng)疾病，療效得到廣大患者的認(rèn)可。金蕎麥中富含黃酮類、萜類、酶類及多種揮發(fā)性成分，其中黃酮類是其主要有效成分，在治療多種疾病時(shí)都具有積極的作用，其中清除自由基抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)氣管纖毛運(yùn)動(dòng)的作用被多方醫(yī)家所證實(shí)[10-11]，并且從金蕎麥水劑、酒劑中提取雙聚原矢車菊苷元制成金蕎麥片，廣泛應(yīng)用于臨床。

本實(shí)驗(yàn)建立在臨床觀察基礎(chǔ)上[12-15]，以高、中、低3種劑量金蕎麥水劑干預(yù)ARDS大鼠，通過(guò)與模型組比較闡述金蕎麥水劑對(duì)ARDS大鼠作用機(jī)制。與模型組比較，金蕎麥高、中、低劑量組血液中WBC降低、NEU%降低、氧合指數(shù)上升，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-10釋放減少，說(shuō)明金蕎麥可以減輕大鼠炎癥反應(yīng)，降低感染程度，提高氧合指數(shù)；與模型組比較，金蕎麥高、中、低劑量組大鼠肺組織充血、水腫不同程度減輕、細(xì)胞塌陷減輕、炎性滲出減少，說(shuō)明金蕎麥可以改善肺組織充血水腫，減輕炎性滲出；將金蕎麥高、中、低劑量組之間進(jìn)行比較，金蕎麥高劑量組治療效果最為顯著，說(shuō)明金蕎麥水劑治療效果與用藥劑量有關(guān)。綜上，金蕎麥水劑治療呼吸窘迫綜合征可能是通過(guò)減輕炎性因子釋放從而減輕肺充血水腫實(shí)現(xiàn)的。