張 玉, 汪宏濤, 劉嘉荔, 劉永勝, 唐曉鳳

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可能受到一定的生物脅迫與非生物脅迫。生物脅迫主要有植物病毒性感染、蟲害等;非生物脅迫主要包括鹽脅迫、干旱脅迫、熱脅迫、冷脅迫和一些重金屬離子脅迫等。植物響應(yīng)非生物脅迫發(fā)生一系列生理生化反應(yīng),以適應(yīng)不同的環(huán)境變化。自然界中較長(zhǎng)壽的樹木進(jìn)化出相應(yīng)的機(jī)制以應(yīng)對(duì)環(huán)境的變化,維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育[1-3]。Zn2+離子脅迫可能降低瓢兒菜根部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累[4];Mn2+脅迫降低垂穗披堿草幼苗葉片中葉綠素含量的積累,進(jìn)而對(duì)幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[5];Fe2+離子脅迫條件下,擬南芥菜和油菜會(huì)產(chǎn)生更多的丙二醛,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生毒害作用[6]。隨著科技和工業(yè)的發(fā)展,重金屬離子污染日益加重,對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響,進(jìn)而對(duì)食品安全產(chǎn)生威脅。因此,關(guān)于這些脅迫方面的研究對(duì)提高作物產(chǎn)量和食品安全與品質(zhì)意義重大。

DNA甲基化是一種常見的DNA復(fù)制后共價(jià)修飾作用,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要[7-8]。植物體內(nèi)DNA甲基化的水平主要與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有關(guān),根據(jù)結(jié)構(gòu)域的排列形式,其主要可分為4個(gè)家族,即甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase,MET1)、染色質(zhì)域甲基轉(zhuǎn)移酶(chromomethylase,CMT)、域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(domains rearranged methyltransferase,DRM)、5’端胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA 5’cytosine methyltransferase2,DNMT2)[9-10]。MET1和CMT最早從擬南芥中克隆,其在植物體器官和組織中均有表達(dá),具有特殊的結(jié)構(gòu)域,主要參與維持胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化作用[11];DRM可以分為DRM1和DRM2,主要識(shí)別半甲基化或未甲基化的DNA,在DNA甲基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12-13]。有研究報(bào)道,擬南芥中DNMT2可以與組蛋白去乙?；赴l(fā)生相互作用,并且在冷處理脅迫下,DNMT2的表達(dá)量有一定的增加,對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[13]。擬南芥中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的突變擾亂正常的DNA甲基化過(guò)程,不利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。植物體中DNMT2具有高度保守的結(jié)構(gòu)域,但卻沒(méi)有催化活性[13],因此,目前關(guān)于植物體內(nèi)DNA甲基過(guò)程中DNMT2的作用機(jī)制和功能性的研究較少。

番茄(Solanumlycopersicum)是一年或多年生短日照植物。其含有豐富的碳水化合物、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分,因此具有一定食用價(jià)值;此外,番茄中含有番茄紅素、類黃酮等物質(zhì),具有抗氧化作用,因此其還具有一定藥用價(jià)值[15-17]。目前番茄廣泛種植于中國(guó)南北方,在我國(guó)果蔬供應(yīng)方面影響深遠(yuǎn)[18]。

本文以模式植物番茄為實(shí)驗(yàn)材料,分析DNA甲基轉(zhuǎn)移酶SlDNMT2基因的表達(dá)模式;通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù),分析SlDNMT2蛋白的生物學(xué)進(jìn)化關(guān)系;利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),分析SlDNMT2蛋白的亞細(xì)胞定位情況;并成功構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染法轉(zhuǎn)化野生型番茄,得到番茄轉(zhuǎn)基因RNAi植株;進(jìn)一步探究不同非生物脅迫條件對(duì)轉(zhuǎn)基因RNAi植株和野生型植株的影響作用。本文為進(jìn)一步分析SlDNMT2基因在DNA甲基化過(guò)程中的功能作用奠定了基礎(chǔ),對(duì)研究植物體內(nèi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT2基因作用的分子機(jī)制具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

野生型(AC)番茄植物(SolanumlycopersicumMill. cv. Aillsa Craig)來(lái)自美國(guó)康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所，由本實(shí)驗(yàn)室繁殖保存;煙草(NicotianatabacumL.)來(lái)自美國(guó)康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所,由本實(shí)驗(yàn)室繁育保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α(EscheriachiacoliDH5α)、根癌農(nóng)桿菌GV2260(AgrobacteriumtumefaciensGV2260)、根癌農(nóng)桿菌EHAl05(AgrobacteriumtumefaciensEHAl05)、亞細(xì)胞定位表達(dá)載體pART-27GFP及植物表達(dá)載體pBI121均保存于本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

1.1.3 分子生物學(xué)試劑

RNA提取試劑 (Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(5X All-In-One RT Master Mix)、質(zhì)粒提取試劑盒(Easy Pure Plasmid Mini Prep Kit)),(TOYOBO公司);瓊脂糖膠回收試劑盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit,Omega公司)高保真DNA聚合酶Primer Star、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase (TaKaRa公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物和測(cè)序(上海生工技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1SlDNMT2目的基因的克隆

根據(jù)番茄SlDNMT2基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物。第1對(duì)特異性引物信息具體為:

DNMT2-F 5’CGGTTGTTTGCTTGCGTCT3’,

DNMT2-R 5’CTTGTGCAGATGGAGCTTCAG3’;

第2對(duì)特異性引物信息具體為:

DNMT2-F1 5’ATGGAATCGGAAGTTTCTAGA3’,

DNMT2-R1 5’TCATGAATGGTTGATGAAGAGATATT3’。

利用PCR技術(shù),獲得SlDNMT2基因編碼區(qū)序列。本文為了增加PCR產(chǎn)物的特異性,使用2對(duì)引物,通過(guò)巢式PCR進(jìn)行2輪擴(kuò)增,如圖1所示,黑色箭頭所指位置為起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA),第1對(duì)引物位于目的基因的非編碼區(qū),然后以第1輪產(chǎn)物為模板,使用第2對(duì)引物進(jìn)行巢式PCR第2輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94 ℃、2 min,94 ℃、20 s,58 ℃、20 s,72 ℃、2 min,72 ℃、5 min,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠回收試劑盒膠回收,并與克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,菌落PCR陽(yáng)性鑒定,送上海生工技術(shù)有限公司測(cè)序。

圖1 巢式PCR引物位置示意圖

1.2.2SlDNMT2的組織特異性表達(dá)分析

利用RNA提取試劑,分別從野生型番茄植株幼苗不同發(fā)育時(shí)期的根、莖、葉、花、果實(shí)中提取植物總RNA,樣品取樣質(zhì)量為100 mg,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得SlDNMT2的cDNA序列。以cDNA為模板,以番茄UBI3基因(GenBank登錄號(hào)為X58253)為內(nèi)參,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技術(shù)分析不同植物組織中SlDNMT2基因的表達(dá)情況。

1.2.3 SlDNMT2蛋白的亞細(xì)胞定位

經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、T4 DNA Ligase 連接、轉(zhuǎn)化及菌落PCR陽(yáng)性鑒定等生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,將目的基因SlDNMT2的CDS序列構(gòu)建至pART-27GFP表達(dá)載體,載體構(gòu)建過(guò)程中所用引物見表1所列。

表1 本研究中所用的引物

pART-27GFP為本實(shí)驗(yàn)保存的亞細(xì)胞定位載體,含有強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP),在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到強(qiáng)烈的綠色熒光。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),獲得目的基因SlDNMT2融合表達(dá)載體,命名為pART-27-35S::SlDNMT2-eGFP。

轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV2260,菌落PCR陽(yáng)性鑒定,獲得陽(yáng)性菌菌樣于28 ℃搖床培養(yǎng)18 h,轉(zhuǎn)接至新培養(yǎng)基培養(yǎng)6～8 h,加入誘導(dǎo)液1在28 ℃搖床中培養(yǎng)12 h,暗處理10 min,誘導(dǎo)液2處理,注射煙草葉片,放置36～48 h后,撕取煙草葉片表皮細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。誘導(dǎo)液1、誘導(dǎo)液2、AB鹽溶液、IM溶液配制方法如下。

誘導(dǎo)液1(20 mL):1 mL AB鹽溶液、19 mL IM溶液、ACE溶液(39 mg/mL、稀釋1 000倍)、Kana溶液(50 mg/mL、稀釋1 000倍);

誘導(dǎo)液2(20 mL):1 mL MES溶液(0.20 mol/L、稀釋20倍)、19 mL無(wú)菌水、ACE溶液(39 mg/mL、稀釋1 000倍);

AB鹽溶液(1 L):適量無(wú)菌水中加入20.00 gNaCl、3.00 g KCl、0.05 g FeSO4、0.60 g MgSO4· 7H2O;另取一容器,加入3.00 g CaCl2·2H2O,加入適量無(wú)菌水,將 CaCl2溶液緩慢倒入上一溶液中,定容至1 L,4 ℃保存;

IM溶液(1 L):適量無(wú)菌水中加入9.76 g MES、5.00 g葡萄糖、0.25 g NaH2PO4,玻璃棒攪拌溶解后,定容至1 L,滅菌,4 ℃保存。

1.2.4SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

本文選擇pBI121載體作為番茄植物表達(dá)載體,限制性內(nèi)切酶處理pSK-SlDNMT2 RNAi陽(yáng)性菌重組質(zhì)粒和pBI121空載質(zhì)粒,經(jīng)膠回收試劑盒回收SlDNMT2基因RNAi特異性片段,T4 DNA Ligase 4 ℃過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)陽(yáng)性菌鑒定、發(fā)夾結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn),送上海生工技術(shù)有限公司測(cè)序正確,最終獲得番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達(dá)載體。本文中構(gòu)建RNAi表達(dá)載體所需引物及其酶切位點(diǎn)見表1所列。

1.2.5 番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化

利用根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的浸染法,將上述構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至本實(shí)驗(yàn)室保存的野生型番茄植株。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù),預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng),最終獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株。根據(jù)pBI121載體中的卡那霉素抗性基因NPTⅡ(GenBank登錄號(hào)為AF485783)和菌落PCR技術(shù),進(jìn)行DNA水平陽(yáng)性篩選,DNA水平陽(yáng)性鑒定所用到的引物為:

NPTⅡ-F 5’AGACAATCGGCTGCTCTGAT3’，

NPTⅡ-R 5’TCATTTCGAACCCCAGAGTC3’。

此外,提取轉(zhuǎn)基因RNAi植株總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,Step One Real-time PCR儀定量分析,進(jìn)行RNA水平陽(yáng)性鑒定,結(jié)果如圖2所示,定量PCR相關(guān)引物見表1所列。圖2中,1～6表示通過(guò)菌數(shù)PCR鑒定得到的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性樣品。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株在DNA和RNA水平均為陽(yáng)性。

圖2 轉(zhuǎn)基因RNAi植株的陽(yáng)性鑒定結(jié)果

1.2.6 二價(jià)重金屬離子脅迫條件下的表型分析

為了探究轉(zhuǎn)基因RNAi番茄植株在重金屬離子脅迫條件下的生長(zhǎng)發(fā)育情況,本文將初始生長(zhǎng)狀態(tài)一致的野生型(AC)與轉(zhuǎn)基因RNAi植株,分別移植到1/2MS培養(yǎng)板、含300 μmol/L Fe2+的1/2 MS培養(yǎng)基、含300 μmol/L Zn2+的1/2 MS培養(yǎng)基、含300 μmol/L Mn2+的1/2 MS培養(yǎng)基中,垂直放置于培養(yǎng)架,置于22 ℃培養(yǎng)室生長(zhǎng)7 d,記錄不同處理?xiàng)l件下植株的表型。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlDNMT2基因的生物信息學(xué)分析

TAIR擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得擬南芥AtDNMT2基因序列,利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(National Center for Biotechnology Information,NCBI)Blast獲得番茄植株中同源基因SlDNMT2序列,進(jìn)而獲得不同物種中該基因編碼的氨基酸序列。利用DNAMAN軟件分析不同物種DNMT2蛋白保守域,如圖3所示。

此外,利用PFAM網(wǎng)站分析不同物種DNMT2基因氨基酸序列,并通過(guò)ClustalX和MEGA7.0軟件分析,繪制不同物種DNMT2蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖4所示。結(jié)果表明,番茄SlDNMT2與馬鈴薯StDNMT2的親緣關(guān)系較近,同源性高達(dá)95.54%;番茄SlDNMT2與擬南芥AtDNMT2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 不同物種DNMT2蛋白保守域

圖4 DNMT2進(jìn)化樹分析和結(jié)構(gòu)域分析

2.2 SlDNMT2基因cDNA序列克隆

以cDNA作為模板,DNMT2-F、DNMT2-R、DNMT2-F1、DNMT2-R1為引物,巢式PCR擴(kuò)增得到SlDNMT2基因產(chǎn)物,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖5所示。根據(jù)電泳條帶的大小,判斷SlDNMT2目的基因片段的正確性，并送公司測(cè)序,經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì),測(cè)序結(jié)果正確。

圖5 SlDNMT2目的基因片段

2.3 SlDNMT2蛋白的亞細(xì)胞定位分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法,將目的基因SlDNMT2轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV2260感受態(tài)細(xì)胞,獲得pART-27-35S::SlDNMT2-eGFP融合表達(dá)載體。注射煙草,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果如6所示。用DAPI染液對(duì)細(xì)胞核染色可確定細(xì)胞核位置,由MERGE混合圖像可確定SlDNMT2蛋白定位在細(xì)胞核中。

圖6 SlDNMT2蛋白亞細(xì)胞定位

2.4 SlDNMT2基因表達(dá)的組織特異性分析

Trizol試劑法提取番茄植株不同組織、不同發(fā)育時(shí)期的果皮中總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,RT-qPCR分析番茄SlDNMT2基因在番茄植株不同組織中表達(dá)量的差異,結(jié)果如圖7所示。

圖7中,IG1代表授粉后7 d果實(shí);IG2代表授粉后14 d果實(shí); MG代表授粉后35 d果實(shí);Br代表果實(shí)變色期;RR代表果實(shí)成熟期;Rt代表根;Stem代表莖;L代表葉片;F代表花。結(jié)果表明SlDNMT2基因在番茄植株不同發(fā)育時(shí)期的各組織中均有表達(dá),IG時(shí)期果實(shí)中SlDNMT2表達(dá)量較低,葉片(L)和花(F)中SlDNMT2表達(dá)量較高。

圖7 SlDNMT2基因的表達(dá)模式分析

2.5 轉(zhuǎn)基因植株在脅迫下的表型分析

在不同處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因RNAi和野生型植株的表型有一定差異,如圖8所示。

由圖8可知,在1/2 MS、300 μmol/L Mn2+、300 μmol/L Fe2+培養(yǎng)條件下,野生型和轉(zhuǎn)基因RNAi植物生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有顯著差異;但是,在300 μmol/L Zn2+培養(yǎng)條件下,野生型植株比RNAi植物的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)較好。

利用ImageJ軟件測(cè)量植株高度和SPSS18軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果如圖9、圖10所示。

圖8 重金屬離子脅迫下的表型分析

從圖9可以看出,300 μmol/L Zn2+條件下,野生型植株的高度比RNAi植物更長(zhǎng),且差異具有顯著性。但是,1/2 MS、300 μmol/L Mn2+、300 μmol/L Fe2+培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的植株高度并沒(méi)有顯著性差異。

圖9 植株的高度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖10 植株根總數(shù)量統(tǒng)計(jì)

由圖8e、圖8f、圖10可知,在1/2 MS培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)基因和野生型植株根生長(zhǎng)情況和根的總數(shù)量沒(méi)有顯著性差異;但是,300 μmol/L Fe2+處理時(shí),轉(zhuǎn)基因RNAi植物的根系比野生型更發(fā)達(dá),統(tǒng)計(jì)根數(shù)量,差異具有顯著性。以上結(jié)果表明當(dāng)外源添加300 μmol/L Zn2+離子時(shí),SlDNMT2可能參與正調(diào)控作用;當(dāng)外源添加300 μmol/L Fe2+時(shí),SlDNMT2可能參與負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑而發(fā)揮作用。

3 討 論

植物通過(guò)DNA甲基化修飾作用調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá),與植物生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、死亡密切相關(guān)。SlDNMT2是植物甲基化作用中的關(guān)鍵基因,本文通過(guò)基因差異表達(dá)分析實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SlDNMT2基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育的9個(gè)重要時(shí)期均有表達(dá)，并且在葉和花時(shí)期表達(dá)量較高,說(shuō)明SlDNMT2基因可能參與調(diào)節(jié)植物葉片和花器官的生長(zhǎng)發(fā)育。

不同的脅迫處理會(huì)影響植物DNA甲基化水平的變化,在植物中,重金屬離子脅迫使小麥、水稻葉片中DNA甲基化水平升高[19]。重金屬離子脅迫處理可能影響三葉草植物中DNA甲基化的水平[20]。以上研究結(jié)果表明,DNA甲基化作用可能參與植物應(yīng)對(duì)重金屬離子脅迫應(yīng)答途徑。

4 結(jié) 論

本文通過(guò)分子克隆獲得番茄植株SlDNMT2基因,該基因是合成DNA甲基化作用中關(guān)鍵酶的重要組成部分。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化成功獲得轉(zhuǎn)基因RNAi植株,并發(fā)現(xiàn)300 μmol/L Zn2+脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因RNAi植物影響作用比野生型更加顯著。結(jié)果表明,SlDNMT2基因可能參與番茄植株對(duì)非生物脅迫(重金屬離子脅迫)的響應(yīng)途徑。300 μmol/L Zn2+離子存在時(shí),SlDNMT2基因可能參與正調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑;而300 μmol/L Fe2+離子存在時(shí),SlDNMT2基因可能參與負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑,因此,轉(zhuǎn)基因植株對(duì)300 μmol/L Fe2+抗性更大。然而,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,SlDNMT2基因調(diào)節(jié)植物細(xì)胞進(jìn)行脅迫應(yīng)答反應(yīng)的機(jī)制及其在脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的調(diào)控機(jī)制等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。