王宇哲, 魏有海, 郭良芝, 程 亮, 郭青云

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室,青海西寧 810016)

植物是生物活性物質(zhì)的天然寶庫,能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,其中有毒植物含有的活性成分大多數(shù)具有除草、殺蟲和抑菌活性,從而具有成為植物源農(nóng)藥的潛力[1]。植物源農(nóng)藥具有與環(huán)境相容性好、易分解、低殘留、有害生物不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點,植物源農(nóng)藥的開發(fā)利用符合人們對有害生物可持續(xù)治理的要求[2]。此外,生物技術(shù)、高通量篩選和組合化學(xué)的快速發(fā)展及其在農(nóng)藥領(lǐng)域的滲透和應(yīng)用促進了植物源農(nóng)藥的開發(fā)和利用[3]。我國有毒植物分布廣泛,主要分布在西北和西南各省份[4],青海省分布的有毒植物主要有棘豆屬、黃華屬、毛茛屬、唐松草屬、狼毒屬以及大戟屬等植物[5]。有毒植物不僅抑制牧草正常生長,而且致使家畜中毒和草場退化。但有毒植物次生代謝產(chǎn)物除草潛力的開發(fā)也將是有毒植物合理利用的一項有效措施。采用有毒植物的提取物來抑制各種雜草種子萌發(fā)的研究已有一些文獻報道,李祥等發(fā)現(xiàn)黃花棘豆水浸提液對燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長有抑制作用,且對燕麥根尖的有絲分裂有抑制作用[6]。鄧建梅等通過室內(nèi)生物測定法和盆栽法發(fā)現(xiàn)12種有毒植物的水提液對野芥菜、燕麥、反枝莧和狗尾草的種子萌發(fā)和幼苗生長有較高的抑制作用[7]。劉利紅研究發(fā)現(xiàn),狼毒和小花棘豆根的莖葉水浸液對扁蓿豆、草木樨狀黃芪、沙蘆草、大針茅和克氏針茅5種受體植物的種子發(fā)芽與幼苗生長均具有抑制作用,且隨著水浸液濃度的增加,其抑制作用逐漸增強,此外,對莖葉的抑制作用強于對根的抑制作用[8]。有毒植物可通過釋放化學(xué)物質(zhì)對周圍的植物產(chǎn)生直接或間接的抑制或促進作用[9-10],該作用來源于植株根系分泌、凋落物的淋溶和腐解等[11-12]。在青海省退化的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中,針對有毒植物是否對農(nóng)田雜草的生長和發(fā)育具有化感作用的研究較為缺乏。因此,本試驗以青海省海北天然草地高原毛茛等8種有毒植物作為試驗材料,研究它們的乙醇提取物對野燕麥、旱雀麥和野芥菜種子萌發(fā)的影響,旨在篩選出抑制作用較強的有毒植物,為進一步利用天然草地有毒植物資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供體植物有高原毛茛(Ranunculustanguticus)、薊罌粟(Argemonemexicana)、披針葉黃華(Thermopsislanceolata)、黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)、斜莖黃芪(Astragaluslaxmannii)、葵花大薊(Cirsiumsouliei)、黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)和瓣蕊唐松草(Thalictrumpetaloideum),均采自青海省海北州天然草地。受體植物有野燕麥(Avenafatua)、旱雀麥(Bromustectorum)和野芥菜(Raphanusraphanistrum),種子分別采自于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗田和青海祁連農(nóng)田,采集時間為2020年8月。

1.2 試驗方法

1.2.1 供體植物醇提物制備 將8種有毒植物新鮮健康植株用清水洗凈,晾干后切碎,置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,80 ℃烘干水分至恒重,然后用粉碎機粉碎成粉末過篩,按照樣品與乙醇的質(zhì)量體積比1 g ∶20 mL稱取樣品并置于錐形瓶中,瓶口用塑料膜封后振蕩提取,20 ℃條件下振蕩浸提48 h(轉(zhuǎn)速150 r/min)后經(jīng)消毒濾紙過濾,去除殘渣,濾液減壓濃縮至無醇,得乙醇提取物浸膏,于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 配制不同濃度的浸提液 分別稱取乙醇提取物浸膏0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g放置于5個錐形瓶中,加入50 mL蒸餾水充分溶解后得到濃度為1、2、4、8、16 mg/mL的浸提液,備用。

1.2.3 供體植物醇提物對受體植物的生物活性測定 在培養(yǎng)皿(直徑9 cm)底部鋪1層滅過菌的濾紙,培養(yǎng)皿內(nèi)放入健康飽滿的經(jīng)消毒處理的受體植物種子20粒/個,分別用移液管移取質(zhì)量濃度分別為1、2、4、8、16 mg/mL的供體植物醇提液 1 mL 至培養(yǎng)皿中,蓋上皿蓋,每個處理設(shè)3次重復(fù),對照為蒸餾水處理,置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),溫度為 25 ℃,光/暗周期為14 h/8 h,培養(yǎng)期內(nèi)每隔2 d添加適量清水保濕,以免干燥影響發(fā)芽。每天記錄種子萌發(fā)數(shù),連續(xù)記錄7 d,7 d后記錄芽長和根長。計算發(fā)芽指數(shù)和芽(根)長抑制率來評價醇提物的生物活性,具體公式如下。

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt);

式中:Gt為第t天的發(fā)芽數(shù);Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時間,d。

1.2.4 供體植物各萃取組分的制備 將得到的乙醇提取物浸膏溶解并懸浮于1 L蒸餾水中,并將懸浮液依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,合并萃取液,減壓濃縮至溶液呈黏稠狀,最終分別得到石油醚萃取組分、乙酸乙酯萃取組分、正丁醇萃取組分和乙醇提取物。將不同有機溶劑萃取組分按照“1.2.2”節(jié)中的方法配制成16 mg/mL的浸提液進行生物活性測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準差”表示,用Excel軟件和SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析;采用方差分析和Duncan’s新復(fù)極差法對不同處理的數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體植物乙醇提取物對雜草種子萌發(fā)的影響

2.1.1 8種有毒植物乙醇提取物對野燕麥種子萌發(fā)芽(根)長的影響 由圖1、圖2可知,高原毛茛、薊罌粟和瓣蕊唐松草乙醇提取物對野燕麥種子芽長和根長抑制率隨著濃度升高呈現(xiàn)升高的趨勢,但在低濃度時為負值,即低促高抑的雙重效應(yīng);其中1 mg/mL醇提物對野燕麥種子根長的促進效果最顯著,達到144.29%。不同濃度葵花大薊乙醇提取物對野燕麥種子萌發(fā)的抑制作用不同,都對種子萌發(fā)整體呈抑制作用,且隨著濃度增高抑制作用增強;披針葉黃華乙醇提取物可以促進野燕麥種子的萌發(fā),且效果顯著,其中1 mg/mL披針葉黃華醇提物對芽長的促進效果最顯著,達到130.93%;黃花棘豆乙醇提取物對野燕麥芽(根)長的抑制率整體上隨著黃花棘豆乙醇提取物濃度的增高而升高;斜莖黃芪乙醇提取物對野燕麥種子芽長的影響表現(xiàn)為低濃度促進高濃度抑制,對野燕麥根長表現(xiàn)為抑制作用;芽(根)長抑制率整體上隨著黃帚橐吾乙醇提取物濃度的增高而升高。

2.1.2 8種有毒植物乙醇提取物對旱雀麥種子萌發(fā)芽(根)長的影響 如圖3、圖4所示,8種有毒植物中的乙醇提取物對旱雀麥種子的芽(根)長抑制率均隨著濃度的升高而升高,均在16 mg/mL時達到最大值。瓣蕊唐松草乙醇提取物對旱雀麥的芽長表現(xiàn)為低促高抑的雙重效應(yīng),16 mg/mL醇提物對旱雀麥種子芽長抑制效果達100.00%;黃帚橐吾乙醇提取物在1 mg/mL時對旱雀麥的芽長有略微的促進作用。

2.1.3 8種有毒植物乙醇提取物對野芥菜種子萌發(fā)芽(根)長的影響 如圖5、圖6所示,高原毛茛、葵花大薊、斜莖黃芪和黃帚橐吾這4種有毒植物的乙醇提取物對野芥菜的芽(根)長抑制率均隨著濃度的上升而增加;薊罌粟和瓣蕊唐松草的乙醇提取物對野芥菜的芽(根)長表現(xiàn)為低促高抑的雙重效應(yīng);披針葉黃華對野芥菜根長的抑制率隨著濃度的增加而上升,但對野芥菜芽長僅在16 mg/mL時有抑制作用;黃花棘豆乙醇提取物對野芥菜的芽長有低促高抑的雙重效應(yīng),但對根長的抑制率卻隨著濃度的增加而上升。16 mg/mL薊罌粟乙醇提取物對3種雜草種子芽長、根長的抑制效果均為100.00%。

2.2 不同供體植物乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分的確定

2.2.1 高原毛茛乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表1可知,高原毛茛的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用不同,在16 mg/mL各萃取組分處理條件下,野燕麥種子的芽長和根長與對照組相比,均差異顯著(P<0.05);除高原毛茛乙醇提取物石油醚萃取物組分處理外,其他處理下旱雀麥和野芥菜種子的芽長和根長與對照相比,均差異顯著(P<0.05);高原毛茛的乙醇提物石油醚組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用強弱順序表現(xiàn)為野燕麥>野芥菜>旱雀麥。從各萃取組分來看,高原毛茛乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分、高原毛茛乙醇總提取物和高原毛茛乙醇提取物正丁醇萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用最好,對芽長和根長的抑制率均達100.00%。

2.2.2 薊罌粟乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表2可知,薊罌粟的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用表現(xiàn)與高原毛茛一致,對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用強弱表現(xiàn)為野燕麥>野芥菜>旱雀麥。同樣,薊罌粟乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分、薊罌粟乙醇總提取物和薊罌粟乙醇提取物正丁醇萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用最好,對芽長和根長抑制率均達100.00%。

2.2.3 葵花大薊乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表3可知,葵花大薊的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用,在16 mg/mL各萃取組分處理條件下,葵花大薊乙醇提取物正丁醇萃取組分對3種雜草種子的抑制作用明顯高于其他有機溶劑萃取組分,顯著抑制了3種種子的芽長和根長(P<0.05),對旱雀麥種子萌發(fā)的抑制作用最好,對芽長和根長的抑制率均達100.00%。

2.2.4 披針葉黃華乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表4可知,披針葉黃華的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用,在16 mg/mL各萃取組分處理條件下,抑制作用表現(xiàn)為披針葉黃華乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分>披針葉黃華乙醇提取物正丁醇萃取組分>披針葉黃華乙醇提取物石油醚萃取組分>披針葉黃華乙醇總提取物。其中,披針葉黃華乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分對野燕麥和野芥菜種子芽長和根長的抑制率均為100.00%,對旱雀麥種子芽長和根長的抑制率分別為93.84%和96.90%。

2.2.5 黃花棘豆乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表5可知,黃花棘豆的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用,在16 mg/mL黃花棘豆乙醇提取物石油醚萃取組分處理條件下,野燕麥種子芽長和根長均低于對照,且差異顯著(P<0.05),而旱雀麥和野芥菜的根長與對照相比,差異不顯著(P>0.05),黃花棘豆乙醇提取物正丁醇萃取組分處理條件下,可以促進旱雀麥種子的萌發(fā),而乙酸乙酯萃取組分和乙醇總提取物對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用相對較低,其中對野薺菜的芽長具有促進作用。

2.2.6 斜莖黃芪乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表6可知,斜莖黃芪的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用不同,在16 mg/mL各萃取組分處理條件下,斜莖黃芪乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分可以抑制3種雜草種子的萌發(fā),與對照相比差異顯著(P<0.05),其他3個有機溶劑萃取組分均促進了3種雜草種子的萌發(fā),其中斜莖黃芪乙醇總提取物對旱雀麥種子萌發(fā)的促進作用最強,芽長和根長均顯著高于對照(P<0.05),野燕麥和野芥菜芽長也顯著高于對照(P<0.05),兩者根長也高于對照,但差異不顯著(P>0.05)。

2.2.7 黃帚橐吾乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表7可知,黃帚橐吾的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用不同,在16 mg/mL各萃取組分處理條件下,野燕麥種子的芽長和根長均顯著低于對照(P<0.05),其中乙酸乙酯萃取組分的抑制作用最強,對野燕麥芽長和根長的抑制率分別為75.00%和85.64%。黃帚橐吾乙醇提取物正丁醇萃取組分顯著促進了野芥菜種子的萌發(fā)(P<0.05),對旱雀麥種子萌發(fā)也有促進作用,芽長和根長均高于對照,但差異不顯著(P>0.05)。

2.2.8 瓣蕊唐松草乙醇提取物不同有機溶劑萃取組分對雜草種子萌發(fā)的影響 由表8可知,瓣蕊唐松草的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用,在16 mg/mL瓣蕊唐松草乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分處理條件下,野燕麥種子芽長和根長均顯著低于對照(P<0.05),旱雀麥和野芥菜的根長與對照相比差異不顯著(P>0.05),瓣蕊唐松草乙醇總提取物處理條件下,旱雀麥種子芽長和根長與對照相比差異顯著(P<0.05),野燕麥和野芥菜種子芽長和根長也低于對照,差異不顯著(P>0.05)。綜上,瓣蕊唐松草的乙醇提取物各萃取組分對3種雜草種子萌發(fā)的抑制作用強弱順序為野燕麥>旱雀麥>野芥菜。

3 結(jié)論與討論

天然草地有毒植物的危害主要是通過影響草地牧草的種子萌發(fā)和幼苗生長,最終導(dǎo)致牧草種群被抑制[13-15],研究和掌握有毒植物的這種化學(xué)作用規(guī)律,并合理開發(fā)利用有毒植物,實現(xiàn)農(nóng)田雜草有效控制,減少農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)對化學(xué)藥劑的依賴具有重要的意義。已有研究表明,有毒植物對受體植物的抑制作用強度與浸提液濃度、活性物質(zhì)種類以及受體植物種類密切相關(guān)[16]。本試驗研究了8種有毒植物不同濃度的乙醇提取物對野燕麥、旱雀麥以及野芥菜種子萌發(fā)的影響,結(jié)果表明8種有毒植物乙醇提取物對3種雜草種子的萌發(fā)及根芽生長具有明顯的抑制或促進作用?？ù笏E和黃帚橐吾乙醇提取物對3種雜草種子的萌發(fā)表現(xiàn)為抑制作用,且隨著醇提物的濃度升高其抑制作用不斷加強,這與胡遠彬等研究的勁直黃芪水浸提液對種子發(fā)芽和幼苗生長影響的結(jié)果[17]一致。本試驗還發(fā)現(xiàn),低濃度的高原毛茛和披針葉黃華以及薊罌粟乙醇提取物對野燕麥種子芽和根的生長具有促進作用,高濃度下具有較強的抑制作用,這種低濃度促進高濃度抑制的雙重效應(yīng),與高玉蓮等研究的瑞香狼毒對高粱、燕麥的結(jié)果[18]相一致。另外,同為禾本科的野燕麥和旱雀麥,其受影響程度表現(xiàn)出顯著差異,旱雀麥對高原毛茛、披針葉黃華和斜莖黃芪以及薊罌粟醇提物最為敏感,野燕麥則敏感性較差,這與包賽很那等研究的“野生植物種子對苗期勁直黃芪根浸提液抑制作用”結(jié)果[19]一致,這說明有毒植物醇提物中發(fā)揮抑制作用的活性物質(zhì)具有選擇性和依賴性,這可能與物種進化歷史[20]有關(guān)。

本試驗比較了8種有毒植物的乙醇提取物中不同有機溶劑萃取組分的生物活性,結(jié)果表明,瓣蕊唐松草、斜莖黃芪、披針葉黃華、薊罌粟和高原毛茛醇提物的乙酸乙酯萃取相優(yōu)于其他萃取相,這與楊甲月等研究的“瑞香狼毒根中醇提物不同有機溶劑萃取物對擬南芥幼苗生長抑制作用”結(jié)果[21]一致,說明乙酸乙酯萃取物是有毒植物活性物質(zhì)的主要有效組分。本試驗還發(fā)現(xiàn),石油醚萃取物是黃花棘豆和黃帚橐吾活性物質(zhì)的主要有效組分,而正丁醇萃取物是葵花大薊的主要有效組分。披針葉黃華、高原毛茛和薊罌粟的主要有效組分是正丁醇和乙酸乙酯萃取物,這可能與植物性有效活性成分較為復(fù)雜有關(guān),植物很多代謝產(chǎn)物均具有生物活性,在含量和活性高低上有所差異,多種活性成分可能存在協(xié)同作用[22],這與丁建海等研究的“車前子提取物不同溶劑萃取物”結(jié)果[23]相似。綜上,這8種有毒植物都具有開發(fā)為除草劑或植物生長調(diào)節(jié)劑的潛力。但對這些有毒植物活性物質(zhì)的釋放途徑、作用機制、活性成分還有待進一步深入研究。

綜上所述,8種有毒植物醇提物對3種雜草種子萌發(fā)具有不同程度的影響,其中高原毛茛、薊罌粟、披針葉黃華醇提物對野燕麥種子萌發(fā)呈現(xiàn)低促高抑的趨勢,而瓣蕊唐松草醇提物對野燕麥和野芥菜種子萌發(fā)亦呈現(xiàn)為低促高抑的趨勢。不同有毒植物的有效組分有差異,高原毛茛、薊罌粟、披針葉黃華、斜莖黃芪和瓣蕊唐松草的有效組分位于乙酸乙酯萃取物中,黃花棘豆和黃帚橐吾的有效組分位于石油醚萃取物中,而葵花大薊的有效組分則位于正丁醇萃取物中。