于 鵬，地力木熱提·艾買提，丁志翔，段紹斌

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院·新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院普外一科，烏魯木齊 830011)

結(jié)直腸癌是世界上第三大常見(jiàn)癌癥，其年度病死率在世界排名第3位[1]。盡管近年來(lái)通過(guò)外科手術(shù)、化療、放療等手段已大大改善了結(jié)直腸癌的治療效果，但患者的5年生存率依然很低[2]。因此，探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制可以為臨床干預(yù)提供有效的指導(dǎo)，從而改善患者的長(zhǎng)期預(yù)后。苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(budding uninhibited by benzimidazoles 1，BUB1)是紡錘體關(guān)卡的組成部分，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和非整倍體細(xì)胞的產(chǎn)生，最終傳代促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[3]。已有研究報(bào)道，BUB1基因在原發(fā)性肝癌患者中高表達(dá)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[4]。而Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，PLK1)/10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)信號(hào)通路中的PLK1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而干擾PTEN蛋白的核轉(zhuǎn)位，抑制免疫細(xì)胞功能，最終促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[5]，但BUB1及PLK1/PTEN信號(hào)通路在結(jié)直腸癌中的具體作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究首先檢測(cè)了BUB1在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，然后利用RNA干擾(siRNA)技術(shù)抑制BUB1的表達(dá)并觀察細(xì)胞的增殖與凋亡情況，并探究其內(nèi)部的分子機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 結(jié)直腸癌組織標(biāo)本及細(xì)胞系

收集2018年8月至2020年8月在本院確診的結(jié)直腸癌患者癌組織及鄰近癌旁組織共125對(duì)。所有提供標(biāo)本的患者均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前未接受過(guò)放化療。所有患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有組織標(biāo)本均保存在液氮中。人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480、HCT116、HT-29與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

針對(duì)BUB1 mRNA相應(yīng)的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的2對(duì)siRNA BUB1序列(si-BUB1-1、si-BUB1-2)及其陰性對(duì)照(si-NC)均由廣州基迪奧生物科技有限公司合成；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；BUB1、Bax、Bcl-2、PLK1、PTEN、GAPDH兔抗多克隆抗體(anti-BUB1、anti-Bax、anti-Bcl-2、anti-PLK1、anti-PTEN、anti-GAPDH)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Sigma公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480、HCT116、HT-29與人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞NCM460均置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480細(xì)胞，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，并分組為：空白組(細(xì)胞未轉(zhuǎn)染)、si-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC)、si-BUB1-1組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-BUB1-1)、si-BUB1-2組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-BUB1-2)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中BUB1、PLK1、PTEN、Bax、Bcl-2表達(dá)

收集各組細(xì)胞，分別在各組細(xì)胞中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液，于冰上裂解30 min。30 min后，將裂解的細(xì)胞在4 ℃下以12 000×g離心10 min，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)提取的蛋白上清液進(jìn)行定量。將等量的蛋白質(zhì)(50 μg)加入到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h后，將膜與一抗anti-BUB1(1∶2 000)、anti-PLK1(1∶1 000)、anti-PTEN(1∶3 000)、anti-Bax(1∶1 000)、anti-Bcl-2(1∶2 000)、anti-GAPDH(1∶2 000)于4 ℃下孵育過(guò)夜。將膜在室溫下用TBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗于室溫條件下孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑可視化蛋白。對(duì)蛋白條帶進(jìn)行掃描，以GAPDH為內(nèi)參，對(duì)蛋白質(zhì)的灰度值進(jìn)行量化分析。每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將空白組、si-NC組、si-BUB1-1組、si-BUB1-2組SW480細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，分別在0、24、48和72 h時(shí)加入10 μL CCK-8試劑。37 ℃孵育2 h后，測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

分別收集轉(zhuǎn)染48 h的空白組、si-NC組、si-BUB1-1組、si-BUB1-2組SW480細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入200 μL結(jié)合緩沖液輕輕重懸細(xì)胞，然后分別向每管中加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)各10 μL，輕輕混勻，冰浴避光放置2 h，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，最后使用FlowJo V10軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BUB1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

BUB1在結(jié)直腸癌組織(0.69±0.07)中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(0.15±0.02),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=82.930,P<0.001)，見(jiàn)圖1。與NCM460細(xì)胞(0.13±0.01)比較，SW1116(0.42±0.04)、SW480(0.76±0.06)、HCT116(0.62±0.05)、HT-29(0.67±0.04)細(xì)胞中BUB1表達(dá)水平都顯著升高(F=201.223,P<0.05)，且BUB1表達(dá)水平在SW480細(xì)胞中最高，因此，選擇SW480細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，見(jiàn)圖2。

A：癌旁組織；B：結(jié)直腸癌組織。

2.2 抑制BUB1表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞中BUB1表達(dá)的影響

si-BUB1-1組(0.14±0.02)、si-BUB1-2組(0.12±0.02)SW480細(xì)胞中BUB1表達(dá)水平顯著低于空白組(0.75±0.07)和si-NC組(0.74±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=325.570,P<0.05)，空白組和si-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中BUB1表達(dá)

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中BUB1表達(dá)

2.3 抑制BUB1表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

與空白組和si-NC組比較，si-BUB1-1組、si-BUB1-2組SW480細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24、48、72 h的增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與si-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 抑制BUB1表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響

與空白組和si-NC組比較，si-BUB1-1組、si-BUB1-2組SW480細(xì)胞凋亡率、Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，空白組與si-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4、5，表2。

表1 各組SW480細(xì)胞在轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時(shí)的增殖情況比較(A值，

2.5 抑制BUB1表達(dá)對(duì)PLK1/PTEN信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

與空白組和si-NC組比較，si-BUB1-1組、si-BUB1-2組細(xì)胞中PLK1表達(dá)水平顯著降低，PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，空白組與si-NC組比較，2種蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6、表3。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

圖5 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表2 各組細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)比較

圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PLK1、PTEN蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞中PLK1、PTEN蛋白表達(dá)比較

3 討 論

結(jié)直腸癌的發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)基因的調(diào)控，對(duì)涉及這些關(guān)鍵基因調(diào)控機(jī)制的研究可能為精確治療結(jié)直腸癌患者提供良好的策略[6]。BUB1是1種紡錘體檢測(cè)點(diǎn)蛋白，在有絲分裂過(guò)程中對(duì)維持染色體正確分離、減少異倍體產(chǎn)生發(fā)揮著重要作用[7]。已有研究表明BUB1在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，并通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及腫瘤干細(xì)胞活性等參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[8-9]；余旭等[10]報(bào)道BUB1在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌的不良預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)；庾麒等[11]發(fā)現(xiàn)BUB1的高表達(dá)與原發(fā)性肝癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、T分期有關(guān)；潘峰[12]的研究表明BUB1高表達(dá)可提示非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后不良，有望成為肺癌早期診斷及不良預(yù)后的有效檢測(cè)標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)；白曉斌等[13]研究表明BUB1表達(dá)水平上調(diào)能夠促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。在本研究中，通過(guò)檢測(cè)BUB1在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW1116、SW480、HCT116、HT-29中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BUB1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)，且在SW480細(xì)胞中的表達(dá)最高，因此后續(xù)選用SW480細(xì)胞為研究對(duì)象。

腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖與腫瘤細(xì)胞的凋亡被抑制有關(guān)[14]。有研究利用siRNA技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞中BUB1的表達(dá)后能夠降低肝癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯[15]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)siRNA技術(shù)下調(diào)BUB1的表達(dá)后，SW480細(xì)胞增殖能力降低、細(xì)胞凋亡率升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。提示BUB1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著促癌作用，抑制BUB1表達(dá)可部分改變結(jié)直腸癌的惡性表型，但其中的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，PLK1/PTEN信號(hào)通路在腫瘤的研究中備受關(guān)注。據(jù)報(bào)道，PLK1是細(xì)胞周期和致癌作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可作為診斷性生物標(biāo)志物和抗癌靶標(biāo)[16]；下調(diào)PLK1的表達(dá)水平可使膀胱癌細(xì)胞的凋亡明顯增加，遷移能力顯著降低，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)減低[17]；PLK1抑制劑BI-2536可抑制人肝癌細(xì)胞的增殖及遷移能力，PLK1可作為肝癌治療中的新靶點(diǎn)[18]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PTEN蛋白在惡性腫瘤中具有抑癌功能[19]；PTEN蛋白在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，且與腫瘤分化程度呈顯著相關(guān)[20]；過(guò)表達(dá)PTEN蛋白可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)蛋白CDK1、侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)凋亡蛋白Bax的表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示，抑制BUB1表達(dá)后，PLK1/PTEN信號(hào)通路中PLK1表達(dá)水平下調(diào)，PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)。提示抑制BUB1表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控PLK1/PTEN信號(hào)通路中PLK1、PTEN蛋白的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BUB1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制BUB1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該機(jī)制可能與PLK1/PTEN信號(hào)通路中PLK1表達(dá)下調(diào)，PTEN蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。該研究?jī)H在體外細(xì)胞水平上證明了BUB1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及PLK1/PTEN信號(hào)通路的影響，后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步深入研究。