駱玉琴， 許佳彬， 李艷杰， 徐明飛， 徐玲英， 于國光， 李輝， 李慧杰， 張志恒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021)

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)日新月異的發(fā)展及人民生活水平的逐步提升，人們對果蔬類綠色健康食品的需求日漸增大，這促使了果蔬類產(chǎn)業(yè)的集約化發(fā)展[1]。農(nóng)產(chǎn)品的規(guī)模化生產(chǎn)種植也造成一系列弊端問題，如土壤環(huán)境微生態(tài)失衡[2]、農(nóng)藥使用所導(dǎo)致的環(huán)境污染及入口食品安全問題[3-6]、連作障礙現(xiàn)象加劇[7]等，其中連作障礙因其普遍性及持久性等特點(diǎn)極大地影響了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量及品質(zhì)[8-10]，同時也是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟需解決的關(guān)鍵問題之一。

連作障礙是指由同種或近緣作物連作造成的土壤理化性質(zhì)惡化、作物病蟲草害加劇、發(fā)育異常、生長態(tài)勢變?nèi)?、產(chǎn)量降低和產(chǎn)品品質(zhì)變劣等現(xiàn)象[11]。研究表明，發(fā)生連作障礙的原因眾多，大概可分為非生物因素和生物因素兩種。非生物因素主要指土壤自身理化性質(zhì)，包括土壤中營養(yǎng)元素、微量元素等的缺乏會導(dǎo)致種植作物的連作障礙。滕凱等[12]發(fā)現(xiàn)，有連作障礙特點(diǎn)的煙草種植區(qū)，土壤理化性質(zhì)存在明顯差異，推測土壤理化性質(zhì)的差異是導(dǎo)致連作障礙存在差異的主要因素之一。生物因素主要指土壤中的微生物和植物化感物質(zhì)。一方面，土壤中的微生物具有促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)分解與能量轉(zhuǎn)化和利用等作用[13]，為農(nóng)作物的生長及發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面，有毒的真菌菌落也可通過土壤進(jìn)入作物體內(nèi)從而影響農(nóng)作物正常的生長，甚至導(dǎo)致農(nóng)作物的感染死亡[14-15]。

王芳等[16]通過試驗探究連作土壤種植對茄子生長的影響，結(jié)果表明，茄子自身的化感物質(zhì)及病蟲害是導(dǎo)致茄子最終發(fā)生連作障礙的重要因素。Liu等[17]研究證實了大豆連作導(dǎo)致種植土壤退化以及大豆產(chǎn)量驟降，同時也發(fā)現(xiàn)土壤中pH和碳氮比是導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的主要因素，這說明了種植作物通過改變種植土壤的理化性質(zhì)間接改變土壤微生物的結(jié)構(gòu)?？蒲腥藛T對連續(xù)種植苦參的土壤樣本進(jìn)行冗余分析，結(jié)果表明，有機(jī)質(zhì)、速效磷及全氮等對土壤根系微生物的影響較大，這同樣也證實了種植作物生長與土壤理化指標(biāo)有密切關(guān)聯(lián)[18]。Li等[19]通過高通量測序手段發(fā)現(xiàn)在僅有花生栽培的體系中青霉菌與鐮刀菌具有顯著的抑制作用，這說明潛在非植物致病菌與植物致病菌之間有一定的作用關(guān)系。Wang等[20]結(jié)合高通量測序與定量PCR兩種手段對烤煙連作種植后土壤中真菌群落進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)烤煙連作后明顯改變了土壤中真菌的豐度及多樣性，同時也增加了再次種植作物感染病原菌的幾率。最新研究成果表明，相對于細(xì)菌群落，病原菌Fusariumoxysporumf. sp. capsici對真菌群落的影響更為突出[21]。

紹興市是浙江省東北部地區(qū)茄果類蔬菜種植產(chǎn)量大市之一，紹興地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品種植多采用大棚種植方式[22]。近年來，由于種植模式及種植作物單一化，土地種植作物連作障礙現(xiàn)象頻發(fā)，給種植戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[23]。但就目前來說，對該地區(qū)連作土壤的研究及治理罕見報道。本文采用4種不同方式處理該地區(qū)連作土壤，采用ITS測序手段探究不同處理后土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性和特征變化，尤其是有害病原菌的數(shù)量及種類，為進(jìn)一步防御茄果類蔬菜連作障礙提供重要理論指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤采集于浙江省紹興市上虞區(qū)茄果類蔬菜多年種植地塊，該地塊青枯病、黃萎病等病害高發(fā)。在種植區(qū)隨機(jī)選取10個點(diǎn)采集土壤，采樣深度為0～20 cm，剔除石塊和植物根系后，過2 mm篩后混勻備用。

供試有機(jī)物料為大豆秸稈，風(fēng)干后粉碎，碳氮比(C/N)為20.4。供試殺菌劑為氰氨化鈣、棉隆、二氧化氯。

1.2 處理設(shè)計

試驗共設(shè)計厭氧還原法、覆膜增溫法、熏蒸劑處理法和消毒劑處理法4種處理方式，10個處理組，每個處理組均進(jìn)行3次重復(fù)，試驗開始前，測定供試土壤的持水量(表1)。

表1 試驗處理的設(shè)計

1.3 測定項目

土壤中真菌的測定中，為最大程度地減少實驗方法所帶來的實驗結(jié)果誤差，所有待測樣品的預(yù)處理方式、樣品的基因組DNA提取及ITS擴(kuò)增子測序皆采用統(tǒng)一的實驗方法。經(jīng)預(yù)處理過的樣品送至浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司，采用PowerSoil?DNA Isolation Kit(MO BIO，Cat.No.12888)方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，DNA提取后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的純度和濃度。取適量的所得產(chǎn)物DNA為模板，基于測序區(qū)域的選擇，PCR反應(yīng)體系中主要包括特異引物(帶Barcode)、高效高保真酶以及High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(Phusion?，New England Biolabs)等以保證擴(kuò)增效率以及后續(xù)準(zhǔn)確提取DNA、PCR、產(chǎn)物純化、建庫以及使用Illumina測序儀完成土壤樣品的測序試驗工作。真菌ITS擴(kuò)增引物為：ITS1-5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′；ITS2-5′GCT GCGTTCTTCATCGATGC3′。所有PCR反應(yīng)均采用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)進(jìn)行，將同樣體積的1×負(fù)載緩沖液(含SYBR染料)與PCR產(chǎn)物混合，在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。選擇400～450 bp明亮條帶的樣品進(jìn)行后續(xù)實驗。PCR產(chǎn)物按等比混合后，用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen，Germany)純化混合PCR產(chǎn)物。根據(jù)制造商的說明書，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina，USA)生成測序文庫，并添加索引代碼。文庫質(zhì)量在Qubit@2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)and Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)上進(jìn)行評估。最后，在IlluminaMiSeq平臺上對文庫進(jìn)行測序，生成300 bp的對端reads。試驗的所有樣本均在同一Illumina MiSeq測序儀完成測序工作。

1.4 數(shù)據(jù)處理

為了方便探究而設(shè)定的分類操作單元OTU是使用軟件uparse對所有土壤樣本中真菌的有效tags進(jìn)行聚類討論，對OTU進(jìn)行分類學(xué)注釋使用的數(shù)據(jù)庫為Unite數(shù)據(jù)庫，通過物種注釋即可了解不同水平上(界、門、綱、目、科、屬等)的序列數(shù)目。通過軟件Qiime進(jìn)行物種多樣性指數(shù)及豐富度指數(shù)的計算，統(tǒng)計分析采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理，利用Origin 2016完成對病原菌的組成分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對土壤真菌群落多樣性的影響

測序完成后所得到的原始讀數(shù)經(jīng)過拼接、修剪、過濾等優(yōu)化手段處理后共得到498 510條高質(zhì)量序列。為研究土壤樣本中的物種組成多樣性，使用uparse軟件對所有土壤樣本進(jìn)行聚類討論，以97%一致性水平的基礎(chǔ)將序列聚類成為OTUs，共檢測出3 257個OTUs，所有處理樣本中T5和T8中OTU數(shù)量分別為最高和最低，分別為365和152個(表2)。各處理樣本中真菌的測序深度指數(shù)0.997 7～0.999 9，說明了測序數(shù)據(jù)較高程度地覆蓋了樣本中所有的真菌類群，能夠真實代表樣本中的真菌特征。樣本T8中的測序深度指數(shù)最高(0.999 9)，高于樣本T6。Shannon指數(shù)2.76～5.06，Simpson指數(shù)0.615～0.932，Ace指數(shù)154～413，Chao1指數(shù)154～419，多樣性指數(shù)所得結(jié)果表明在4個處理組中覆膜增溫處理后對土壤樣本中真菌的群落多樣性影響最為顯著，說明了覆膜增溫至60 ℃(比較35 ℃)會顯著增加土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性，這可能與溫度影響相關(guān)酶活性有關(guān)[24]，厭氧還原處理組中T1降低真菌的多樣性指數(shù)，T2和T3增加了真菌的多樣性指數(shù)，其中T3中多樣性指數(shù)增加幅度較小。分析熏蒸劑處理組中多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T7和T8處理組多樣性指數(shù)均高于T6對照組，這間接說明了氰氨化鈣和棉隆這兩種熏蒸劑在10 d的作用時間內(nèi)反而增加了土壤中真菌的多樣性指數(shù)，這與預(yù)期結(jié)果不符，可能是作用時間和劑量的問題[25]。采用消毒劑處理后發(fā)現(xiàn)二氧化氯會降低真菌群落的多樣性。同時也表明Shannon和Simpson指數(shù)的指向性一致。而豐富度指數(shù)表明4個處理組中熏蒸劑處理后對土壤中真菌的豐富度均降低，相對于氰氨化鈣比較而言，棉隆熏蒸后顯著降低真菌的豐富度。與對照組比較，厭氧還原處理組中均降低了土壤中真菌的豐富度指數(shù)，但并不顯著。而二氧化氯消毒劑處理后會增加土壤中真菌的豐富度指數(shù)。

表2 不同處理方式的土壤真菌群落多樣性指數(shù)

2.2 不同處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤樣本中共檢測到真菌界15個門40個綱85個目197個科378個屬580個種的微生物。從門水平上分析，各不同處理后的土壤樣本Top 10相對豐度所占比例為94.66%～99.72%，能夠較為詳盡地涵蓋整個真菌群落門水平上的信息，其他種類的門相對豐度數(shù)據(jù)合并成others，占比為0.28%～5.34%。Top 10分別為子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、捕蟲霉門(Zoopagomycota)、毛霉門(Mucoromycota)、蟲霉門(Entomophthoromycota)、油壺菌門(Olpidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)和芽枝霉門(Blastocladiomycota)。

由圖1可以看出，Ascomycota是所有樣本中相對豐度最高的菌門，所占比例為40.28%～95.04%，其中在T4(對照)組中Ascomycota的相對豐度最高為95.04%，T8組中Ascomycota的相對豐度最低為40.28%。分析不同處理后對菌門Ascomycota相對豐度的影響發(fā)現(xiàn)，厭氧還原處理組中隨著厭氧程度加深，Ascomycota的相對豐度顯著下降。覆膜處理組中在60 ℃培養(yǎng)條件下連續(xù)作用10 d后發(fā)現(xiàn)Ascomycota的相對豐度顯著下降。熏蒸劑處理組中，氰氨化鈣和棉隆對Ascomycota的生長均有一定的抑制作用，其中棉隆顯著抑制其生長。消毒劑處理組中二氧化氯連續(xù)作用24 h使得Ascomycota的相對豐度顯著升高。對比覆膜處理組和熏蒸劑處理組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)(兩組的作用時間相同，均為240 h)，相對于溫度(60 ℃)而言，菌門Ascomycota對熏蒸劑棉隆表現(xiàn)更為敏感。綜合4組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，棉隆處理組對Ascomycota的抑制性作用最為顯著。對于菌門Chytridiomycota，厭氧還原組和熏蒸劑處理后其相對豐度顯著增加，覆膜法和消毒劑處理中Chytridiomycota的相對豐度顯著降低，其中消毒劑組抑制作用更為顯著。對于菌門Mortierellomycota，厭氧還原組及氰氨化鈣處理后其相對豐度均有所降低，覆膜法、棉隆及消毒劑處理均顯著增加Mortierellomycota的相對豐度，其中覆膜法影響最為顯著。對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，只有在T4樣本中沒有檢測到Entomophthoromycota，而覆膜增溫處理后其相對豐度卻顯著增加。在樣本T1、T4和T8均沒有檢測到菌門Blastocladiomycota，對于T8而言，氰氨化鈣和棉隆作用后分別增加和降低了菌門Blastocladiomycota的相對豐度，其中棉隆熏蒸導(dǎo)致Blastocladiomycota難以生存。

圖1 門水平上不同處理后土壤中真菌的組成

進(jìn)一步從屬水平上分析不同處理對土壤真菌群落的影響(圖2)，除了未定義的菌屬之外(Others)，共檢測到378個真菌屬。各不同處理后的土壤樣本Top 10的相對豐度所占比例為46.25%～86.91%，基本能夠涵蓋整個真菌群落屬水平上的概況，其他種類屬的相對豐度數(shù)據(jù)合并成others，占比為13.09%～53.75%，Top 10菌屬分別為毛殼菌屬(Chaetomium)、瓶毛殼屬(Lophotrichus)、被孢霉屬(Mortierella)、Gymnostellatospora、毛殼屬(Chaetomidium)、根生壺菌屬(Rhizophydium)、緣刺盤菌(Cheilymenia)、瑞恩氏酵母屬(Ruinenia)、Retroconis和Gorgonomyces。

圖2 屬水平上不同處理后土壤中真菌的組成

由圖2可以看出，樣本T4中Chaetomium屬的相對豐度最高，而覆膜處理后發(fā)現(xiàn)顯著降低了Chaetomium屬在樣本中的相對豐度，這側(cè)面說明了Chaetomium屬對溫度具有較高的敏感度，同時發(fā)現(xiàn)厭氧還原和熏蒸劑處理后均對Chaetomium屬的生長有一定的抑制作用，但抑制程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于覆膜處理組。對于Lophotrichus屬，在厭氧還原處理后發(fā)現(xiàn)，樣本T1中其相對豐度顯著降低，而在T2和T3中Lophotrichus屬的相對豐度略有上升。覆膜處理后Lophotrichus屬的相對豐度顯著性下降，氰氨化鈣和棉隆兩種熏蒸劑處理后發(fā)現(xiàn)作用結(jié)果不相同，氰氨化鈣和棉隆分別升高和降低了Lophotrichu屬的相對豐度。對于Mortierella屬，厭氧還原作用后顯著降低了Mortierella屬的相對豐度，覆膜處理后Mortierella屬的相對豐度顯著升高，而不同熏蒸劑處理后對Mortierella屬的影響不盡相同，氰氨化鈣和棉隆分別降低和升高了Mortierella屬的相對豐度，這與Lophotrichus屬對兩種熏蒸劑出現(xiàn)的結(jié)果正好相反。對于Gymnostellatospora屬，厭氧還原作用和熏蒸劑處理后對其影響并不明顯，而覆膜后顯著降低了Gymnostellatospora屬的相對豐度。厭氧還原處理后Chaetomidium屬仍具有良好的適應(yīng)性，并且Chaetomidium屬的相對豐度顯著性增加，其中T1樣本中增幅最高，而覆膜后顯著降低了Chaetomidium屬的相對豐度，Chaetomidium屬遇到氰氨化鈣和棉隆熏蒸后的結(jié)果與Lophotrichus屬表現(xiàn)一致。而在二氧化氯作用后Chaetomium屬、Lophotrichus屬、Mortierella屬、Gymnostellatospora屬和Chaetomidium屬的相對豐度有不同程度的增加，其中Chaetomium屬和Mortierella屬的相對豐度顯著增加。在樣本CK、T6和T8中均未曾檢測到Rhizophydium屬。

2.3 不同處理方式對致病菌的影響

根據(jù)測序數(shù)據(jù)可知，在土壤樣本中檢測出的378個真菌屬中，鐮刀菌屬(Fusarium)、交鏈孢屬(Alternaria)、輪枝孢屬(Verticillium)和葡萄孢菌屬(Botrytis)是主要的植物致病菌。

不同處理對上述4個植物病原菌屬組成的影響如圖3所示，4種病原菌屬相對豐度占總菌屬比例的0.41%～3.54%，其中Fusarium為Top 1病原菌，鐮刀菌屬相對豐度占總菌屬比例為0.41%～3.50%，而CK和T1為厭氧還原處理中的一組，這直接說明了厭氧還原處理后對Fusarium的顯著抑制效果，對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T2和T3的抑制效果依次遞減，T1、T2和T3對Fusarium的抑制率分別為88.47%、70.88%和42.8%。同樣對Fusarium具有抑制效果的處理有T8，抑制率為67.92%。覆膜增溫后發(fā)現(xiàn)Fusarium的相對豐度增加至對照組的4倍多，而氰氨化鈣和二氧化氯處理后，T7和T10組中鐮刀菌屬的相對豐度略有增加。綜合數(shù)據(jù)可知，T1處理對鐮刀菌屬的抑制作用最為顯著。對Alternaria屬具有抑制作用的分別為T1和T3，抑制率分別為86.36%和81.82%，其余處理組表現(xiàn)為促進(jìn)Alternaria屬對環(huán)境的適應(yīng)性，其中T10的促進(jìn)效果最高。對于Verticillium屬，除了二氧化氯增加了該菌屬的環(huán)境適應(yīng)能力，其余處理組均對Verticillium屬具有明顯的抑制結(jié)果，尤其值得注意的是T2、T3和T8對其抑制率達(dá)到了100%。同樣，厭氧還原處理對病原菌屬Botrytis的作用為抑制，且抑制效果同樣達(dá)到了100%，在對照組T4、T6和T9中均未檢測出Botrytis屬，而T5和T8處理后該菌屬的相對豐度分別為0.027%和0.013%，T7和T10處理后Botrytis屬的相對豐度無改變。

圖3 不同處理后4種病原菌屬的組成變化

3 討論

真菌是農(nóng)作物土壤介質(zhì)中不可或缺的成員之一，對其多樣性及群落組成的研究具有積極的應(yīng)用需求。本文以浙江北部茄果類連作障礙土壤為研究對象，探究厭氧還原、覆膜增溫、熏蒸劑和消毒劑等不同的處理方式對連作土壤中真菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響。對比其他處理結(jié)果，覆膜增溫處理顯著增加了真菌群落的多樣性，而連續(xù)作用相同時間后棉隆熏蒸處理顯著降低了真菌群落的豐富度指數(shù)。在門水平上，Ascomycota、Chytridiomycota、Mortierellomycota、Basidiomycota和Zoopagomycota為土壤樣本中的優(yōu)勢菌門，相對豐度合計占93.17%～99.55%。對比數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，溫度由35 ℃增加至60 ℃，Ascomycota門的環(huán)境適應(yīng)能力大大降低，而經(jīng)二氧化氯處理后Ascomycota門的相對豐度顯著增加。從屬水平分析，共檢測出378個屬，覆膜增溫處理后，Ascomycota門中Chaetomium屬的相對豐度顯著降低，這進(jìn)一步說明了Ascomycota門相對豐度的下降主要是其中Chaetomium屬的下降。對Fusarium、Alternaria、Verticillium和Botrytis等連作障礙主要致病菌屬分析表明，其中Fusarium為Top 1病原菌，而厭氧還原組對Fusarium具有最強(qiáng)的抑制效果，抑制率為88.47%。不同類型的土壤連作障礙及其相關(guān)處理技術(shù)與土壤真菌群落的定量關(guān)系有待后續(xù)進(jìn)一步研究。