王 瀟, 劉福利,2*, 梁洲瑞, 袁艷敏, 張朋艷, 汪文俊,2, 孫修濤,2

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所, 山東 青島 266071；2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 山東 青島 266071)

引 言

掌狀海帶(Laminariadigitata)屬于褐藻門(Phaeophyta)、褐藻綱(Phaeophyceae)、海帶目(Laminariales)、海帶科(Laminariaceae)、海帶屬(Laminaria)，分布于北大西洋沿岸，主要包括冰島沿岸、格陵蘭島南部、愛爾蘭西北部、法國西北部、英國南海岸、挪威北海岸[1-4]。掌狀海帶是一種大型海藻，可生長在2～6 m深的水下巖礁上[5]，具有重要的經(jīng)濟和生態(tài)價值。它是生產(chǎn)褐藻膠、海藻鹽、碘的原材料，也可用于新興領(lǐng)域如營養(yǎng)保健品、藥物及第三代生物燃料等[6-8]；掌狀海帶可形成海藻林，具有提高近海生物多樣性、調(diào)節(jié)近岸海域生態(tài)環(huán)境的作用[9]。我國不是海帶屬種類的原產(chǎn)地[10]，缺乏海帶屬大型海藻種質(zhì)資源，而掌狀海帶的引進是對我國大型海藻種質(zhì)資源的有力補充。當前掌狀海帶生長發(fā)育繁殖的研究已有一些報道，但大都是對野生群體的調(diào)查研究。人工養(yǎng)殖的海藻，其生長發(fā)育和繁殖特性相對野生群體有所不同，以規(guī)?；B(yǎng)殖的海帶(Saccharina japonica)為例，野生海帶生活史跨越三個年份，而人工養(yǎng)殖的只需兩個年份?？梢灶A見人工養(yǎng)殖掌狀海帶的生長發(fā)育和生殖特點也將不同于原產(chǎn)地野生群體的特點。因此，有必要對人工養(yǎng)殖群體掌狀海帶的繁育特點及其環(huán)境條件進行系統(tǒng)研究，以期為掌狀海帶人工育苗技術(shù)的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

海帶屬種類的生活史包括微觀配子體和宏觀孢子體兩個世代[11]。對海帶屬種類的有性生殖過程，包括游孢子放散和附著，雌/雄配子體的形成、生長和發(fā)育，雌/雄配子體排卵/精以及幼苗產(chǎn)生的過程。有性生殖過程是一個極其復雜的生物學過程，受多種環(huán)境因子的調(diào)控和影響，其中光和溫度被認為是影響有性生殖過程較為重要的環(huán)境因子[12]。探明影響掌狀海帶有性生殖過程的關(guān)鍵環(huán)境因子，是建立海帶屬種類人工苗種繁育技術(shù)的基本前提。而目前對掌狀海帶的研究主要集中在生物活性物質(zhì)提取、生態(tài)資源調(diào)查、遺傳多樣性研究[13]以及單一環(huán)境因子對掌狀海帶生長發(fā)育影響的研究[14]，缺乏對掌狀海帶有性生殖過程中關(guān)鍵節(jié)點的適宜環(huán)境條件的系統(tǒng)性研究。

本研究以人工養(yǎng)殖的成熟掌狀海帶為材料，在不同光照強度、溫度、氮磷營養(yǎng)鹽濃度條件下，觀察掌狀海帶游孢子萌發(fā)、配子體形成及生長、配子囊形成及配子排放以及孢子體形成的過程和規(guī)律，探究掌狀海帶有性生殖過程的適宜環(huán)境條件，旨在為掌狀海帶人工育苗提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

孢子囊組織來源于同一株成熟的掌狀海帶，盡可能保證游孢子的成熟度和發(fā)育狀態(tài)一致。剪取掌狀海帶的成熟孢子囊組織塊，用滅菌海水擦洗干凈，在10～15 ℃環(huán)境下陰干刺激1 h，放入10 ℃左右的滅菌海水中進行游孢子放散，1 h左右后取一滴游孢子水，顯微鏡觀察，每個視野(100×)內(nèi)有10個左右的游孢子即可停止放散。將含有游孢子的海水用300目篩絹過濾，將濾液倒入鋪滿玻片的培養(yǎng)板上進行附著。第2天將附有游孢子的玻片分別放在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中進行不同環(huán)境條件下的培養(yǎng)，每7d換水一次。

1.2 試驗方法

以滅菌的天然海水為培養(yǎng)液，設(shè)置不同的溫度、光強和營養(yǎng)鹽濃度實驗組：

1.3 掌狀海帶有性生殖過程的觀察與測定

在顯微鏡下觀察掌狀海帶有性生殖過程，每3 d拍照一次，實驗周期為24 d。

胚孢子直徑、配子體寬度和長度的測量： 每個培養(yǎng)皿中隨機觀察10個視野(100×)，用DLC Performance 軟件進行拍照，用Image-Pro Plus 5.1軟件進行測量。

配子體形成率、排卵率和幼孢子體形成率的統(tǒng)計：每個培養(yǎng)皿隨機觀察10個視野(100×)，統(tǒng)計形成初期的配子體、排卵的雌配子體和幼孢子體的數(shù)量，按配子體形成數(shù)占總細胞數(shù)的百分比計算配子體形成率；按排卵的雌配子體占總細胞數(shù)的百分比計算排卵率；按長成幼孢子體的數(shù)量占總細胞數(shù)的百分比計算幼孢子體形成率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 19.0對配子體形成率、排卵率和幼孢子體形成率進行單因素方差分析、Duncan 多重比較(P<0.05為差異顯著)。

2 結(jié)果

2.1 掌狀海帶配子體的生長發(fā)育

掌狀海帶游孢子放散附著后形成胚孢子(圖1a)，其細胞直徑約為5.43 μm，然后胚孢子細胞表面產(chǎn)生突起開始萌發(fā)，突起延長形成萌發(fā)管，細胞的內(nèi)含物全部流到萌發(fā)管的頂端，出現(xiàn)細胞壁，萌發(fā)管頂端與空的萌發(fā)管分離，形成配子體(圖1b)，從游孢子附著后到配子體形成，需46 d。雌配子體(圖1c)、雄配子體(圖1d)開始由一個細胞不斷進行細胞分裂(圖1e)。培養(yǎng)至16 d左右(105 ℃)，雄配子體細胞分裂形成78個細胞的細胞段，細胞寬度約為9.13 μm，細胞長度約為19.87 μm，而雌配子體細胞分裂形成47個細胞的細胞段，細胞寬度約為14.81 μm，細胞長度約為22.61 μm，雄配子體細胞大小顯著小于雌配子體。雌配子體細胞表面出現(xiàn)突起形成卵囊(圖1f)，第20天雌配子體開始排卵(圖1g)，與雄配子體放散的精子結(jié)合，合子生長發(fā)育為幼孢子體(圖1h)。20 ℃時有性生殖過程停滯在配子體形成階段，無配子體成熟及幼孢子體產(chǎn)生現(xiàn)象。

圖1 掌狀海帶的早期發(fā)育過程

2.2 不同環(huán)境條件下掌狀海帶的配子體形成率

由圖2和圖3可知，隨著溫度的增加或隨著氮、磷濃度的增加，掌狀海帶的配子體形成率均呈先升高后下降的趨勢。15 ℃組的配子體形成率顯著高于其它溫度組(P<0.05)，20 ℃組的配子體形成率最低。N4營養(yǎng)鹽組的配子體形成率顯著高于其它營養(yǎng)鹽組(P<0.05)，氮磷濃度過高或過低均會降低配子體的形成率。由圖4可知，10 ℃和15 ℃的不同光強組的配子體形成率均隨著光強的增加呈先升高后下降的趨勢。光強為20 μmol photons/(m2·s)、溫度為15 ℃的處理組的配子體形成率(90.2%)顯著高于其它處理組(P<0.05)。

圖2 不同溫度條件下培養(yǎng)6 d后掌狀海帶的配子體形成率

圖3 不同營養(yǎng)鹽(氮、磷)濃度條件下培養(yǎng)6 d后掌狀海帶的配子體形成率(N∶P=10∶1)

圖4 不同溫度、光照強度條件下培養(yǎng)6 d后掌狀海帶的配子體形成率

2.3 不同環(huán)境條件下掌狀海帶的雌配子體排卵率

由圖5可知，10 ℃組的掌狀海帶配子體排卵率顯著高于其它溫度組(P<0.05)，20 ℃時無排卵現(xiàn)象。由圖6可知，掌狀海帶的配子體排卵率隨氮、磷濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，N4營養(yǎng)鹽組的配子體排卵率顯著高于其它營養(yǎng)鹽組(P<0.05)，N0營養(yǎng)鹽組的排卵率最低。由圖7可知，10 ℃和15 ℃的不同光強組的配子體排卵率均隨著光強的增加呈先升高后下降的趨勢。15 ℃組的排卵率稍低于10 ℃組。溫度為10 ℃、光照為40 μmol photons/(m2·s) 時配子體排卵率最高。

圖5 不同溫度條件下培養(yǎng)20 d后掌狀海帶的雌配子體排卵率

圖6 不同營養(yǎng)鹽(氮、磷)濃度條件下培養(yǎng)20 d后掌狀海帶的排卵率(N∶P=10∶1)

圖7 不同溫度、光照強度條件下培養(yǎng)20 d后掌狀海帶的排卵率

2.4 不同環(huán)境條件下掌狀海帶的幼孢子體形成率

由圖8可知，溫度為10 ℃和15 ℃下，掌狀海帶的幼孢子體形成率較高且沒有顯著差異(P>0.05)，20 ℃下沒有幼孢子體的形成，這與在20 ℃下沒有排卵的結(jié)果相互印證。由圖9可知，幼孢子體形成率隨著氮、磷濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，N4營養(yǎng)鹽組的幼孢子體形成率顯著高于其它營養(yǎng)鹽組(P<0.05)，N0營養(yǎng)鹽組的幼孢子體形成率最低。由圖10可知，除了60 μmol photons/(m2·s)光強組外，其它光強組在15 ℃下的幼孢子體形成率均顯著低于10 ℃下(P<0.05)。溫度為10 ℃、光強為40 μmol photons/(m2·s) 處理組的幼孢子體形成率顯著高于其它處理組(P<0.05)。

圖8 在不同溫度條件下的掌狀海帶幼孢子體形成率

圖9 不同營養(yǎng)鹽濃度條件下的掌狀海帶幼孢子體形成率(N∶P=10∶1)

圖10 不同溫度、光照強度條件下的掌狀海帶幼孢子體形成率

3 討論

本研究表明，掌狀海帶胚孢子發(fā)育形成配子體的過程受到多種環(huán)境因子的影響。掌狀海帶在15 ℃下的配子體形成率最大，可高達90%以上，而低溫(10 ℃)和高溫(20 ℃)會顯著降低配子體形成率。Barsch等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)高溫會使掌狀海帶游孢子萌發(fā)形成配子體的幾率明顯降低，20 ℃是致死上限；Cosson[16]研究認為低溫會使配子體形成受阻，5 ℃下形成的配子體比10～18 ℃下形成的配子體小，與本研究結(jié)果相一致。Müller等[17]研究發(fā)現(xiàn)溫度達到18 ℃時，糖海帶和掌狀海帶的胚孢子萌發(fā)率為0，而本研究表明當培養(yǎng)溫度達到20 ℃時，掌狀海帶配子體形成率即使顯著降低，但仍有20%左右的形成率，這表明本研究的掌狀海帶對高溫的耐受性可能高于Müller等研究的掌狀海帶，本研究的掌狀海帶來源于法國，是掌狀海帶自然分布的南端，有可能適應較高的溫度。本研究發(fā)現(xiàn)15 ℃時低光強更適宜于配子體形成初期的生長，梁洲瑞等[18]研究發(fā)現(xiàn)配子體初期葉綠素含量較低，葉綠素含量與光照需求成正比，高光會對胚孢子或配子體初期造成傷害。鞠青等[19]發(fā)現(xiàn)氮磷營養(yǎng)鹽的缺乏會使海帶胚孢子的萌發(fā)和配子體的形成滯后，氮濃度為4 mg/L、磷濃度為0.4 mg/L時，配子體的形成率相對較高，而氮濃度為8 mg/L、磷濃度為0.8 mg/L時，配子體的形成率顯著低于氮濃度為4 mg/L、磷濃度為0.4 mg/L的條件，Berges等[20]發(fā)現(xiàn)氮磷濃度偏高會導致藻類出現(xiàn)磷抑制現(xiàn)象，這些研究結(jié)果與本研究相一致。

Martins等[11]研究認為海帶雌配子體細胞段至少有一個細胞進入了發(fā)育階段，開始形成卵囊，則認為雌配子體處于卵期，3 d左右進行卵子釋放即排卵。溫度決定著海帶配子體是營養(yǎng)生長還是開始發(fā)育，本研究發(fā)現(xiàn)10 ℃有利于掌狀海帶配子體的發(fā)育，排卵率相對較高，顯著高于15 ℃，而20 ℃條件下配子體沒有出現(xiàn)發(fā)育和排卵現(xiàn)象，這與Dieck等[21]的研究結(jié)果相似，即掌狀海帶配子體在5～12 ℃時的具有較高發(fā)育率，而17 ℃的發(fā)育率略有降低。在適宜溫度10 ℃條件下，40 μmol Photons/(m2·s)的光強時掌狀海帶配子體的排卵率顯著高于其他光強組。而Hsiao等[22]研究發(fā)現(xiàn)糖海帶配子發(fā)育的最佳條件是17 μmol Photons/(m2·s)。掌狀海帶相對糖海帶更喜強光，類似光照需求的種間差異也有相關(guān)報道[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)掌狀海帶配子體需要充足的氮磷營養(yǎng)鹽，氮濃度為4 mg/L、磷濃度為0.4 mg/L最為適宜，天然海水中不額外添加氮磷營養(yǎng)，會嚴重抑制配子體排卵率，而過高的氮磷濃度(氮濃度為8 mg/L、磷濃度為0.8 mg/L)也不利于掌狀海帶雌配子體的排卵。

正常的幼孢子體附著在各自的雌性卵囊上，具有正常形態(tài)，即規(guī)則的細胞分裂、具有明顯分化為基底的根狀莖和近端的細長葉片[11]。Bolton[26]在實驗中發(fā)現(xiàn)掌狀海帶幼孢子體在10～15 ℃具有較高的形成率和生長速率，這與本實驗研究結(jié)果一致，即10 ℃和15 ℃條件下海帶幼孢子體形成率相對較高且沒有顯著性差異，而20 ℃時沒有幼孢子體的形成，凌晶宇等[14]研究發(fā)現(xiàn)溫度過高會抑制配子體正常發(fā)育，沒有排卵發(fā)生。在適宜溫度10 ℃、光照強度40 μmol Photons/(m2·s)條件下掌狀海帶幼孢子形成率相對較高，而在溫度15 ℃條件下，40～60 μmol Photons/(m2·s)的光照強度有利于掌狀海帶幼孢子體的形成，說明適宜的光照強度也會隨著溫度的變化有所變化。

Müller等[17]表明，掌狀海帶游孢子萌發(fā)為配子體的最佳溫度不同于排卵和幼孢子體形成的最佳溫度，后者的最佳溫度一般較低。本研究表明掌狀海帶配子體形成的最佳溫度(15 ℃)不同于排卵和幼孢子形成的最佳溫度(10 ℃)，游孢子萌發(fā)和配子體營養(yǎng)生長需要較高溫度，而配子體發(fā)育(配子形成、受精作用)則稍低溫度更有利。此外，從游孢子到幼苗產(chǎn)生的這個階段對光照的需求也有不同，從胚孢子萌發(fā)形成配子體，到配子體生長、發(fā)育形成幼孢子體，對光照的需求呈現(xiàn)增高趨勢，這可能與該生長發(fā)育階段葉綠素含量不斷增加有關(guān)。而氮磷營養(yǎng)鹽需求無顯著變化，氮濃度為4 mg/L、磷濃度為0.4 mg/L適宜于掌狀海帶從游孢子到幼苗產(chǎn)生整個階段，相關(guān)研究表明該氮磷營養(yǎng)鹽濃度也適宜于其它海帶種類[27-28]。