姚元謙，劉英，楊玉雯，呂建林，黃晶晶

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 廣西 南寧 530023)

0 引言

肝癌的類型主要為肝細(xì)胞性肝癌(75%～85%)，其晚期患者比例大、肝病背景復(fù)雜、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)是影響肝癌患者治療及預(yù)后的重要因素[1]。目前對于肝癌的治療仍是臨床難題，盡管近年來開發(fā)了多種肝癌的新療法，尤其是靶向治療，雖然增加了肝癌患者的總生存期，但仍達(dá)不到臨床所期望的療效[2]。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡形式，主要由鐵介導(dǎo)的氧化損傷、過度脂質(zhì)氧化和細(xì)胞膜損傷驅(qū)動(dòng)[3]。越來越多證據(jù)表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡在各種癌癥治療中具有重要作用，尤其是針對傳統(tǒng)治療效果欠佳的惡性腫瘤患者[4-5]。中醫(yī)藥醫(yī)治腫瘤有著悠久的歷史，療效確切，中西醫(yī)聯(lián)合治療能夠減少西藥毒副作用，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，延緩病情進(jìn)展，在腫瘤防治上具有不可忽視的重要作用[6-7]。目前對于中藥調(diào)節(jié)鐵死亡的研究處于起步階段，部分研究表明有多味中藥及中藥復(fù)方能夠調(diào)節(jié)鐵死亡，發(fā)揮抗腫瘤活性[8]。

本文中運(yùn)用生物信息學(xué)、系統(tǒng)藥理學(xué)，以鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)為切入點(diǎn)，整合靶點(diǎn)-化合物-中藥的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析可作用于肝癌鐵死亡靶點(diǎn)的化合物、中藥及用藥規(guī)律，以期為后續(xù)調(diào)控鐵死亡的中藥研究及藥物開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 靶點(diǎn)收集及靶點(diǎn)機(jī)制分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)下載肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)，從FerrDb數(shù)據(jù)庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)下載鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)，運(yùn)用R軟件提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)量，使用R包“l(fā)imma”對肝癌組及癌旁組樣本進(jìn)行差異分析，以|logFC|>1、FDR<0.05為過濾條件，篩選出肝癌中具有顯著性差異的鐵死亡靶點(diǎn)。使用R包“clusterProfiler”對差異靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)和京都基因組基因百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG)富集分析。

1.2 候選化合物篩選及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)匹配各靶點(diǎn)全稱，將靶點(diǎn)全稱依次提交至TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，收集所有可匹配到的化合物，并記錄各化合物的分子信息和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以ADME參數(shù)和Lipinski規(guī)則為過濾條件篩選出候選化合物[9]，具體條件為：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，半衰期(half-life，HL)>4，拓?fù)錁O性表面積(topological polar surface area，TPSA)<140，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(number of rotatable bonds，RBN)≤10，分子量(molecular weight，MW)≤500 Da。運(yùn)用Cytoscape3.9.0軟件構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)，對網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治?，初步預(yù)測中藥調(diào)節(jié)鐵死亡治療肝癌的關(guān)鍵化合物。

1.3 中藥獲取及用藥規(guī)律分析

通過TCMSP收集與潛在化合物相關(guān)聯(lián)的中藥，將收集的中藥與《中華人民共和國藥典》《中國臨床藥物大辭典》進(jìn)行信息匹對，未收錄的中藥則剔除。將中藥數(shù)據(jù)導(dǎo)入中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)V3.0軟件，選擇數(shù)據(jù)分析模塊下的統(tǒng)計(jì)分析及方劑分析功能，進(jìn)行中藥的四氣、五味、歸經(jīng)、功效、頻次分析。使用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 候選化合物-靶點(diǎn)分子對接

為了進(jìn)一步驗(yàn)證化合物與潛在靶點(diǎn)之間的結(jié)合可信度，選取1.2節(jié)的潛在靶點(diǎn)-候選化合物網(wǎng)絡(luò)中，度值前4位的化合物作為小分子配體，以各潛在靶點(diǎn)作為蛋白受體進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載化合物的MOL2結(jié)構(gòu)文件，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載蛋白受體的pdb結(jié)構(gòu)文件，使用PyMOL軟件刪除蛋白受體的水分子及配體，運(yùn)用AutoDockTools1.5.6軟件將MOL2文件及pdb文件轉(zhuǎn)換為pdbqt文件，并確定蛋白受體的活性口袋，最后通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 肝癌中鐵死亡差異表達(dá)靶點(diǎn)

從TCGA獲取424個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中肝細(xì)胞癌組織374例、正常癌旁組織50例，從FerrDb收集382個(gè)鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)取交集后，最終納入246個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)。對肝癌組及正常組進(jìn)行差異表達(dá)分析，有84個(gè)靶點(diǎn)在肝癌中具有表達(dá)差異，其中在肝癌組上調(diào)基因71個(gè)、下調(diào)基因13個(gè)。246個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)差異表達(dá)火山圖如圖1所示。

圖1 246個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)差異表達(dá)火山圖Fig.1 Volcano plot of differential expression of 246 ferroptosis targets

2.2 鐵死亡差異表達(dá)靶點(diǎn)機(jī)制

應(yīng)用R軟件對差異靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,84個(gè)鐵死亡差異靶點(diǎn)富集分析如圖2所示，結(jié)果得到生物學(xué)進(jìn)程(biological process，BP)條目631條，主要包括細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物進(jìn)程；得到細(xì)胞組分(cell component，CC)條目22條，主要在細(xì)胞頂端、色素顆粒等處發(fā)揮作用；得到分子功能(molecular funtion，MF)條目77條，主要包括氧化還原酶活性、鐵離子結(jié)合等；得到信號(hào)通路87條，主要富集在鐵死亡、花生四烯酸代謝、VEGF、MAPK、mTOR等信號(hào)通路上。

圖2 84個(gè)鐵死亡差異靶點(diǎn)富集分析Fig.2 Enrichment analysis of 84 differential targets of ferroptosis

2.3 候選化合物及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP檢索84個(gè)差異靶點(diǎn)，有27個(gè)靶點(diǎn)可匹配到化合物，總共關(guān)聯(lián)到767個(gè)化合物，根據(jù)ADME參數(shù)和Lipinski規(guī)則共篩選出103個(gè)化合物，分別對應(yīng)13個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)，靶點(diǎn)信息詳見表1。故以這103個(gè)化合物作為候選化合物，其對應(yīng)的13個(gè)靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)，候選化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖如圖3所示，該網(wǎng)絡(luò)由118個(gè)節(jié)點(diǎn)、110條邊構(gòu)成，其中關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)最多的化合物有MOL000098(quercetin，槲皮素)、MOL004328(naringenin，柚皮素)、MOL001558(sesamin，芝麻素)、MOL013179(fisetin，漆黃素)，其度值分別為4、3、2、2。而關(guān)聯(lián)度值最高的靶點(diǎn)有NOS2、IL6、DRD4、NQO1、MAPK3。

圖3 候選化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Candidate compound-potential target network diagram

表1 鐵死亡干預(yù)肝癌的潛在作用靶點(diǎn)Tab.1 Potential targets of ferroptosis intervention for liver cancer

2.4 中藥匹配及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP收集候選化合物可關(guān)聯(lián)到的中藥，經(jīng)與《中華人民共和國藥典》《中國臨床藥物大辭典》匹配后，共獲得277味中藥，累計(jì)出現(xiàn)692次。為了進(jìn)一步分析潛在靶點(diǎn)、候選化合物和可關(guān)聯(lián)中藥的內(nèi)在聯(lián)系，故構(gòu)建三者的連線網(wǎng)絡(luò)，潛在靶點(diǎn)-候選化合物-可關(guān)聯(lián)中藥網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。該網(wǎng)絡(luò)由395個(gè)節(jié)點(diǎn)、867條邊構(gòu)成。對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，中藥關(guān)聯(lián)度值>7的有12味，通過候選化合物-潛在靶點(diǎn)的橋接作用顯示，中藥關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)>7的有11味，調(diào)節(jié)鐵死亡中藥的化合物和靶點(diǎn)數(shù)如圖5所示。提示這些中藥可能在鐵死亡干預(yù)肝癌中發(fā)揮重要作用，后續(xù)可作為中藥調(diào)節(jié)鐵死亡的研究依據(jù)。

圖4 潛在靶點(diǎn)-候選化合物-可關(guān)聯(lián)中藥網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Potential target-candidate compound-associable TCM network

圖5 調(diào)節(jié)鐵死亡中藥的化合物和靶點(diǎn)數(shù)Fig.5 Number of compounds and targets of TCM regulating ferroptosis

2.5 關(guān)聯(lián)中藥性味歸經(jīng)功效

將可關(guān)聯(lián)中藥數(shù)據(jù)導(dǎo)入中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行用藥規(guī)律分析，結(jié)果見表2和圖6?？梢钥闯?，中藥性味以寒性、溫性、苦味、辛味使用為主，歸經(jīng)方面以肝、肺、脾胃經(jīng)應(yīng)用最多，功效方面以清熱解毒藥、補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥運(yùn)用為主。

表2 調(diào)節(jié)鐵死亡中藥的性味歸經(jīng)Tab.2 Regulating the taste of TCM for ferroptosis

圖6 調(diào)節(jié)鐵死亡中藥的功效分布Fig.6 Efficacy distribution of TCM for regulating ferroptosis

2.6 分子對接驗(yàn)證

選取2.3節(jié)化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的主要化合物作為配體，分別為槲皮素、柚皮素、芝麻素、漆黃素，將13個(gè)潛在靶點(diǎn)作為蛋白受體，其中CAV1靶點(diǎn)未被PDB數(shù)據(jù)庫收錄，故予以剔除。一般認(rèn)為結(jié)合能小于-4.25 kcal/mol則配體與靶點(diǎn)受體之間有結(jié)合活性；結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol，表明匹配活性較佳；結(jié)合能小于-7.0 kcal/mol，提示具有強(qiáng)烈的對接活性[10]。分子對接熱圖如圖7所示，48組對接得分均小于-4.25 kcal/mol，最低得分為-5.9 kcal/mol(HSF1-槲皮素)，最高得分為-11.4 kcal/mol(AKR1C1-芝麻素)平均得分為-8.38 kcal/mol，表明篩選出的靶點(diǎn)與化合物間具有較好的匹配度，也從側(cè)面證明本次構(gòu)建的靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)具有一定的可靠性。選取部分對接結(jié)果進(jìn)行展示，見圖8。

圖7 調(diào)節(jié)鐵死亡的核心化合物-潛在靶點(diǎn)分子對接熱圖Fig.7 Heatmap of docking of core compound-potential target molecules regulating ferroptosis

(a) NOS2-槲皮素

(b) NQO1-柚皮素

(c) AKRIC1-芝麻素

(d) MAPK3-漆黃素

3 討論

程序性細(xì)胞死亡是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，靶向細(xì)胞死亡進(jìn)程中的節(jié)點(diǎn)是癌癥治療中的常見方法。鐵死亡作為一種新的程序性細(xì)胞死亡過程，具有獨(dú)特的死亡機(jī)制，在腫瘤治療中顯示出巨大的潛力。研究表明，在中藥里存在調(diào)節(jié)鐵死亡的活性成分，多味藥物進(jìn)行組方時(shí)，可能同時(shí)作用于多個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)，與傳統(tǒng)的鐵死亡誘導(dǎo)制劑相比，中藥具有療效可靠、安全性高、制備配伍合理等優(yōu)勢。

通過差異分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織和癌旁組織中，有84個(gè)鐵死亡靶點(diǎn)存在表達(dá)差異，其中有14個(gè)靶點(diǎn)差異最顯著(|logFC|>3)，部分靶點(diǎn)已被證實(shí)參與鐵代謝過程或腫瘤的調(diào)節(jié)。NQO1在細(xì)胞內(nèi)起到抗氧化作用，其表達(dá)水平受Nrf2信號(hào)通路調(diào)控[11]，研究發(fā)現(xiàn)NQO1在肝癌患者中處于高表達(dá)，且與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[12]。SLC7A11參與胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Xc-系統(tǒng)，通過介導(dǎo)胱氨酸攝取和谷氨酸釋放促進(jìn)谷胱甘肽合成，以抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，其在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，從而抑制鐵死亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[13-14]。HAMP是維持體內(nèi)鐵代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的鐵調(diào)素能與鐵外排蛋白(FPN)結(jié)合并溶解，從而減少鐵進(jìn)入外周循環(huán)，當(dāng)HAMP表達(dá)下調(diào)時(shí)可抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]。G6PD能維持谷胱甘肽的還原型以起到細(xì)胞的抗氧化損傷作用，其在體內(nèi)的激活或過表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生成、增殖及遷移[16-17]。通過文獻(xiàn)檢索證實(shí)，此研究得出的鐵死亡差異靶點(diǎn)具有可信性，其在鐵死亡及肝癌的發(fā)生發(fā)展中有一定的調(diào)控作用。

富集分析顯示，預(yù)測概率最高的通路為鐵死亡通路，再次佐證了次此分析差異靶點(diǎn)的可信性，此外還有VEGF、mTOR、HIF-1等信號(hào)通路。VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)在多數(shù)腫瘤患者中呈高表達(dá)，能促進(jìn)血管生成及腫瘤細(xì)胞的增殖，作為VEGF抑制劑的索拉非尼，近10年來一直是治療晚期肝癌的一線用藥[18]。mTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和蛋白質(zhì)合成中有著重要作用，mTOR信號(hào)傳導(dǎo)常在腫瘤環(huán)境中被過度激活，通過調(diào)節(jié)代謝過程為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)能抑制細(xì)胞自噬而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[19-20]，目前已有多種治療癌癥的mTOR抑制劑上市，治療肝癌的第一代mTOR抑制劑未能取得滿意療效，第二代mTOR抑制劑能夠同時(shí)抑制mTORC1/2而降低耐藥性，當(dāng)前更多有效的mTOR抑制劑正在開發(fā)中[21]。

構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，在調(diào)控鐵死亡干預(yù)肝癌的化合物中，槲皮素、柚皮素、芝麻素和漆黃素可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22-23]，研究發(fā)現(xiàn)以上4種化合物均能參與細(xì)胞氧化代謝過程。如槲皮素能夠在癌細(xì)胞中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子TFEB介導(dǎo)的溶酶體活化，進(jìn)而促進(jìn)鐵蛋白的降解，從而導(dǎo)致鐵死亡和細(xì)胞凋亡[24]，槲皮素可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并增加化療藥物的敏感性[25]。以上研究表明中藥具有調(diào)節(jié)鐵死亡的能力，此研究的4種化合物與鐵死亡機(jī)制相關(guān)聯(lián)，具備成為調(diào)節(jié)劑的藥物開發(fā)價(jià)值。

在靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)中，關(guān)聯(lián)度值最高的中藥有半枝蓮、甘草、黃芩、菊花、丹參等，而關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)數(shù)最高的中藥有菊花、麻黃、銀杏子、菟絲子等。半枝蓮、菊花均具有廣泛的抗腫瘤、抗炎等生物活性，在治療肝癌上有良好效果，且研究發(fā)現(xiàn)菊花能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[26-27]。中藥用藥規(guī)律分析顯示，調(diào)節(jié)鐵死亡治療肝癌的中藥以寒溫平、苦辛甘運(yùn)用為主。多用寒性藥能清熱解毒，而使用溫性藥一方面能制約寒藥攻邪太過，另一方面能起到溫運(yùn)痰濕、暖肝溫脾的功效；辛味力行氣血，散腹中積聚腫塊、載藥通達(dá)經(jīng)脈阻滯之處；苦味能瀉能燥，能清瀉濕熱、化解瘀毒；甘味能補(bǔ)，補(bǔ)益人體正氣、恢復(fù)臟腑功能。正如《素問·臟氣法時(shí)論》所述：“辛散，酸收，甘緩，苦堅(jiān)，咸軟……此五者，各有所利，或散或收，或緩或急，或堅(jiān)或軟”。這也與中醫(yī)對肝癌的病機(jī)認(rèn)識(shí)相符合，在《原發(fā)性肝癌中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》[28]中指出，本病總屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜，毒、瘀、虛是肝癌總的病機(jī)概括，其互為因果，惡性循環(huán)，貫穿肝癌全程。

中藥歸經(jīng)分析表明，以肝、肺、脾胃、腎經(jīng)藥物運(yùn)用為主。一方面，本病的病位在肝臟，以入肝經(jīng)藥物使用為主符合用藥規(guī)律；另一方面從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度看，肝臟具有生物轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)代謝的作用，氧化代謝是生物轉(zhuǎn)換的重要環(huán)節(jié)之一，肝臟也是轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白等血清蛋白的主要合成場所，同時(shí)肝臟也是鐵離子的主要儲(chǔ)備器官，以上幾點(diǎn)都與誘發(fā)鐵死亡的因素有關(guān)。雖然中西醫(yī)對于“肝”的定義不全相同，但從此研究結(jié)果來看，運(yùn)用入肝經(jīng)的中藥來調(diào)節(jié)鐵死亡干預(yù)肝癌，可能更易誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡而起到更好的治療效果。除肝經(jīng)外，肺經(jīng)藥物使用較多，肝主疏泄、調(diào)節(jié)及儲(chǔ)存血液，肺主宣發(fā)、肅降、朝百脈，肝肺氣機(jī)升降相宜，則全身氣血運(yùn)行調(diào)和。從中藥的功效運(yùn)用來看，以清熱解毒類、補(bǔ)虛類、活血化瘀類等為主，正如《醫(yī)林改錯(cuò)》言：“肚腹結(jié)塊者，必有形之血”，《醫(yī)宗必讀》指出：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，可以看出，調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞鐵死亡的中藥能夠補(bǔ)益人體正氣、祛癌毒邪氣、散氣血積滯。

綜上所述，本次研究以鐵死亡為切入點(diǎn)，系統(tǒng)分析了鐵死亡在肝癌中的作用機(jī)制，及使用中藥進(jìn)行干預(yù)的用藥規(guī)律。研究結(jié)果表明，中藥能夠有效調(diào)節(jié)鐵死亡干預(yù)肝癌進(jìn)展，且用藥規(guī)律符合當(dāng)代醫(yī)家對肝癌的病機(jī)認(rèn)識(shí)，希望能為中藥調(diào)節(jié)鐵死亡的后續(xù)研究提供新視角。同時(shí)本研究也存在一定的不足，如未考慮藥物的量效關(guān)系、臨床影響因素等。