宋發(fā)軍，呂昕芮，劉祖懿，楊瑞霜，王紅瑩，孟艷艷

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院&生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074）

七葉一枝花（Paris polyphyllavar.Chinensis）是百合科重樓屬（ParisL.）多年生草本植物，其根狀莖中所含的重樓皂苷是七葉一枝花最主要的藥用成分.重樓皂苷具有抗癌、止痛、解蛇毒等多重功效［1］.目前，重樓皂苷的獲取主要依賴于從藥源植物根狀莖中提?。?］，但重樓野生資源匱乏，重樓屬植物的種子自然萌發(fā)率低、休眠期長(zhǎng)，重樓皂苷的供需矛盾日益突出［3］.因此，解析及表征重樓皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，對(duì)實(shí)現(xiàn)人工合成重樓皂苷和保護(hù)野生重樓種質(zhì)資源具有重要意義.

目前研究將重樓皂苷合成途徑分為4個(gè)部分：第一部分與萜類皂苷合成途徑上游一致，主要經(jīng)過(guò)甲羥戊酸途徑或2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑［4］；第二部分主要生成具有甾體皂苷環(huán)狀骨架的環(huán)阿屯醇［5］；第三部分為甾體皂苷元生成過(guò)程中的多種結(jié)構(gòu)修飾［6-9］；最后部分是甾體皂苷元經(jīng)過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化，形成各類重樓皂苷，該步驟決定了重樓皂苷的生物學(xué)活性和功能.糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于不同植物中，其中與植物次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)的為尿嘧啶核苷二磷酸依賴型糖基轉(zhuǎn)移酶（UDPGlycosyltransferase，UGT）［10］.目前重樓皂苷合成途徑的第三、第四部分過(guò)程仍然未被解析清楚，重樓屬植物中有關(guān)UGTs的研究還很少.因此研究重樓中參與皂苷合成的多個(gè)UGTs有助于揭示重樓皂苷的合成機(jī)制.本研究在獲得可能參與重樓皂苷合成的2個(gè)候選UGTs基因（PpUGT01和PpUGT42）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用電子克隆、原核表達(dá)、體外酶促反應(yīng)等方法對(duì)其展開(kāi)深入研究，以期為篩選與重樓皂苷合成相關(guān)的UGTs及解析其作用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室前期保存的七葉一枝花根狀莖、莖、葉、花、果莢及種子的cDNA樣品.pET-28b（+）載體（武漢淼靈生物）；pATX-SUMO載體（武漢普健生物惠贈(zèng)）；pMD18-T載體（TaKaRa）；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒（OMEGA）；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞（昂羽生物）；Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶）；高保真Taq酶（北京聚合美生物）；DNA限制性內(nèi)切酶（Neb）；T4 DNA Ligase（Thermo）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 候選UGTs基因全長(zhǎng)的電子拼接

將NCBI網(wǎng)站上滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）的34個(gè)SRA數(shù)據(jù)庫(kù)與本實(shí)驗(yàn)前期得到的兩個(gè)候選UGTs基因（PpUGT01和PpUGT42）進(jìn)行本地Blast分析并拼接其全長(zhǎng).利用ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)ORF.

1.2.2 候選UGTs基因的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析兩個(gè)候選UGTs基因所編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，如氨基酸數(shù)量、分子量及等電點(diǎn)等.采用Blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)同源核酸序列.使用MEGA-X-10.0.5軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).

1.2.3 候選UGTs基因的克隆

以七葉一枝花cDNA為模板擴(kuò)增候選基因，引物設(shè)計(jì)選擇primer 5.0軟件（引物序列見(jiàn)表1），使用2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）進(jìn)行基因cDNA序列的擴(kuò)增.PCR程序?yàn)椋?5℃，3 min；94℃25 s，70℃25 s（每個(gè)循環(huán)降低1℃），72℃25 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min.擴(kuò)增結(jié)束后，取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)，回收目的片段并測(cè)序.本實(shí)驗(yàn)所有測(cè)序均由上海生工完成.

表1 基因擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primers for gene amplification

1.2.4PpUGT01和PpUGT42原核表達(dá)引物的設(shè)計(jì)

PpUGT01ORF序列的酶切位點(diǎn)不含NdeⅠ和SalⅠ位點(diǎn)，故在其引物的上游和下游分別引入NdeⅠ和SalⅠ位點(diǎn).PpUGT42的酶切位點(diǎn)分別為BamH I和XhoI.所用引物見(jiàn)表2.

表2 原核表達(dá)的引物序列Tab.2 Primers for prokaryotic expression

1.2.5PpUGT01的連接及轉(zhuǎn)化

反應(yīng)體系：1μLPpUGT01，2.5μL pET-28b（+），0.5μL T4 DNA Ligase，1μL 10×T4 Ligase buffer，ddH2O補(bǔ)齊至10μL.混合后于16℃培養(yǎng)4 h，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α（DE3）.提取質(zhì)粒，回收目的片段并測(cè)序.將測(cè)序正確的質(zhì)粒pET-28b（+）-PpUGT01和pET-28b（+）分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）和E.coliRosetta（DE3）.

1.2.6PpUGT42的連接及轉(zhuǎn)化

反應(yīng)體系：5μLPpUGT42，1μL線性化pATX-SUMO載體，4μL同源重組酶.混合后50℃培養(yǎng)45 min，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α（DE3）.菌液PCR鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序.將測(cè)序正確的質(zhì)粒pATX-SUMO-PpUGT42和pATX-SUMO分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）和E.coliRosetta（DE3）.

1.2.7PpUGT01和PpUGT42的原核表達(dá)

將轉(zhuǎn)有不同載體的E.coli菌株分別接種于含對(duì)應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng).吸取250μL培養(yǎng)液至對(duì)應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h.加入終濃度為1 mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG），于16℃150 r/min培養(yǎng)16 h；37℃，150 r/min培養(yǎng)4 h.冰浴，離心收菌.裂解菌體后通過(guò)SDS-PAGE電泳及Western blot檢測(cè)蛋白.

1.2.8 Western blot反應(yīng)

電泳：起始電壓為120 V，待跑到濃縮膠下面后調(diào)為200 V直至電泳完畢.轉(zhuǎn)膜：恒流200 mA，50 min.脫脂奶粉封閉1 h，洗膜.一抗孵育1 h，洗膜.二抗孵育1 h，洗膜.曝光顯色.

1.2.9 PpUGT42的體外酶促反應(yīng)

將轉(zhuǎn)化有pATX-SUMO-PpUGT42質(zhì)粒的E.coliBL21（DE3）在16℃條件下誘導(dǎo)16 h，收集菌體超聲破碎后獲得上清液.使用Bradford染色法測(cè)定蛋白濃度，隨后進(jìn)行蛋白催化反應(yīng)（表3）.酶促反應(yīng)的底物分別為薯蕷皂苷元及偏諾皂苷元，糖基供體包括尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose，UDP-Glc）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（Uridine diphosphate glucuronic acid，UDP-GIcA）和尿苷二磷酸半乳糖（Uridine diphosphate galactose，UDP-Gal）.

表3 蛋白催化反應(yīng)體系Tab.3 Protein catalyzed reaction system

2 結(jié)果與分析

2.1 七葉一枝花候選基因的擴(kuò)增

從本實(shí)驗(yàn)室已有的七葉一枝花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選得到的候選基因PpUGT01和PpUGT42的長(zhǎng)度分別為1161 bp和1026 bp.利用SRA數(shù)據(jù)庫(kù)拼接獲得了PpUGT01和PpUGT42兩個(gè)候選基因的全長(zhǎng)，其長(zhǎng)度分別為1485bp（GenBank：OL854108）和1446 bp（GenBank：OL854107）.使用特異性引物擴(kuò)增目的基因的全長(zhǎng)序列.電泳可見(jiàn)兩條序列均在1500 bp左右（圖1），且PpUGT01略大于PpUGT42，與SRA數(shù)據(jù)庫(kù)拼接得到的長(zhǎng)度基本一致，初步推斷擴(kuò)增得到目的基因.

圖1 PpUGT01和PpUGT42基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 cDNA amplification products of PpUGT01 and PpUGT42 genes

將PpUGT01和PpUGT42連接T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α.挑取單克隆菌落測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明：PpUGT01與PpUGT42的菌落擴(kuò)增目的片段與電子克隆片段相似度分別為97.86%和97.71%，且測(cè)序結(jié)果長(zhǎng)度一致，說(shuō)明擴(kuò)增得到目的基因.

2.2 PpUGT01和PpUGT42的生物信息學(xué)分析

根據(jù)ProtParam預(yù)測(cè)PpUGT01和PpUGT42的理化性質(zhì)（表4）.其中，PpUGT01的分子量為53836.69Da、不穩(wěn)定指數(shù)為34.22，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白；PpUGT42的分子量為53241.54 Da、不穩(wěn)定指數(shù)為47.38，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定.PpUGT01和PpUGT42的脂肪指數(shù)分別為90.22和90.15，表明PpUGT01和PpUGT42可能含有較多的脂肪族氨基酸.

表4 PpUGT01和PpUGT42的理化性質(zhì)Tab.4 Physical and chemical properties of PpUGT01 and PpUGT42

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上Blast比對(duì)結(jié)果，選取常見(jiàn)模式植物及部分與甾體生成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）.由圖2可知，PpUGT01和PpUGT42確定為糖基轉(zhuǎn)移酶基因.其中，PpUGT01與小果野蕉（XM009396029.2）、海棗（XM039134135.1）及幾內(nèi)亞薯蕷（XM039282497.1）的親緣關(guān)系較近，且與郭思遠(yuǎn)等［11］從滇重樓中獲得的PpUGT7（MT160184.1）具有一定的親緣關(guān)系（序列一致性為42.03%）；PpUGT42與吳長(zhǎng)橋等［12］從七葉一枝花中獲得的Pp-GT（MW208819.1）序列一致性最高（序列一致性為97.72%），暗示本研究所獲UGTs與上述物種基因序列的親緣關(guān)系較近；但PpUGT01、PpUGT42與常見(jiàn)模式植物擬南芥（KJ138869.1）、水稻（XM015773988.2）的基因及甾體類糖基轉(zhuǎn)移酶（steroid glycosyltransferase）基因具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系.此外，本研究所得的PpUGT01與PpUGT42兩條序列的一致性為45.33%，兩者在進(jìn)化樹(shù)中的分布也較遠(yuǎn)，說(shuō)明這兩條序列可能催化不同類型的糖基化反應(yīng).

圖2 PpUGT01和PpUGT42核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of PpUGT01 and PpUGT42 nucleotide sequences

2.3 PpUGT01和PpUGT42的原核表達(dá)分析

2.3.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建

（1）PpUGT01原核表達(dá)載體的構(gòu)建.

以PpUGT01的PCR純化產(chǎn)物為模版，利用表2中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，可見(jiàn)1～10號(hào)菌株均可擴(kuò)增出1500 bp左右的條帶，初步證明亞克隆載體構(gòu)建成功（圖3）.隨后，對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的菌株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，選擇測(cè)序結(jié)果正確的菌株提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物與pET-28b（+）的酶切片段連接并轉(zhuǎn)化，對(duì)重組質(zhì)粒再度雙酶切，分別獲得了約1500 bp的目的條帶和約5300 bp的載體條帶，表明PpUGT01表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖4）.

圖3 E.coli DH5α/pMD18-T-PpUGT01陽(yáng)性克隆的PCR篩選Fig.3 PCR screening of E.coli DH5α/pMD18-T-PpUGT01 positive clones

圖4 pET-28b-PpUGT01的雙酶切檢測(cè)Fig.4 Double enzyme digestion of pET-28b-PpUGT01

（2）PpUGT42原核表達(dá)載體的構(gòu)建.

以PpUGT42的PCR純化產(chǎn)物為模板，利用表2中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR結(jié)果顯示獲得的目的條帶在1000 bp至2000 bp之間（圖5），將目的條帶回收并進(jìn)行測(cè)序后初步推斷得到目的片段.

圖5 PpUGT42基因片段的擴(kuò)增Fig.5 Amplification of PpUGT42 gene fragment

回收得到PpUGT42基因與線性化pATX-SUMO載體進(jìn)行同源重組.重組體系轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，挑取單克隆菌落PCR鑒定（圖6）.由于菌落PCR檢測(cè)的是目的基因與長(zhǎng)度為321 bp的SUMO標(biāo)簽融合后的基因片段，可見(jiàn)1～8號(hào)菌株均擴(kuò)增出2000 bp左右的條帶，初步證明亞克隆載體構(gòu)建成功.隨后對(duì)能擴(kuò)增出目的條帶的菌株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與PpUGT42序列完全一致，可見(jiàn)pATX-SUMO-PpUGT42表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖6 pATX-SUMO-PpUGT42的菌落PCRFig.6 Colony PCR for pATX-SUMO-PpUGT42

2.3.2 原核表達(dá)分析

將表達(dá)載體pET-28b-PpUGT01和pATX-SUMOPpUGT42分別依次轉(zhuǎn)入E.coliBL21和E.coliRosetta，在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá).表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入載體pET-28b-PpUGT01的大腸桿菌所得的沉淀（precipitation，DPE）在50 kDa左右有條帶.預(yù)測(cè)的帶His-Tag的蛋白大小為56.13 kDa（圖7（a）），與電泳結(jié)果基本一致.但上清（supernatant，NPE）中不確定是否有目的蛋白；轉(zhuǎn)入載體pATX-SUMOPpUGT42的大腸桿菌所得的DPE在65 kDa有條帶，預(yù)測(cè)的帶His-Tag的蛋白大小為65.76 kDa（圖7（b）），與電泳結(jié)果基本一致，但在NPE中難以確定有無(wú)表達(dá)蛋白.

圖7 PpUGT01和PpUGT42的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE檢測(cè)Fig.7 E.coli induced expression and SDS-PAGE detection of PpUGT01 and PpUGT42

隨后進(jìn)一步利用Western印跡（含His-Tag抗體）檢測(cè)上述表達(dá)產(chǎn)物.結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入載體pET-28b-PpUGT01的E.coliRosetta在37℃的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)后，NPE中出現(xiàn)了目的條帶，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物有可溶性蛋白，但是可溶性蛋白的量比較少（圖8（a））；在16℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)后，NPE中除了有少量目標(biāo)蛋白存在外，在70 kDa左右還有一個(gè)非目標(biāo)條帶.此外，Western印跡檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)入載體pATX-SUMO-PpUGT42的E.coliBL21在16℃條件下誘導(dǎo)效果較好，NPE中能看到較為明顯的目的條帶（圖8（b）），說(shuō)明該基因的表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白，可為后續(xù)蛋白酶促反應(yīng)驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)提供材料.

圖8 PpUGT01和PpUGT42蛋白的Western印跡檢測(cè)Fig.8 Western blot analysis of PpUGT01 and PpUGT42 proteins

2.4 體外粗酶促反應(yīng)分析

以可溶性較好的PpUGT42為目標(biāo)蛋白，收集在16℃條件下誘導(dǎo)的E.coliBL21菌體，獲得其上清液進(jìn)行體外粗酶促反應(yīng).分別以薯蕷皂苷元/UDP-Glc、薯蕷皂苷元/UDP-GlcA、薯蕷皂苷元/UDP-Gal為底物和糖基供體時(shí)，PpUGT42粗酶液的酶促反應(yīng)結(jié)果與陰性對(duì)照的出峰情況一致，沒(méi)有出現(xiàn)新的峰（圖9）；以偏諾皂苷元為底物分別添加UDP-Glc、UDP-GlcA或UDP-Gal為糖基供體時(shí)，體外酶促催化反應(yīng)的結(jié)果也與陰性對(duì)照的出峰情況一致，也沒(méi)有檢測(cè)到新峰出現(xiàn)（圖10）.表明PpUGT42粗酶液在上述反應(yīng)條件下未能催化薯蕷皂苷元及偏諾皂苷元的糖基化反應(yīng).

圖9 PpUGT42蛋白粗酶促催化薯蕷皂苷元色譜圖Fig.9 Chromatogram of diosgenin catalyzed by PpUGT42 protein

圖10 PpUGT42蛋白粗酶促催化偏諾皂苷元色譜圖Fig.10 Chromatogram of pennogenin catalyzed by PpUGT42 protein

3 討論

研究獲得的兩個(gè)UGTs基因長(zhǎng)度均在1400 bp左右，這與已有研究中獲取的UGTs基因長(zhǎng)度基本一致［13］；也與郭思遠(yuǎn)和董栩等人的研究結(jié)果相一致［11，14］.郭思遠(yuǎn)從對(duì)滇重樓糖基轉(zhuǎn)移酶的研究中獲取了2個(gè)分別推測(cè)為甾體類糖基轉(zhuǎn)移酶和三萜類糖基轉(zhuǎn)移酶的UGTs并進(jìn)行了原核表達(dá)，均獲得可溶性目的蛋白［11］.董栩從滇重樓中提取并鑒定到1個(gè)GT，進(jìn)行原核表達(dá)后也獲得了可溶性表達(dá)蛋白［14］；上述研究中獲得的UGTs序列長(zhǎng)度與本研究中的蛋白長(zhǎng)度略有差異，這可能是由于選取的表達(dá)蛋白標(biāo)簽及載體不同所致.

生物信息學(xué)分析表明，本研究所選擇進(jìn)行原核表達(dá)的PpUGT01和PpUGT42均屬于UGTs家族中的D亞組蛋白［15］，該組的UGTs成員已被證實(shí)可參與各類皂苷合成［16］.原核表達(dá)分析結(jié)果顯示：PpUGT01蛋白在實(shí)際的表達(dá)中可溶性產(chǎn)物很少且有非目標(biāo)條帶出現(xiàn)，而PpUGT42的可溶蛋白量也不多，大多為包涵體形式，這可能與所表達(dá)蛋白的序列特性有關(guān)，也與表達(dá)載體及表達(dá)條件有關(guān).此外，PpUGT01和PpUGT42蛋白的Western印跡結(jié)果顯示E.coliRosetta菌株表達(dá)的可溶性蛋白量更多，推測(cè)E.coliRosetta更適用于該類蛋白的表達(dá)，因此將在后續(xù)的研究中改進(jìn)現(xiàn)有的表達(dá)載體及條件，以獲取更多可溶性蛋白.

根據(jù)原核表達(dá)的結(jié)果，選取PpUGT42蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，但結(jié)果顯示PpUGT42粗酶液未能催化薯蕷皂苷元及偏諾皂苷元的糖基化反應(yīng).這可能是由于PpUGT42的粗酶液未經(jīng)純化，其中雜蛋白含量較高，目的蛋白含量較少所致；也可能是由于現(xiàn)有的酶促反應(yīng)條件并非最佳，PpUGT42的活性不夠高；此外也可能是本實(shí)驗(yàn)所選擇的反應(yīng)底物和糖基供體不合適，從而未能檢測(cè)到其催化的產(chǎn)物.