趙海燕，黃婷婷，陸金玲，陳宇昕，王少兵

（中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074）

短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）是一類碳原子數(shù)小于6的羧酸類化合物［1］.直鏈的SCFAs是由食物中的膳食纖維、糖醇等在結(jié)腸內(nèi)被腸道微生物發(fā)酵而成的小分子代謝產(chǎn)物，其中乙酸、丙酸和丁酸在腸道內(nèi)的含量占總SCFAs含量的90%［2］.當(dāng)SCFAs在腸道內(nèi)產(chǎn)生后，除了通過(guò)糞便排泄外，還能迅速進(jìn)入全身循環(huán)系統(tǒng)，對(duì)調(diào)控機(jī)體正常生理功能起著非常重要的作用［1］.據(jù)報(bào)道，SCFAs中的丙酸和丁酸是重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，能與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，抑制組蛋白去乙酰化酶的活性［3］.SCFAs與糖尿?。?］、炎性腸病［5］、結(jié)腸癌［6］、阿爾茨海默癥［7-8］等有著密切的關(guān)聯(lián).因此，準(zhǔn)確、全面地測(cè)定SCFAs的含量，對(duì)于疾病的診斷與治療，有著非常重要的意義.

SCFAs結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但直鏈與支鏈的化合物極性相似，且不同碳原子數(shù)的酸在體內(nèi)的含量差異較大，因此要全面地測(cè)定各SCFAs的含量非常棘手.SCFAs揮發(fā)性強(qiáng)，多采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測(cè)定糞便中SCFAs的含量［9-11］.但SCFAs對(duì)熱不穩(wěn)定，在高溫條件下樣品損失多，采用GC法直接檢測(cè)樣品時(shí)，靈敏度不高.常采用五氟芐基溴、三甲基硅烷、氯甲酸芐酯等試劑，將SCFAs衍生化后，再用GC檢測(cè)，以提高檢測(cè)的靈敏度［12-14］.但是這些衍生化反應(yīng)或所需時(shí)間長(zhǎng)至2 h；或反應(yīng)條件苛刻，要求無(wú)水環(huán)境；或需要加入DMSO來(lái)進(jìn)行乳化，操作過(guò)程繁瑣，使GC-MS在應(yīng)用上受到很大的限制.近年來(lái)，LC-MS也常被應(yīng)用于SCFAs的含量測(cè)定.SCFAs含有羧基，可在負(fù)離子模式下，用LC-MS/MS檢測(cè)，但在電噴霧離子源下，離子化效率低，直接檢測(cè)的靈敏度不能滿足生物基質(zhì)中樣品檢測(cè)的需求［15］.因此，常用帶氨基的衍生化試劑衍生化后，在正離子模式下進(jìn)行檢測(cè).CHAN等［16］采用12C和13C標(biāo)記的苯胺衍生化方法與UPLC-MS/MS結(jié)合，測(cè)定了人糞便中12個(gè)SCFAs的含量.該衍生化方法在4℃下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，但需要反應(yīng)2 h并加入反應(yīng)終止劑.ZENG等［17］將待分析物與芐氧胺鹽酸鹽（O-BHA）在25℃下反應(yīng)1 h后，萃取衍生化產(chǎn)物，再用UPLC-MS檢測(cè)糞便中的12個(gè)SCFAs及酮體，操作過(guò)程略微繁瑣.LIEBISCH等［18］用3-NPH衍生化方法與液質(zhì)聯(lián)用建立了人糞便中的4個(gè)SCFAs含量檢測(cè)的方法.FU等［19］采用4-氨甲基喹啉衍生化方法成功地檢測(cè)了人糞便中的7個(gè)SCFAs.上述衍生化方法反應(yīng)條件易控制，操作方便，檢測(cè)靈敏度較GC-MS法要高出近百倍，檢測(cè)限可達(dá)到ng甚至pg級(jí)別，但檢測(cè)對(duì)象均不包括2-甲基戊酸及3-甲基戊酸.此外，同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，可以減少質(zhì)譜中共流出物的干擾，近年來(lái)，此法也廣泛應(yīng)用于SCFAs這種結(jié)構(gòu)差異小的化合物的檢測(cè)［20］.

研究表明：SCFAs除了廣泛分布于糞便及腸內(nèi)容物中，還存在于血液、臟器組織等.以往的研究多集中于分析結(jié)腸或糞便中的SCFAs的含量，較少關(guān)注血漿中SCFAs的水平.由于SCFAs在血漿中的含量遠(yuǎn)低于糞便，故對(duì)分析方法有更高的要求.而從C2到C6，包括所有直鏈與支鏈異構(gòu)體的11種化合物同時(shí)檢測(cè)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究建立了一種基于3-NPH衍生化方法結(jié)合UPLC-MS/MS法，采用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物，檢測(cè)人體血漿中短鏈脂肪酸的含量，將11種SCFAs基本實(shí)現(xiàn)基線分離，準(zhǔn)確測(cè)定出血漿中的SCFAs的含量，為臨床上某些代謝性疾病的診斷與治療提供了有力的支持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀（Waters Acquity UPLC system）；質(zhì)譜儀（Xevo TQ MS，美國(guó)Waters）；超聲波清洗器（PS-80，深圳市深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司）；電子天平（CP214，上海奧豪斯儀器）；液氮（99.999%，武漢分析儀器）.

正常人體血漿（上海冠東生物科技）；色譜純甲醇、乙腈、吡啶、甲酸（武漢弗頓試劑）；3-硝基苯肼（3-NPH）、N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），乙酸（C2）、丙酸（C3）、異丁酸（Iso-C4）、丁酸（C4）、2-甲基丁酸（2Me_C4）、異戊酸（3Me_C4）、戊酸（C5）、2-甲基戊酸（2Me_C5）、3-甲基戊酸（3Me_C5）、4-甲基戊酸（4Me_C5）、己酸（C6），同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物包括乙酸-d3（C2-2，2，2，-d3）、丙酸-d5（C3-d5）、丁酸-d7（C4-d7）、戊酸（C5-d9）、己酸（C6-d11），均購(gòu)自于美國(guó)Sigma-Aldrich公司.

1.2 色譜條件

色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm I.D.，1.7μm），柱溫40℃，樣品室溫度為10℃，進(jìn)樣量5μL.流動(dòng)相A為超純水，B相為乙腈-甲醇（V（乙腈）∶V（甲醇）=2∶1），按照表1進(jìn)行梯度洗脫.

表1 液相檢測(cè)梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions for UPLC

質(zhì)譜檢測(cè)采用ESI電噴霧離子源，以正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式檢測(cè)，具體質(zhì)譜參數(shù)為：離子噴霧電壓5500 V，離子源溫度550℃，去簇電壓（DP）60 V，入口電勢(shì)（EP）10 V，碰撞室出口電壓（EP）10 V.

1.3 樣品的制備

1.3.1 對(duì)照品貯備液的配制

精密稱取SCFAs對(duì)照品各10.0 mg，置于2 mL容量瓶中，用水稀釋定容配制成濃度為5.0 mg·mL-1的貯備液.精密稱取同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品13C2-d3、C3-d5、C4-d7、C5-d9、C6-d11各10.0 mg，分別置于2 mL容量瓶中，用水稀釋定容，即得濃度為5.0 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)貯備液，于-20℃下保存.

1.3.2 線性工作溶液的配制

內(nèi)標(biāo)物混合液：適量量取5種內(nèi)標(biāo)物貯備液，混合，用甲醇稀釋定容至13C2-d3為20μg·mL-1，其他4種內(nèi)標(biāo)物為2μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)物混合液，于4℃下保存.

標(biāo)準(zhǔn)品混合液：量取適量11種標(biāo)準(zhǔn)品的貯備液，混合，用甲醇序列稀釋得到9個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合液，其中乙酸的濃度分別為50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000 ng·mL-1，其余10種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1.

1.4 血漿樣品的制備

精密吸取60μL的血漿于1.5 mL的離心管中，并加入12μL內(nèi)標(biāo)物混合液和288μL甲醇，渦旋混合1 min后，于4℃下，13000 r·min-1離心10 min；吸取270μL上清液，依次加入50μL 200 mmol·L-1的3-NPH，12μL含0.6%吡啶溶液的1 mol·L-1的EDC，最后加入甲醇直至體系總體積為400μL，于40℃下孵育30 min，迅速取出，供色譜分析.

1.5 色譜方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 線性和范圍

標(biāo)準(zhǔn)溶液的校準(zhǔn)曲線：取45μL標(biāo)準(zhǔn)品混合液，加45μL純水稀釋，加180μL甲醇、9μL內(nèi)標(biāo)物混合液，按照“1.4”項(xiàng)下加入NPH和EDC-吡啶溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)，供LC-MS/MS分析.

血漿加標(biāo)溶液的校準(zhǔn)曲線：取60μL血漿，加入等體積的標(biāo)準(zhǔn)品混合液、12μL內(nèi)標(biāo)混合液及228μL甲醇，按照“1.4”項(xiàng)同法操作，進(jìn)行LC-MS/MS分析.

以色譜峰峰面積（分析物/內(nèi)標(biāo)物）的比值為y軸變量，藥物濃度作為x軸變量，進(jìn)行線性分析，通過(guò)加權(quán)（1/x2）最小二乘法擬合校準(zhǔn)曲線，定量下限（LLOQ）在信噪比為10的條件下獲得.

1.5.2 精密度

分別精密吸取5μL的低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.2”項(xiàng)下液質(zhì)條件測(cè)定SCFAs的含量，分析3次，計(jì)算RSD值，考察儀器的精密度.

1.5.3 基質(zhì)效應(yīng)與回收率

取適量的血漿樣品，以甲醇沉淀蛋白，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，對(duì)樣品進(jìn)行衍生化反應(yīng)，測(cè)得的峰面積記為Aafter.取血漿樣品，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，甲醇沉淀蛋白后，按上述方法進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)，測(cè)得樣品的峰面積記為Abefore，提取回收率即為（Abefore/Aafter）×100%.

在純?nèi)軇┲屑尤敫鳂?biāo)準(zhǔn)品溶液，按溶液中標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品的制備方法操作，測(cè)得的衍生化產(chǎn)物的峰面積記為A溶液.基質(zhì)效應(yīng)即為（Aafter/A溶液）×100%.

1.5.4 穩(wěn)定性

將含血漿基質(zhì)的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照“1.4”項(xiàng)下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，于48 h內(nèi)多次進(jìn)樣分析，考察樣品的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

該反應(yīng)選擇多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM），通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)正離子模式下檢測(cè)的離子強(qiáng)度是負(fù)離子模式下的10倍，因此選擇正離子模式監(jiān)測(cè).優(yōu)化后的各參數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2.在色譜分離方面，嘗試了甲醇-水、乙腈-水兩種混合溶劑系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以乙腈為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰尖而窄，但2Me_C5與3Me_C5基本重疊；以甲醇為流動(dòng)相時(shí)，11個(gè)SCFAs都能分離開(kāi)，但色譜峰矮而寬.隨后，以甲醇與乙腈混合溶液作為有機(jī)相，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈和甲醇體積比為2∶1時(shí)，得到峰形尖銳且對(duì)稱、分離度較好的色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 SCFAs檢測(cè)的UPLC-MS色譜圖Fig.1 UPLC-MS chromatograms for derivatives of SCFAs

表2 SCFAs衍生化產(chǎn)物的優(yōu)化MRM檢測(cè)條件Tab.2 Optimum MRM detection conditions for derivatives of SCFAs

2.2 衍生化條件的優(yōu)化

首先，考察了3-NPH的濃度與EDC在反應(yīng)體系的終濃度對(duì)衍生化產(chǎn)物的峰面積的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3.由圖2（a）可知：當(dāng)EDC的濃度固定不變，3-NPH的終濃度由2.5 mmol·L-1增至25 mmol·L-1時(shí)，衍生化產(chǎn)物的峰面積顯著增加；當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，產(chǎn)物的峰面積不再增加，因此3-NPH的濃度確定為25 mmol·L-1.由圖3可知：當(dāng)EDC濃度不變，增加3-NPH的濃度時(shí)，產(chǎn)物峰面積反而略微下降，說(shuō)明增加3-NPH的濃度并不利于反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)3-NPH的濃度不變，EDC的濃度從15 mmol·L-1增至25 mmol·L-1時(shí)，各產(chǎn)物的峰面積明顯增大；EDC的濃度繼續(xù)增大至30 mmol·L-1時(shí)，C5及C6的峰面積顯著增加，而對(duì)其他SCFAs并未有明顯變化.綜合考慮，確定衍生化試劑3-NPH的終濃度為25 mmol·L-1，EDC的終濃度為30 mmol·L-1.

圖3 3-NPH和EDC濃度對(duì)SCFAs的衍生化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of concentration of 3-NPH and EDC on the derivatization reaction of SCFAs

然后，考察了EDC中吡啶的含量、反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生化產(chǎn)物峰面積的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2（b）可知：將吡啶加入反應(yīng)體系后，得到的產(chǎn)物峰面積至少增大3倍，但繼續(xù)增大吡啶的比例，產(chǎn)物的峰面積不再增加.考慮到血漿中基質(zhì)復(fù)雜，結(jié)合文獻(xiàn)綜合考慮，選擇6%作為吡啶的比例.由圖2（c）可知：隨溫度的升高，衍生化產(chǎn)物的峰面積先是迅速增加，再逐漸緩慢上升，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，峰面積無(wú)明顯增加，因此，反應(yīng)溫度定在40℃.由圖2（d）可知：當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)20 min后，產(chǎn)物的峰面積增加緩慢，故將反應(yīng)時(shí)間定在30 min.

圖2 反應(yīng)條件對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物峰面積的影響Fig.2 Effect of reaction conditions on the the peak areas of derivatives

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性和定量下限

由于正常人體體內(nèi)也存在痕量的SCFAs，難以獲得完全不含SCFAs的空白血漿，本文分別制備了在溶液中及在血漿中進(jìn)行反應(yīng)的線性曲線，以SCFAs的濃度為橫坐標(biāo)，SCFAs峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，采用1/x2進(jìn)行加權(quán)回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4.在溶液中反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線與在血漿中反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率基本一樣，因此可以將血漿中測(cè)得的分析物的峰面積代入在溶液中進(jìn)行反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中來(lái)求得在血漿中的分析物的濃度.

表3 在溶液中反應(yīng)的SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.3 Linearity and range of SCFAs in solution

表4 在血漿中反應(yīng)的SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.4 Linearity and range of SCFAs in plasma

2.3.2 精密度和準(zhǔn)確度

采用低、中、高3個(gè)濃度分析評(píng)價(jià)各質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品溶液在血漿中的穩(wěn)定性，按精密度試驗(yàn)方法操作，分別測(cè)定各SCFAs的峰面積的RSD值，結(jié)果見(jiàn)表5.表5中RSD均小于15%，表明該方法的精密度良好.

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率的結(jié)果見(jiàn)表5，表5中基質(zhì)效應(yīng)在90%～115%之間，樣品的平均回收率均在80%～120%之間，符合生物樣品分析的要求.

表5 精密度、基質(zhì)效應(yīng)、回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）Tab.5 Results of precision，matrix effect and recovery test（n=3）

2.3.4 穩(wěn)定性

取同一血漿樣品，制備供試品溶液，考察3-NPH衍生的SCFAs在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品托盤(pán)中放置48 h內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖4，結(jié)果表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

圖4 SCFAs衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性結(jié)果Fig.4 Stabilities results of SCFAs derivatives

2.4 血漿的定量

正常血漿中SCFAs的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6.表6中除了3Me_C5無(wú)法檢測(cè)出來(lái)外，另外10種SCFAs均能被檢測(cè)出來(lái)，其中乙酸、丙酸及支鏈丁酸的含量高于其他SCFAs的含量，戊酸與己酸的含量較其余SCFAs的含量明顯較低.

表6 正常血漿中SCFAs的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.6 Determination of SCFAs in healthy human plasma（n=3）

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了基于3-NPH衍生化反應(yīng)的UPLCMS/MS法以測(cè)定人體血漿中11種SCFAs的含量.建立的衍生化方法，反應(yīng)條件溫和易控制，反應(yīng)時(shí)間適中.色譜方法學(xué)考察結(jié)果證明：該方法能在11 min內(nèi)快速分離11種SCFAs，除3Me_C5無(wú)法檢測(cè)外，每個(gè)峰都基本實(shí)現(xiàn)基線分離，各SCFAs回收率為80%～122%，日內(nèi)、日間精密度＜15%，SCFAs的峰面積與濃度有良好的線性關(guān)系（r＞0.99）.血漿樣品在衍生化反應(yīng)后可直接分析，不需要進(jìn)行液液萃取、氮吹、復(fù)溶等步驟，該法操作簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于正常及病理血漿中SCFAs含量的測(cè)定，為臨床多種疾病的診斷治療提供依據(jù).